BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNN
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
ðÀO THỊ HUỆ
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ðẶC TÍNH SINH HỌC PHÂN
TỬ CỦA VIRUS CARE (CANINE DISTEMPER) PHÂN
LẬP TỪ CHÓ NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÀ NỘI – 2014
HÀ NỘI – 2014
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page i
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn
này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn
này đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ
nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Tác giả luận văn ðào Thị Huệ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page ii
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian học tập và rèn luyện tại Học viện Nông Nghiệp Việt
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục tiêu của đề tài 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Lịch sử và tình hình nghiên cứu 4
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới 4
2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước 5
2.2. Căn bệnh học 6
2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care 6
2.2.2. Hình thái của virus Care 7
2.2.3. Cấu trúc của virus Care 7
2.2.4. Sức đề kháng của virus Care 8
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh 9
2.3. Dịch tễ học 11
2.3.1. Loài vật mắc bệnh 11
2.3.2. Lứa tuổi mắc bệnh 11
2.3.3. Mùa vụ thường xảy ra bệnh 11
2.4. Truyền nhiễm học 12
2.4.1. Chất chứa virus 12
2.4.2. Đường xâm nhập và phương thức lây lan 12
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page iv
2.4.3. Tỷ lệ ốm, tỷ lệ chết 12
2.5. Triệu chứng bệnh tích 13
2.5.1. Triệu chứng lâm sàng 13
2.5.2. Bệnh tích 15
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61
5.1. Kết luận 61
5.2. Đề nghị 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO 62
I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 62
II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 62
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Mẫu chó nghi mắc Care thu thập được 37
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bằng phương pháp RT-PCR các chó nghi mắc
bệnh Care 42
Bảng 4.3. Kết quả phân lập virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST 43
Bảng 4.4. Hồ sơ chủng virus Care được lựa chọn nghiên cứu 45
Bảng 4.5. Sự tương đồng về nucleotide và axit amin của đoạn gen H giữa các
chủng virus Care nghiên cứu (%) 58
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Mô hình cấu trúc của virus Care 7
Hình 4.1. Chó nghi mắc bệnh Care có biểu hiện mệt mỏi, ủ rủ 38
Hình 4.2. Chó nghi mắc bệnh Care có nhiều rử mắt 38
Hình 4.3.Chó tiêu chảy phân màu cafe 38
Hình 4.4. Xuất hiện nốt sài ở vùng da mỏng 38
Hình 4.5. Xoang ngực tích nước 41
Hình 4.6. Dạ dày, ruột chứa đầy hơi 41
EDTA : Ethylenediamine Tetra Acetat Acid
MV : Meales Virus
PBS : Dung dịch muối đệm Phot phat
PPRV : Peste des Petits Ruminants Virus
FBS : Foetal Bovine Serum
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic acid
RT-PCR : Reverse Transcription Polymesase Chain Reaction
SLS : Sample loading solution
TBE : Tris Borate EDTA
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 1
1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Bệnh Care hay còn gọi là bệnh sài sốt chó là một bệnh truyền nhiễm cấp
tính nguy hiểm của loài chó, do virus Care (Canine Distemper Virus–CDV) gây
ra. Virus Care ở chó được phát hiện từ thế kỷ XVIII, được tìm thấy ở Peru
thuộc Châu Á, bệnh phân bố khắp thế giới. Năm 1905, căn bệnh được bác sĩ thú
y người Pháp tên là Henri Carré phân lập được từ nước mũi của chó bệnh lọc
qua giấy lọc vi khuẩn sau đó gây bệnh thực nghiệm cho chó. Vì vậy, bệnh này
được gọi là bệnh Care (theo tên nhà khoa học) (David T. Swith, 1979).
Bệnh Care xảy ra ở khắp nơi trên thế giới, không những ở chó nuôi
mà còn ở nhiều quần thể động vật hoang dã. Người ta cho rằng những chó mắc
bệnh Care mà không có biểu hiện triệu chứng rõ ràng là mối đe dọa nghiêm
trọng cho việc bảo tồn nhiều loài thú ăn thịt và thú có túi. Thống kê các nghiên
cứu cho thấy, bệnh Care góp phần quan trọng vào sự tuyệt chủng của chồn chân
đen, hổ Tasmania và là nguyên nhân gây tử vong định kỳ của chó hoang dã châu
bào đích, có nhiệm vụ là kênh protein màng tế bào và cũng có thể giữ vai trò
là protein kháng nguyên màng của virus (Bolt et al., 1997). Thêm vào đó,
nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng H protein là một trong những protein dễ
biến đổi nhất của virus vì vậy mà người ta thường sử dụng đoạn gen này để
đánh giá những biến đổi di truyền giữa các chủng virus Care (Hashimoto et
al, 2001; Lednicky et al, 2004). Đoạn gen H chứa một khung đọc mở mã hóa
cho khoảng 607 axit amin (Hyoko Hirama et al., 2004). Do đó việc nghiên
cứu đặc tính sinh học phân tử của các chủng virus Care dựa trên trình tự
nucleotide của đoạn gen H là cần thiết để hiểu về mối quan hệ di truyền giữa
các chủng virus nghiên cứu. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành nghiên
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 3
cứu đề tài: “Nghiên cứu một số ñặc tính sinh học phân tử của virus Care
(Canine distemper) phân lập từ chó nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận”
1.2. Mục tiêu của ñề tài
Làm rõ một số đặc tính sinh học phân tử chủ yếu, sự tương đồng về trình
tự nucleotide, axit amin và mối quan hệ di truyền của virus Care phân lập từ chó
nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 4
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử và tình hình nghiên cứu
2.1.1. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trên thế giới
Bệnh Care hay bệnh sài sốt chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm
thường xảy ra ở chó non, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Đây là một căn bệnh
hoang dã châu Phi (Assessment, 2005). Năm 1991, bệnh xảy ra trên quần thể sư
tử Serengeti ở Tanzania làm giảm 20% số lượng toàn đàn (Timothy và cs, 2009).
2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Care trong nước
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ năm 1920. Cho đến nay, bệnh xảy ra
ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị
Tài, 2006). Ở nước ta, bệnh Care cũng được nhiều nhà thú y quan tâm. Các
nghiên cứu của họ nhận thấy chó mắc bệnh Care sẽ xuất hiện các triệu chứng
đặc trưng: sốt, viêm phổi, viêm ruột và các nốt sài ở vùng da mỏng. Cuối thời kỳ
của bệnh thường có triệu chứng thần kinh. Sự kế phát của vi khuẩn ký sinh sẵn
có ở đường tiêu hóa, hô hấp thường làm cho bệnh trầm trọng thêm. Bệnh thường
thể hiện ở hai dạng: viêm phổi và viêm ruột. Khi mắc bệnh Care con vật có biểu
hiện sốt rất cao trên 40
0
C. Tất cả các giống và lứa tuổi đều mẫn cảm với bệnh
Care tuy nhiên giống chó ngoại và chó non thì mẫn cảm hơn…( Tô Du và Xuân
Giao, 2006). Nguyễn Thị Lan và cs đã nghiên cứu thành công đặc tính sinh trưởng
cụ thể của một số chủng CDV trên dòng tế bào Vero có gắn receptor tương ứng với
virus Care (Vero-DogSLAMtag hay Vero-DST). Qua đó tác giả cũng chỉ ra tế bào
Vero-DST là dòng tế bào thích hợp có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá
virus (Lan et al., 2005).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 6
Như vậy các công trình nghiên cứu ở nước ta mới cho thấy cái nhìn tổng
quát về bệnh, còn những nghiên cứu về gen và trình tự đoạn gen của virus Care
gây bệnh trên chó rất ít.
2.2. Căn bệnh học
2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care
Canine Distemper Virus là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc
họ Paramixoviridae. Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây
Hình 2.1. Mô hình cấu trúc của virus Care
2.2.3. Cấu trúc của virus Care
Nucleocapside chứa một sợi đơn RNA không phân đoạn gồm khoảng
15.690 nucleotide mã hóa cho 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein cấu
trúc gồm: large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P),
nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M) (Diallo,
1990).
Protein không cấu trúc (C) được mã hóa từ một khung đọc mở khác ở gen
P (Lamb and Kolakofsky, 2001). Chức năng của protein C chưa được xác định
rõ ràng.
N: Nucleocapsid, khối lượng phân tử 58 kDa bao quanh và bảo vệ cho hệ
gen của virus. Protein này rất nhạy cảm với những chất phân giải protein.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 8
P: Phosphoprotein, khối lượng phân tử 54,9 - 66 kDa, nhạy cảm với những
yếu tố phân giải protein, đóng vai trò quan trọng trong sự sao chép của RNA (Sidhu
et al, 1993).
M: Matrix, khối lượng phân tử 34 - 39 kDa, đóng vai trò quan trọng trong sự
trưởng thành của virus và nối nucleocapsid với những protein vỏ bọc.
F: Fusion là glycoprotein trên bề mặt của vỏ bọc, khối lượng phân tử 59 –
62 kDa, đóng vai trò trong sự kết hợp virus với thụ thể màng tế bào, dẫn đến kết
hợp nhiều tế bào cảm nhiễm (hợp bào).
H: Protein ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin) hay yếu tố kết dính, là
glycoprotein thứ hai của vỏ bọc, khối lượng phân tử 76 – 80 kDa, đóng vai trò
gắn virus vào tế bào đích. Ở virus Care, protein này không hấp phụ hồng cầu
cũng không ngưng kết hồng cầu.
L: Large protein có khối lượng phân tử lớn 180 - 200 kDa, do có kích
thước lớn, nó thể hiện phần lớn các hoạt động của RNA polymerase (Diallo,
1990).
Vỏ bọc của virus rất mẫn cảm với ete, chloroform, fomalin loãng (<0.5%),
phenol (75%). Do vậy, khi dùng những chất này để tiêu độc chuồng nuôi mang
lại hiệu quả cao.
2.2.5. Cơ chế sinh bệnh
Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho niêm mạc và
mô thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp. Sau đó virus
nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus tác động đến
nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo máu vào hệ
hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây
thần kinh thị giác. Virus tấn công vào hệ bạch huyết (hệ thống phòng vệ quan
trongjcuar cơ thể) đã làm suy giảm khả năng miễn dịch của cơ thể, tạo điều kiện
cho các vi khuẩn như: Staphylococcus, Bronchisepticum, Salmonella, gây
bệnh. Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các
nhiễm trùng nặng trong phủ tạng.
Theo Carter và cs, 1992, trong quá trình phơi nhiễm tự nhiên, CDV lây lan
qua đường khí dung vào biểu mô đường hô hấp trên. Trong 24 giờ nó sẽ nhân
lên trong đại thực bào và lan rộng ra nhờ hệ lympho cục bộ đến hạch amidal và
các hạch lympho phế quản. Sau 2 - 4 ngày số lượng virus tăng ở hạch amidal và
hạch sau hầu, hạch lympho khí quản. Nhưng chỉ có một số ít tế bào đơn nhân bị
nhiễm CDV. Sau 4 - 6 ngày virus nhân lên trong tế bào lympho ở lách, biểu mô
dạ dày và ruột non, màng treo ruột và trong tế bào Kuffer ở gan. Sự lây lan của
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 10
virus trong các hệ lympho là nguyên nhân gây pha sốt đầu tiên và virus đã phá
huỷ các tế bào lympho (lympho B, lympho T) dẫn tới chứng giảm bạch cầu.
Ngày thứ 8 và 9 sau khi nhiễm, virus theo máu tới thần kinh trung ương,
chó có biểu hiện thần kinh hay không, phụ thuộc vào miễn dịch dịch thể và miễn
dịch tế bào. Quá trình bài thải ra ngoài bắt đầu khi virus có mặt ở biểu mô và
thông qua chất bài tiết của cơ thể thậm chí khi chó chỉ mắc bệnh nhẹ.
gây bệnh ở động vật hoang dã ăn thịt (Appel và cs, 1995; Frolich và cs, 2000;
Martella và cs, 2002). Năm 1987, người ta phát hiện virus Care ở hải cẩu
(Phocasibirica) ở hồ Baikal Sibero những chủng này lần lượt được đặt tên PDV1
và PDV2 (Phocin Distemper virus). Năm 2006, người ta thấy bệnh Care trên khỉ
nâu châu Âu nuôi trong trại Quảng Đông Trung Quốc. Qua phân tích trình tự axit
amin của virus tại thực địa cho thấy đây là chủng virus cường độc (Wei Qiu và cs,
2011)
Trong phòng thí nghiệm, có thể gây bệnh cho chó con và chồn. Ngoài ra,
có thể dùng chuột lang, thỏ, chuột nhắt trắng, khỉ để gây nhiễm.
2.3.2. Lứa tuổi mắc bệnh
Trong tự nhiên, hầu hết bệnh xảy ra ở chó từ 2 đến 12 tháng tuổi, nhiều
nhất là chó từ 3 đến 6 tháng tuổi. Nhiều nghiên cứu cho thấy, chó 6 tháng tuổi
dễ mắc bệnh Care hơn chó 3 tháng tuổi có thể là do chó 3 tháng tuổi vẫn còn
miễn dịch thụ động nhận được từ chó mẹ qua sữa đầu (Hồ Đình Chúc và cs,
1993; Simpson và cs, 1994). Người ta cũng đã ghi nhận virus Care gây bệnh với
biểu hiện viêm não trên chó lớn tuổi theo nghiên cứu của Merchant và cs trong
giai đoạn 1961 – 1969.
2.3.3. Mùa vụ thường xảy ra bệnh
Tô Du và Xuân Giao (2006), khi nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Care cho
rằng tất cả các loài chó đều cảm thụ bệnh, nhưng mẫn cảm hơn là chó lai, chó
cảnh, chó nội ít mẫn cảm hơn. Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 12
có sự thay đổi thời tiết đặc biệt là những ngày mưa, độ ẩm cao. Ở Việt Nam, bệnh
thường xảy ra vào thời điểm giao mùa, từ xuân sang hè.
2.4. Truyền nhiễm học
2.4.1. Chất chứa virus
Trong cơ thể chó mắc bệnh Care, virus thường có trong máu, phủ tạng,
các chất bài tiết, đặc biệt nước tiểu thường xuyên có virus. Các cơ quan tập
nuôi dưỡng và độc lực của mầm bệnh.
Sốt thường xảy ra từ 3 đến 6 ngày sau khi chó nhiễm virus Care. Thời kỳ
nung bệnh cho tới khi bắt đầu xuất hiện các triệu chứng lâm sàng của bệnh Care
cấp tính thường từ 14 đến 18 ngày. Sau khi nhiễm bệnh, một cơn sốt ngắn xảy
ra từ ngày thứ 4 tới ngày thứ 7 nhưng không có triệu chứng rõ rệt của bệnh Care.
Thân nhiệt trở lại bình thường sau đó từ ngày 7 đến ngày 14, sau đó thân nhiệt
lại tăng cao kèm theo viêm kết mạc và viêm mũi. Tiếp theo là ho, ỉa chảy, nôn
mửa, biếng ăn, mất nước và giảm cân với sự suy nhược thường quan sát thấy ở
chó mắc bệnh Care cấp tính. Dịch mũi và nước mắt chảy ra có mủ nhày. Viêm
phổi thường do bội nhiễm vi khuẩn. Da bị phát ban có thể viêm mủ ở vùng da
bụng. Triệu chứng viêm não cấp tính có thể có những biểu hiện khác nhau: sự co
thắt cơ vân theo nhịp (Myolonus), cơ vân bị vặn không theo ý muốn, thể hiện
như dạng nhai kẹo cao su, vận động không điều hòa và không phối hợp với
nhau. Phản ứng sợ hãi và mù là những triệu chứng thường thấy trong bệnh Care
cấp tính.
Theo Nguyễn Văn Thanh (2007), chó mắc bệnh Care đầu tiên xuất hiện các
triệu chứng như: mệt mỏi, ủ rũ, ăn ít, không thích vận động, chảy nước mắt,
nước mũi, nôn mửa; sau đó sốt, nhịp thở tăng, thân nhiệt lên đến 40 – 41,5
0
C
kéo dài từ 24 – 26 giở rồi thân nhiệt giảm xuống 38,5 - 39,5
0
C. Lúc này chó ăn
ít, mệt mỏi. 3 - 4 ngày sau xuất hiện cơn sốt thứ hai. Đó là do sự bội nhiễm của
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp
Page 14
các vi khuẩn kế phát. Cơn sốt kéo dài 3 - 4 ngày. Lúc này chó bắt đầu thể hiện
các triệu chứng ở đường hô hấp, tiêu hoá, da và thần kinh.
- Triệu chứng ở đường tiêu hoá:
xuống, đâm sầm vào tường, sùi bọt mép. Cuối cùng chó nằm bệt, loạn nhịp tim,
thân nhiệt hạ và chết. Tỷ lệ chết có thể tới 60%, bệnh kéo dài 2- 5 tuần. Những
con lành bệnh thường có di chứng gầy còm, đi xiêu vẹo, mù và điếc…
2.5.2. Bệnh tích
Theo Appel và Summer (1995), bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng
hoá da ở mõm và gan bàn chân. Tuỳ theo mức độ kế phát các loại vi khuẩn mà
có thể thấy viêm phế quản phổi, viêm ruột hay mụn mủ ở da
Bệnh tích đường tiêu hóa: viêm cata niêm mạc ruột, loét ruột, đám hạch
lympho màng treo ruột sưng, gan thoái hóa mỡ.
Đường hô hấp: viêm niêm mạc mũi, thanh quản, khí quản, viêm phổi, có
mụn mủ trong phổi, có khi mụn vỡ ra gây viêm phế mạc.
Thần kinh: viêm não, não tụ máu, các tế bào thần kinh bị hoại tử.
Tế bào thượng bì đường hô hấp, tiết niệu, lưỡi, mắt, hạch và tuyến nước bọt
có thể tìm thấy tiểu thể Lenst trong nguyên sinh chất tế bào.
Theo Carter và cs, (1992), chó mẹ có thai thời kỳ cuối mắc bệnh thì chó
con sau khi sinh thường xuất hiện triệu chứng toàn thân, tổn thương đường hô
hấp trên, viêm mũi, viêm nhánh khí phế quản, viêm kết mạc mắt. Chó con sơ
sinh được sinh ra từ những chó mẹ chưa có kháng thể CDV mà bị nhiễm thì
thường bị teo tuyến ức, viêm phổi hoặc viêm ruột thể cata.
Biểu hiện sừng hoá lớp da ở mũi, bàn chân thường thấy ở chó có triệu
chứng thần kinh. Tổn thương nhẹ trung khu thần kinh, hiếm gặp sung huyết
màng não, trong buồng não và tăng áp lực hệ thần kinh trung ương do phù não.
Suy giảm tế bào lympho là bệnh tích điển hình ở chó có triệu chứng toàn
thân. Viêm kẽ phổi lan toả mà đặc trưng là sự dày lên của vách phế nang và sự
Copyright: Tài liệu đại học ©