BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
VIỆN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG
TÀI LIỆU HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH
CHẨN ĐOÁN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM
BẰNG KỸ THUẬT NESTED - PCR
Cán bộ hướng dẫn
Huỳnh Đăng Sang
Tháng 9 năm 2012
Lưu hành nội bộ
Bài 1. BỆNH ĐỐM TRẮNG
1. Tình hình dịch bệnh đốm trắng tại khu vực đồng bằng sông Cửu Long trong
những năm gần đây
Theo Chi cục Thủy sản Tiền Giang, năm 2010, số lượng thiệt hại bệnh đốm trắng trên tôm,
gây thiệt hại 66.972.000 con/275,82 ha, chiếm tỷ lệ 8,3 % lượng giống thả nuôi và 12,1 % diện
tích thả nuôi. Năm 2011, diện tích tôm nuôi bị thiệt hại là 951,04 ha, chiếm tỷ lệ 18,3% diện tích
thả nuôi. Nguyên nhân chính là do hoại tử gan tụy (chiếm khoảng 70% diện tích thiệt hại), còn
lại là do bệnh đốm trắng.
Tại tỉnh Cà Mau, năm 2011, diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh 538,85 ha (đốm trắng
86,33 ha, hoại tử gan tụy 452,53 ha). Trong 4 tháng đầu năm 2012, toàn tỉnh đã có 555 ha (cả
tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết, tập trung nhiều ở các huyện Đầm Dơi (với 234 ha tôm
chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nước (67 ha) và thành phố Cà Mau (38 ha). Tôm chết chủ yếu bởi
các bệnh đốm trắng, hoại tử gan tụy
Trên địa bàn tỉnh Trà Vinh đã có 3.351 ha tôm nuôi, với gần 300 triệu con tôm sú bị chết tại
các huyện Trà Cú, Cầu Ngang, Duyên Hải, Châu Thành, ước thiệt hại hơn 300 tỷ đồng. Số diện
tích này nằm trong tổng diện tích 19.323 ha, với hơn 1,5 tỷ con tôm sú đã thả nuôi đầu vụ đến
nay tại các huyện trên. Tôm chết trong giai đoạn từ 15 – 45 ngày tuổi, chủ yếu nhiễm bệnh hoại
tử gan tụy, đốm trắng và đầu vàng.
Trong 8 tháng đầu năm 2012, mức độ thiệt hại nuôi tôm trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng đến nay
đã chiếm gần 50%, trong đó diện tích thiệt hại do bệnh đốm trắng chiếm trên 40%.
2. Vi-rút đốm trắng (white spot disease virus)

Bệnh đốm trắng do WSSV lây lan rất nhanh qua 2 con đường chính. Lây lan theo
chiều dọc, từ bố mẹ nhiễm lây cho con. Lây lan theo chiều ngang, tôm nhiễm vi-rút từ
nguồn nước nuôi, từ cua, còng mang vi-rút từ ao này sang ao kia, từ dụng cụ sản xuất mang
mầm bệnh, từ tôm chết, chim, cò vô tình đưa vào ao.
2.5. Vật chủ mang mầm bệnh
WSSV đã được phát hiện cảm nhiễm nhiều loài vật chủ khác nhau Penaeus monodon,
P. japonicus, P. indicus, P. chinensis, P. merguensis, P. aztecus, P. stylirostris, P.
vannami, P. duorarum và P. setiferus; tôm càng xanh - Macrobrachium rosenbergii, cua -
Calappa lophos, Portunus sanguinolentus, Charybdis granulata và C. feriata.
2.6. Phòng bệnh
Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại
do bệnh đốm trắng. Sự phòng ngừa gồm có các biện pháp sau: chọn tôm bố mẹ, tôm giống
có chất lượng tốt, không nhiễm WSSV, nguồn nứớc cấp cho ao nuôi tôm phải lắng lọc và
khử trùng, vớt tôm chết ra khỏi ao, ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác vào ao nuôi,
duy trì các yếu tố môi trường thích hợp cũng như chất lượng thức ăn tốt, khẩu phần ăn hợp
3
lý. Nước nuôi tôm bị bệnh WSSV phải xử lý bằng Clorua vôi nồng độ (30 - 50 g/m3),
không được xả ra ngoài. Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay.
2.7. Phương pháp chẩn đoán
Để phát hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều ph ơng pháp khác nhau như:ƣ
phương pháp mô học xác định bệnh dựa trên các thể vùi hiện diện trong tế bào biểu mô;
phương pháp lai tại chỗ (In situ hybridization) dấu hiệu xác định bệnh là kết quả lai giữa
đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh trong điều kiện nghiêm
ngặt; phương pháp PCR xác định bệnh dựa trên là sản phẩm khuếch đại của một đoạn gen
đặc trưng của tác nhân gây bệnh; phương pháp Dot blot và Southern blot đ ợc thực hiệnƣ
với sản phẩm của PCR; phương pháp miễn dịch huỳnh quang dấu hiệu định bệnh là kết
quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, sử dụng kính hiển vi điện tử.
4
Bài 2.LY TRÍCH DNA
1. Tổng quan về phương pháp ly trích

2.3. Pha dung dịch ly trích DNA thô
Dung dịch ly trích DNA thô có nồng độ NaOH 0,025 N, SDS 0,0125% (theo
Kiatpathomchai và ctv, 2001) được pha theo các bước sau:
• Pha 100 ml NaOH 1N (MW=40)
 Cân 4 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần
 Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút
• Pha 100 ml SDS 0,5% (MW=288,38)
 Cân 0,5 g NaOH hòa trong 100 ml nước cất 2 lần
 Hấp khử trùng ở 121
o
C trong 20 phút
• Dung dịch ly trích thô, thành phần như bảng sau
Dung dịch ly trích DNA thô 200 ml Nồng độ cuối
NaOH 1N 5 ml NaOH 0,0025 N
SDS 0,5% 5 ml SDS 0,0125%
H
2
O 190 ml
2.4. Ly trích DNA
DNA được tách chiết theo nghiên cứu của Kiatpathomchai và ctv (2001). Quy trình được
tiến hành như sau:
 Dùng kẹp lấy mang tôm cho vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch
đệm ly trích thô DNA (0,025 N NaOH và 0,0125% SDS).
 Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất.
 Thêm 300 µl dung dịch ly trích thô DNA, tiếp tục nghiền.
 Đun sôi eppendorf ở 100
o
C trong 20 phút (thấy dung dịch trong mẫu sôi lên).

• Sự nhân bản không đặc hiệu
Xảy ra khi mồi bắt cặp không đặc hiệu với những trình tự khác vơi trình tự đích. Một
số phương pháp để khắc phục
 Phương pháp “hot start” với đặc điểm chủ yếu là tránh sự tiếp xúc của các thành
phần quan trọng trong phản ứng trước khi trình tự đích được biến tính hoàn toàn.
 Phương pháp nested PCR sử dụng thêm 1 cặp mồi được thiết kế để bắt cặp với sản
phẩm khuếch đại của lần thứ nhất.
• Sai sót do Taq polymerase gây ra
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là 10000 nucleotide thì
enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước
hay sự có mặt của 1 sản phẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cấn xác định chính xác trình tự
nucleotide. Không thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt bằng cách đảm bảo
cân bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, sử dụng các DNA polymerase chịu nhiệt có độ
trung thực cao như VentTM, Pfu, Ultma DNA polymerase.
2. Thực hành chẩn đoán WSSV
2.1. Giới thiệu đoạn mồi
Năm 1996, Lo và ctv đã thiết kế 2 cặp mồi: 146F1/146R1 và 146F2/146R2, phát hiện sự hiện
diện của WSSV bằng kỹ thuật nested - PCR. Cặp mồi 146F1/146R1 khuếch đại đoạn bên ngoài
với kích thước 1447 bp. Cặp mồi 146F2/146R2 khuếch đại đoạn bên trong với kích thước 941 bp.
Quy trình này được tổ chức thú y thế giới (OIE) công nhận là quy trình chuẩn và khuyến cáo các
phòng thí nghiệm sử dụng để chẩn đoán WSSV.
9
Hình 5. Vị trí của primer 146F1/146R1, 146F2/146R2 và kích thước sản phẩm
(Lo và ctv, 1996)
2.2. Phân nhóm
Sinh viên trong lớp (20 - 30 sinh viên) được chia thành 5 nhóm (4 - 6 sinh viên/nhóm). Mỗi
mỗi nhóm thực hiện 1 mẫu.
2.3. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ thiết bị
• Hóa chất thực hiện PCR:
 Nước cất

Thành phần Nồng độ đầu Nồng độ cuối Thể tích cần hút
H
2
O 16,7 µl
PCR Buffer 10X 1X 2,5 µl
MgCl
2
25 mM 1,5 mM 1,5 µl
dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 µl
Primer 146F1 10 µM 0,5 µM 1,25 µl
Primer 146R1 10 µM 0,5 µM 1,25 µl
Taq polymerase 5 U/ µl 1,5 U 0,3 µl
DNA khuôn 1 µl
• Để tính thể tích PCR buffer, MgCl
2
, dNTP, primer cần hút, chúng ta sử dụng công
thức:
C
1
x V
1
= C
2
x V
2
C
2
: nồng độ cuối
V
2

Nồng độ
cuối
Thể tích cần
hút (µl)
Thể tích cần hút cho
6 phản ứng (n=6)
(µl)
H
2
O 16,7 100,2
PCR Buffer 10X 1X 2,5 15
MgCl
2
25 mM 1,5 mM 1,5 9
dNTP 10 mM 0,2 mM 0,5 3
Primer 146F1 10 µM 0,5 µM 1,25 7,5
Primer 146R1 10 µM 0,5 µM 1,25 7,5
Taq polymerase 5 U/µl 1,5 U 0,3 1,8
DNA khuôn 1 -
2.4.2. Thực hiện mix mẫu
Sử dụng micropipet để pha master mix chung, bao gồm các thành phần phản ứng trong 1
tube lớn (không hút DNA khuôn). Sau đó chia đều master mix vào n tube PCR 0,2 ml. Cuối
cùng, hút 1 µl DNA khuôn cho vào tube PCR 0,2 ml để được tổng thể tích 25 µl.
Lưu ý khi thực hiện:
- Mix mẫu trong tủ vô trùng, phải vệ sinh tủ trước khi sử dụng.
- Khi mix mẫu, đặt các tube hóa chất trên gel đá hoặc đá bào để giữ lạnh các hóa chất
- Các hóa chất như H
2
0, MgCl
2

C 1 phút
72
0
C 2 phút
72
0
C 5 phút 1
4
0
C ∞
14
Bài 4. ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE
1. Tổng quan về phương pháp điện di trên gel agarose
Agarose là một trong các dạng của polysaccharide. Các nhà sinh học phân tử đã khai
thác đặc tính thể gel trong điện di để phân tách DNA. Agarose sẽ tạo thành các hạt agarose
sau khi tan ở nhiệt độ cao hoặc đun sôi trong vài phút. Khi nguội lại, những hạt agarose sẽ
kết tụ lại với nhau. Giữa các hạt có những lỗ rất nhỏ. Kích thước của các lỗ này xê dịch
chút ít theo nồng độ của agarose gel. Trong điện trường, DNA di chuyển từ điện cực âm
sang điện cực dương, vì DNA mang điện tích âm. Khi DNA di chuyển qua các lỗ của
agarose, sự cọ xát giữa các hạt agarose và phân tử DNA tao ra lực kháng làm ngăn cản sự
dịch chuyển của DNA. DNA có phân tử càng lớn thì lực cản càng mạnh, di chuyển càng
chậm và ngược lại. Nhờ vậy mà chúng ta có thể phân tách được các đoạn DNA trên gel
agarose.
Sau khi điện di trên gel, các đoạn DNA được phân ra tùy theo trọng lượng phân tử.
Chúng ta có thể quan sát chúng bằng mắt nhờ kĩ thuật nhuộm màu DNA với
ethidiumbromide và chiếu tia UV.
2. Thực hành phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose trong quy trình chẩn đoán
WSSV bằng nested PCR
2.1. Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ
 Agarose

Ghi nhận kết quả bằng máy ảnh.
2.4. Phân tích kết quả
Để kết luận mẫu xét nghiệm có DNA của WSSV hay không, chúng ta dựa vào kết quả
PCR bước 2 khi thực hiện với cặp mồi 146F2/146R2.
 Kết luận mẫu xét nghiệm có DNA của WSSV khi: đối chứng dương có băng DNA
(941 bp), đối chứng âm không có băng, mẫu xét nghiệm có băng có cùng kích thước
với băng của đối chứng dương (941 bp)
 Kết luận mẫu xét nghiệm không có DNA của WSSV khi: đối chứng dương có băng
DNA (941 bp), đối chứng âm không có băng, mẫu xét nghiệm không có băng có
cùng kích thước với băng của đối chứng dương (941 bp)
16
Ví dụ:
Hình 6. Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại khi thực hiện nested PCR với mẫu tôm nghi
ngờ nhiễm WSSV thu thập tại huyện Đầm Dơi. Giếng 1 và 9: đối chứng dương; giếng 7
và 15: đối chứng âm; giếng 2, 3, 4, 5, 6 sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi
146F1/146R1; giếng 10, 11, 12, 13, 14, sản phẩm mẫu khuếch đại với cặp mồi 146F2/146
R2; giếng 8: thang DNA 1000 bp. Điện di với gel agarose 1,5% dưới hiệu điện thế 80 V
trong 30 phút. (Thiên Thị Kim Kỷ, 2012)
Kết quả PCR bước 2 khi thực hiện với cặp mồi 146F2/146R2 cho thấy:
 Đối chứng dương có băng 941 bp
 Đối chứng âm không có băng
 5 mẫu xét nghiệm có băng cùng kích thước với đối chứng dương. Nên kết
luận mẫu có DNA của WSSV.
17
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lo, C.F., Leu, J.H., Ho, C.H., Chen, C.H., Peng, S.E., Chen, Y.T., Chou, C.M., Yeh,
P.Y., Huang, C.J., Chou, H.Y.,Wang, C.H., Kou,G.H. 1996. Detection of
baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimps using
polymerase chain reaction. Dis. Aquat. Org. 25, 133–141.
2. Durand S., Lightner D.V., Nunan L.M., Redman R.M., Mari J & Bonami J.R.