CHƯƠNG 3. CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH
CHẾ ENZIM
•
Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các
chất phân tử lượng lớn.
•
Giai đoạn 2:

Khai thác các tính chất đặc trưng khác nhau của protein cầu.

Phân tách dựa trên các thông số riêng như trọng lượng phân tử,
điện tích của protein.
•
Giai đoạn 3: dựa trên những tương tác đặc hiệu và có tính rhuận
nghịch giữa enzim và:

Cơ chất.

Coenzim.

Chất gắn.

Chất hoạt hoá.

ξ1. LỊCH SỬ PHAT TRIỂN CỦA TINH CHẾ
ENZIM

•

ξ2. NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH

•
Nguyên tắc:

Protein hoà tan trong các dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện.

Độ hoà tan của P chỉ tăng cùng với lực ion MT trong một khoảng nhất định
của [muối], Nồng độ muối cao hơn protein enzim có thể kết tủa.

Mối enzim có một khoảng [muối] mà enzim kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng
độ muối tích. Dựa vào tính tan khác nhau mà phân đoạn enzim.
•
Cách tiến hành

Bổ sung vào dịch chứa enzim một thể tích muối bão hoà hoặc một lượng
muối trung tính dạng rắn để đạt được độ phần trăm bão hoà nào đó của
muối này.

Nếu kết tủa là những phần tử không phải enzim mong muốn thì tách hai
pha lỏng rắn và loại bỏ kết tủa thu hồi dịch trong.

Nếu enzim cần tinh chế kết tủa thì sau khi phân tách hai pha lỏng - rắn hoà
tan kết tủa trong một lượng nhỏ dung dịch đệm.

•
Loại muối và cách tính lượng muối sử dụng

Muối sulfat amôn và muối sulfat natri: giá rẻ, khả năng kết tủa cao, độ hoà
tan lớn, protein ít bị biến tính, thao tác đơn giản.

Các công thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch như sau:

Trong đó:G số gam (NH
4
)
2
SO
4
trong 1000ml dung dịch bão hoà
(G = 515g ở 0
o
C; 530,7g ở 15
o
C; 536g ở 20
o
C.
V
g
thể tích riêng biểu kiến của dung dịch (NH
4
)
2
SO
4
bão hoà
(V
g
/1000 = 0,271 ở 0
o
C; V
g
/1000 = 0,288 ở 15

Các đoạn protein enzim thu được sau đó phải được loại bỏ muối bằng
phương pháp thẩm tích hoặc phương pháp lọc gel.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp

Kỹ thuật này cho phép nhận được một phần phân đoạn được làm giàu enzim
từ thể tích lớn: loại bỏ các protein, enzim liên kết hạy các tạp chất khác
không hoà tan trước và sau phần phân đoạn có chứa enzim cần tách chiết.

Thao tác đơn giản, dễ áp dụng nên được dùng phổ biến, nhưng khi làm việc
với thể tích lớn có nhiều khó khăn do đòi hỏi thiết bị phải chịu độ ăn mòn của
muối cao (inox).

Khoảng nồng độ muối tích của các protein thường hay trùng nhau nên không
bao giờ có thể thu được các phần phân đoạn enzim tinh khiết hoàn toàn.

Thường sử dụng phương pháp này vào giai đoạn đầu của quá trình tinh chế
enzim.

2. Kết tủa đẳngđiện
•
Nguyên tắc:
–
Enzim có độ hoà tan tối thiểu xung quanh điểm đẳng điện (pI),
vì phân tử protein enzim có tổng điện tích bằng không.
–
Không có lực đẩy tĩnh điện nên các phân tử protein enzim sẽ
kết hợp với nhau tạo nên kết tủa.
–
Mỗi protein có một pI khác nhau phụ thuộc thành phần axit amin

protein enzim ở nhiệt độ cao để phân huỷ một
cách chọn lọc một số enzim nhiễm tạp.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp
–
Kỹ thuật đòi hỏi giá thành cao.
–
Cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh tổn thất
enzim mong muốn.

4. Kết tủa bằng dung môi hữu cơ
•
Nguyên tắc:
–
Dung môi hữu cơ trung tính hoà tan trong nước sẽ làm thay đổi hằng số
điện môi của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein.
–
Khi bổ sung lượng dung môi tăng dần thì phức hợp giữa các phân tử protein
enzim tích điện trái dấu lớn dần cho tới khi kết tủa.
–
Tuỳ tính chất từng loại protein enzim, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa
mà mỗi enzim được kết tủa được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác
nhau.
Protease kết tủa với etanol 76 – 78% (v/v)
α-amylase kết tủa với etanol 70%; hoặc izopropanol 55%; hoặc axeton 60%.
Glucoamylase kết tủa với etanol 45%.
•
Ưu nhược điểm của phương pháp
–
Một số dung môi sau khi sử dụng có thể chưng cất và thu hồi lại được.

Kỹ thuật này được áp dụng để tách axit nucleic ra khỏi hỗn hợp sau khi
phá vỡ tế bào VSV. Ion kim loại (Mn
+2
) tạo muối kết tủa với axit nucleic và
được loại ra ngoài. Axit nucleic chiếm khoảng 7% ở E. coli, có độ nhớt cao
ảnh hưởng lớn tới quá trình tinh chế enzim.
–
Axit nucliec có nhóm axit mạnh liên kết với nhóm amin cuỉa protein enzim
trong môi trường axit làm kết tủa chúng. Bổ sung protein kiềm tính như
protamin sẽ thay thế được vị trí của protein trong phức hợp và enzim sẽ
tồn tại trong dung dịch. Ly tâm để laọi bỏ phức này.
–
Các chất phản ứng thường sử dụng là muối mangan, sulfat streptomycin,
sulfat protamin, bromcetytrimetylamôn, polyetylenimin (polyme cationic).
Kinh tế nhất là sử dụng chế phẩm enzim nuclease (ribo và desoxyribo
nuclease).