bài giảng công nghệ protein enzyme chương 4 các phương pháp tinh sạch protein enzym - Pdf 14

1
1
C
C
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p tinh
p tinh
s
s


ch protein
ch protein
-
-
enzym
enzym
Trong d
Trong d


ch chi
ch chi
ế
ế
t thô thu đư

t cao
phân t
phân t


kh
kh
á
á
c như polysaccharid
c như polysaccharid
, acid nucleic
, acid nucleic
v
v
à
à
c
c
á
á
c ch
c ch


t phân t
t phân t


nh

Đ


lo
lo


i b
i b


ch
ch
ú
ú
ng ph
ng ph


i s
i s


d
d


ng ph
ng ph


i c
á
á
c t
c t


p ch
p ch


t
t
2
2
Đ
Đ


lo
lo


i b
i b


mu
mu


á
c t
c t


p ch
p ch


t c
t c
ó
ó
phân t
phân t






ng
ng
th
th


p ngư
p ngư



i nư
i nư


c hay đ
c hay đ


i
i
c
c
á
á
c dung d
c dung d


ch đ
ch đ


m loãng ho
m loãng ho


c b
c b


t
3
3
Đ
Đ


lo
lo


i b
i b


c
c
á
á
c protein t
c protein t


p v
p v
à
à
c
c
á


i ta hay d
i ta hay d
ù
ù
ng k
ng k
ế
ế
t
t
h
h


p nhi
p nhi


u bi
u bi


n ph
n ph
á
á
p kh
p kh
á

t
á
á
c d
c d


ng c
ng c


a nhi
a nhi


t đ
t đ


ho
ho


c pH c
c pH c


a môi trư
a môi trư


i trung t
í
í
nh ho
nh ho


c c
c c
á
á
c dung
c dung
môi h
môi h


u cơ
u cơ
, c
, c
á
á
c phương ph
c phương ph
á
á
p s
p s


i c
á
á
c t
c t


p ch
p ch


t
t
4
4
M
M


t trong nh
t trong nh


ng k
ng k


thu
thu


à
tinh ch
tinh ch
ế
ế
protein l
protein l
à
à
ly tâm.
ly tâm.
M
M
á
á
y ly tâm đư
y ly tâm đư


c s
c s


d
d


ng đ
ng đ





i ta g
i ta g


i pha l
i pha l


ng l
ng l
à
à
ch
ch


t l
t l


ng bên trên k
ng bên trên k
ế
ế
t
t
t

á
y
y


ng ly tâm
ng ly tâm
đư
đư


c g
c g


i l
i l
à
à
k
k
ế
ế
t t
t t


a. Th
a. Th



a nh
a nh


ng ti
ng ti


u ph
u ph


n r
n r


n nh
n nh


l
l


c ly tâm. S
c ly tâm. S


sai kh


i ch
i ch


t l
t l


ng c
ng c
à
à
ng l
ng l


n
n
th
th
ì
ì
t
t


c đ
c đ


i ta coi s


vòng quay trong m
vòng quay trong m


t ph
t ph
ú
ú
t l
t l
à
à
đơn v
đơn v


thông thư
thông thư


ng c
ng c


a l
a l



t thông thư
t thông thư


ng
ng
trong tinh s
trong tinh s


ch protein
ch protein
Ly tâm
Ly tâm
5
5
C
C
ó
ó
nh
nh


ng nguyên t
ng nguyên t


c đ

i v


i
i
ngư
ngư


i thao t
i thao t
á
á
c c
c c
ũ
ũ
ng như đ
ng như đ


i v
i v


i
i
nguyên li
nguyên li


n ch
ú
ú
ý tuân th
ý tuân th


.
.
Đ
Đ
ó
ó
l
l
à
à
nguyên t
nguyên t


c cân b
c cân b


ng đ
ng đ


i x

y l
à
à
m vi
m vi


c.
c.
Ly tâm
Ly tâm
6
6
Do t
Do t
í
í
nh ch
nh ch


t không b
t không b


n v
n v


i nhi

t tinh ch
ế
ế
ch
ch
ú
ú
ng, c
ng, c


n s
n s


d
d


ng
ng
m
m
á
á
y ly tâm l
y ly tâm l


nh


m c
m c
ó
ó
h
h


n ch
n ch
ế
ế
, c
, c
ó
ó
th
th


s
s


d
d


ng m

m


u
u


nhi
nhi


t đ
t đ


th
th


p.
p.
C
C


n l
n l
à
à
m l

u
trong m
trong m
á
á
y c
y c
ó
ó
c
c
á
á
c
c


đ
đ


m thay th
m thay th
ế
ế
c
c
ó
ó
th

c khi ly tâm. C


n
n
ph
ph


i ti
i ti
ế
ế
n h
n h
à
à
nh ly tâm v
nh ly tâm v


i th
i th


i gian t
i gian t


i thi


t tr
t tr


c ti
c ti
ế
ế
p m
p m
á
á
y ly
y ly
tâm b
tâm b
é
é
v
v
à
à
o t
o t


l
l


nh c


a t
a t


l
l


nh
nh
Ly tâm
Ly tâm
7
7
Th
Th


m t
m t
í
í
ch l
ch l
à
à
s

i v


i nh
i nh


ng ch
ng ch


t keo hòa tan (protein,
t keo hòa tan (protein,
m
m


t s
t s


c
c
á
á
c polysaccharid)
c polysaccharid)
nhưng th
nhưng th



.C
.C
á
á
c tinh th
c tinh th


(c
(c
á
á
c mu
c mu


i, c
i, c
á
á
c h
c h


p
p
ch
ch


th


khu
khu
ế
ế
ch t
ch t
á
á
n qua m
n qua m
à
à
ng theo đ
ng theo đ


nh lu
nh lu


t Fick.
t Fick.




c s


th
th


p hơn
p hơn
(t
(t




ng l
ng l
à
à
dung d
dung d


ch r
ch r


a) v
a) v
à
à
o dung d


t phân t
t phân t


nh
nh


s
s


chuy
chuy


n v
n v
à
à
o dung d
o dung d


ch c
ch c
ó
ó
n

o dung d


ch r
ch r


a).
a).
Th
Th


m t
m t
í
í
ch
ch
8
8
Trong qu
Trong qu
á
á
tr
tr
ì
ì
nh t


i ammonium sulphate ra kh
i ammonium sulphate ra kh


i dung d
i dung d


ch protein th
ch protein th
ì
ì
cho dung d
cho dung d


ch protein v
ch protein v
à
à
o c
o c
á
á
i t
i t
ú
ú
i đ

m.
Thông thư
Thông thư


ng ngư
ng ngư


i ta hay
i ta hay
d
d
ù
ù
ng t
ng t
ú
ú
i colodion ho
i colodion ho


c cellophane (lo
c cellophane (lo


i sau hay đư
i sau hay đư


à
o b
o b
ì
ì
nh ch
nh ch


a lư
a lư


ng l
ng l


n
n




c ho
c ho


c lư
c lư



m phosphate c
m phosphate c
ó
ó
pH = 7, n
pH = 7, n


ng đ
ng đ


0,01M). V
0,01M). V
ì
ì
m
m
à
à
ng
ng
cellophane l
cellophane l
à
à
m
m
à

cho c
á
á
c
c
ch
ch


t c
t c
ó
ó
phân t
phân t


đi qua v
đi qua v
à
à
o c
o c
á
á
c dung d
c dung d


ch đ


i s
i s


khuy
khuy
ế
ế
n t
n t
á
á
n v
n v
à
à
o
o




c ho
c ho


c dung d
c dung d



c ho
c ho


c đ
c đ


m loãng s
m loãng s


di chuy
di chuy


n t
n t


dung d
dung d


ch r
ch r


a v

nh


ng đ
ng đ


i phân t
i phân t


không th
không th






t qua
t qua
t
t
ú
ú
i th
i th


m t

á
ch
ch
thay đ
thay đ


i thư
i thư


ng xuyên dung d
ng xuyên dung d


ch r
ch r


a c
a c
ó
ó
th
th


t
t


ì
nh th
nh th


m t
m t
í
í
ch, n
ch, n
ó
ó
l
l
à
à
dung d
dung d


ch đư
ch đư


c pha loãng
c pha loãng
hơn
hơn
. C


s
s


pha
pha
loãng như th
loãng như th
ế
ế
khi ti
khi ti
ế
ế
n h
n h
à
à
nh th
nh th


m t
m t
í
í
ch dư
ch dư



c x
c x


lý n
lý n


m
m




i m
i m


t
t
á
á
p su
p su


t th
t th


ng h


c c
c c


a nư
a nư


c t
c t


dung d
dung d


ch s
ch s


cân b
cân b


ng s
ng s


ch.
Phương ph
Phương ph
á
á
p n
p n
à
à
y thư
y thư


ng đòi h
ng đòi h


i c
i c
ó
ó
thi
thi
ế
ế
t b
t b


đ

í
ch
ch
11
11
Phương ph
Phương ph
á
á
p th
p th


m t
m t
í
í
ch thông thư
ch thông thư


ng l
ng l
à
à
cho dung d
cho dung d


ch c

á
2/3 th
2/3 th


t
t
í
í
ch
ch
t
t
ú
ú
i). Cho thu
i). Cho thu


c s
c s
á
á
t tr
t tr
ù
ù
ng ho
ng ho


í
ch lâu, protein c
ch lâu, protein c
ó
ó
th
th


b
b


th
th


i h
i h


ng).
ng).
Bu
Bu


c t
c t
ú


u nư
u nư


c đ
c đ


gi
gi


t
t
ú
ú
i
i


gi
gi


a ch
a ch


u.


u đ
u đ


thay đ
thay đ


i nư
i nư


c thư
c thư


ng
ng
xuyên. Mu
xuyên. Mu


i (NH
i (NH
2
2
)SO
)SO
4


m t
m t
í
í
ch c
ch c
ó
ó
th
th


t
t


24
24
-
-
48 gi
48 gi


, l
, l
à
à
m th

c c


t.
t.
C
C
ó
ó
th
th


tăng t
tăng t


c đ
c đ


th
th


m t
m t
í
í
ch khi khu

c hay m
á
á
y tr
y tr


n t
n t


ho
ho


c l
c l
à
à
quay ch
quay ch


m
m
t
t
ú
ú
i nh

ng ngư


i ta ti
i ta ti
ế
ế
n h
n h
à
à
nh t
nh t


t c
t c


c
c
á
á
c thao t
c thao t
á
á
c
c


c ký l


c gel l
c gel l
à
à
m
m


t trong nh
t trong nh


ng k
ng k


thu
thu


t s
t s


c ký
c ký
c

à
tinh
tinh
s
s


ch protein.
ch protein.
D
D


ch chi
ch chi
ế
ế
t protein enzyme đã đư
t protein enzyme đã đư


c lo
c lo


i b
i b


ph

o đ

ộđ
đ


ng nh
ng nh


t c
t c


n thi
n thi
ế
ế
t đư
t đư


c ti
c ti
ế
ế
p t

t.
Phương ph
Phương ph
á
á
p s
p s


c ký (chromatography) l
c ký (chromatography) l
à
à
do hai
do hai
ch
ch


"chroma" l
"chroma" l
à
à
m
m
à
à
u s
u s



ng m
ng m
à
à
u. Thu
u. Thu


ban đ
ban đ


u,
u,
ngư
ngư


i ta
i ta
s
s


d
d


ng phương ph

u v
à
à
ch
ch


sau n
sau n
à
à
y ngư
y ngư


i ta
i ta
á
á
p d
p d


ng cho vi
ng cho vi


c
c
t

S


c ký l
c ký l


c gel còn đư
c gel còn đư


c g
c g


i l
i l
à
à
phương ph
phương ph
á
á
p d
p d
ù
ù
ng ch
ng ch



c gel l
c gel l
à
à
d
d


a v
a v
à
à
o s
o s


kh
kh
á
á
c nhau
c nhau
nhau v
nhau v


k
k
í

a
protein enzyme c
protein enzyme c
ó
ó
trong h
trong h


n h
n h


p đ
p đ


t
t
á
á
ch ch
ch ch
ú
ú
ng ra.
ng ra.
Đ
Đ


t
rây phân t
rây phân t


ph
ph


i l
i l
à
à
ch
ch


t trơ
t trơ
, không ph
, không ph


n
n


ng v
ng v


v


i c
i c
á
á
c y
c y
ế
ế
u t
u t


v
v


cơ h
cơ h


c c
c c
ũ
ũ
ng như sinh h
ng như sinh h


í
ch l
ch l


c phân t
c phân t


ph
ph


i l
i l
à
à
ch
ch


t không
t không
c
c
ó
ó
t
t
í

c
(hidrofil).
(hidrofil).
S
S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
14
14
Gel sephadex l
Gel sephadex l
à
à
ch
ch


t th
t th


a mãn c
a mãn c
á

c lo
à
à
i vi sinh v
i vi sinh v


t
t
kh
kh
á
á
c nhau l
c nhau l
à
à
Leuconostoc
Leuconostoc
t
t


o ra khi ch
o ra khi ch
ú
ú
ng đư
ng đư



a dextran c
a dextran c
ó
ó
th
th


đ
đ


t t
t t


i h
i h
à
à
ng tri
ng tri


u v
u v
à
à
l

c glucose t


o th
o th
à
à
nh
nh
c
c
á
á
c liên k
c liên k
ế
ế
t 1,6. Sephadex Nh
t 1,6. Sephadex Nh


n t
n t


dextran b
dextran b


ng c

đ


t
t


o ra c
o ra c
á
á
c
c




i phân nh
i phân nh
á
á
nh c
nh c
ó
ó
liên k
liên k
ế
ế
t ngang g


th
th
à
à
nh không tan trong nư
nh không tan trong nư


c. S
c. S


liên k
liên k
ế
ế
t
t
ngang t
ngang t


o ra c
o ra c
à
à
ng nhi
ng nhi


ng nh


.
.
S
S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
15
15
Phương ph
Phương ph
á
á
p l
p l


c phân t
c phân t


trên Sephadex đư

à
i v
i v
à
à
cân b
cân b


ng
ng
b
b


ng dung d
ng dung d


ch đ
ch đ


m c
m c
ó
ó
pH nh
pH nh


chi
ế
ế
t b
t b


ng dung
ng dung
môi th
môi th
í
í
ch h
ch h


p, c
p, c
á
á
c phân t
c phân t


c
c
ó
ó
tr

c mu


i) s
i) s


khu
khu
ế
ế
ch t
ch t
á
á
n ch
n ch


m ch
m ch


p qua c
p qua c
á
á
c
c
l


t
t
c
c
ó
ó
tr
tr


ng lư
ng lư


ng phân t
ng phân t


l
l


n hơn
n hơn
(
(


trư

à
l
l
á
á
ch nhanh
ch nhanh
qua c
qua c
á
á
c h
c h


t sephadex v
t sephadex v
à
à
s
s


đư
đư


c chi
c chi
ế


c gel
c gel
Sơ đồ của sắc ký lọc gel
Các phân tử protein phân tách theo kích thước,
các phân tử lớn hơn đi qua cột tự do hơn và
xuất hiện trong các phân đoạn đầu tiên
Các hạt polymer
xốp có lỗ nhỏ
Hỗn hợp protein được bổ sung vào cột
chứa các polymer liên kết chéo
17
17
V
V
ì
ì
v
v


y ta c
y ta c
ó
ó
th
th


t

cao hơn tho
á
á
t ra kh
t ra kh


i c
i c


t gel trư
t gel trư


c so v
c so v


i ch
i ch


t c
t c
ó
ó
phân t
phân t


trư


ng c
ng c
á
á
c lo
c lo


i sephadex c
i sephadex c
ó
ó
k
k
í
í
ch thư
ch thư


c
c
kh
kh
á
á
c nhau c


ch
ch


ra m
ra m


c đ
c đ


nh
nh


n (h
n (h
ú
ú
t)
t)




c c
c c



ng th
ng th
ì
ì
1g gel khô nh
1g gel khô nh


n 1
n 1
ml nư
ml nư


c (1ml/g)
c (1ml/g)
S
S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
18
18
C

G. 15
0
0
-
-
1.50
1.50
G. 25
G. 25
100
100


5000
5000
h
h


t tinh (F)
t tinh (F)
h
h


t thô (C)
t thô (C)
G. 50
G. 50
1500

-
150.000
150.000
G. 150
G. 150
5.000
5.000
-
-
400.000
400.000
G. 200
G. 200
5.000
5.000
-
-
800.000
800.000
S
S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
19

h


t c
t c
ù
ù
ng
ng
trong m
trong m


t vòng l
t vòng l


c phân t
c phân t


: h
: h


t thô (coarse), h
t thô (coarse), h


t trung

n
(superfine).
(superfine).
Ngư
Ngư


i ta còn s
i ta còn s


d
d


ng sephadex đ
ng sephadex đ


lo
lo


i mu
i mu


i thay cho qu
i thay cho qu
á

c
ó
ó
ngu
ngu


n g
n g


c
c
polisacharid, l
polisacharid, l
à
à
ch
ch
ế
ế
ph
ph


m dextran như sephadex
m dextran như sephadex
(pharmacia) còn c
(pharmacia) còn c
ó


ng d
ng d


ng nhi
ng nhi


u trong nghiên c
u trong nghiên c


u.
u.
S
S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
20
20
C
C
ó

t c
ó
ó
tr
tr


ng lư
ng lư


ng phân t
ng phân t


l
l


n như protein
n như protein
, peptid, lo
, peptid, lo


i mu
i mu


i kh

ch theo tr


ng lư
ng lư


ng
ng
phân t
phân t


(
(
như protein huy
như protein huy
ế
ế
t thanh)
t thanh)
ho
ho


c t
c t
á
á
ch c

á
c
c
d
d


ng c
ng c


a enzyme phân c
a enzyme phân c


t (
t (
như
như
-
-
G
G
-
-
globulin b
globulin b


c

ch
ế
ế
ph
ph


m dextran
m dextran
còn c
còn c
ó
ó
nh
nh
ó
ó
m ch
m ch


t rây phân t
t rây phân t


l
l
à
à
ch

i
copolimer, s
copolimer, s


n ph
n ph


m c
m c


a Hungary đư
a Hungary đư


c t
c t


o ra t
o ra t


acrilamid
acrilamid
v
v
à

ng đ


t
t
á
á
ch c
ch c
á
á
c ch
c ch


t c
t c
ó
ó
tr
tr


ng lư
ng lư


ng phân t
ng phân t



d
d


ng
ng


v
v
ù
ù
ng pH t
ng pH t


2
2
-
-
11. Ch
11. Ch


t th
t th


ba l

Pharmacia). N




i ta thư
i ta thư


ng d
ng d
ù
ù
ng ch
ng ch


t
t
n
n
à
à
y đ
y đ


t
t
á

S


c ký l
c ký l


c gel
c gel
21
21
T
T
ó
ó
m l
m l


i b
i b


ng phương ph
ng phương ph
á
á
p l
p l


tr


ng lư
ng lư


ng phân t
ng phân t


kh
kh
á
á
c nhau c
c nhau c
ó
ó
trong h
trong h


n h
n h


p (
p (
như polimer

thu


t n
t n
à
à
y đ
y đ


lo
lo


i mu
i mu


i
i
thay cho qu
thay cho qu
á
á
tr
tr
ì
ì
nh th

ế
protein enzyme, ch
protein enzyme, ch
ú
ú
ng còn đư
ng còn đư


c s
c s


d
d


ng đ
ng đ

ểcô đ
cô đ


c dung d
c dung d



a v
a v
à
à
o s
o s


kh
kh
á
á
c nhau v
c nhau v

ềđi
đi


n t
n t
í
í
ch t
ch t


á
p n
p n
à
à
y đư
y đư


c d
c d


a trên cơ s
a trên cơ s


c
c


a ph
a ph


n
n


ng trao đ

m
loãng v
loãng v
à
à
c
c
á
á
c t
c t
á
á
c nhân trao đ
c nhân trao đ


i ion. T
i ion. T
á
á
c nhân (hay nguyên
c nhân (hay nguyên
li
li


u)
u)
trao đ

í
ch nh
ch nh
ó
ó
m sinh ion
m sinh ion
ho
ho


c l
c l
à
à
ch
ch


t ionit.
t ionit.
Đây l
Đây l
à
à
nh
nh


ng ch

t l
à
à
cellulose ho
cellulose ho


c ch
c ch


t gel dextran c
t gel dextran c
ó
ó




i
i
phân nh
phân nh
á
á
nh (Sephadex, Molselect) ho
nh (Sephadex, Molselect) ho


c l

y thư


ng k
ng k
ế
ế
t h
t h


p v
p v


i c
i c
á
á
c nh
c nh
ó
ó
m ion
m ion
h
h
ó
ó
a. C

, s
ephadex,
ephadex,
molselect thông thư
molselect thông thư


ng đư
ng đư


c d
c d
ù
ù
ng đ
ng đ


t
t
á
á
ch protein enzyme,
ch protein enzyme,
còn c
còn c
á
á
c ch


như
như
Dowex, Amberlite) ch
Dowex, Amberlite) ch


d
d
ù
ù
ng đ
ng đ


t
t
á
á
ch c
ch c
á
á
c peptid c
c peptid c
ó
ó
tr
tr



i ion.
i ion.
23
23
* C
* C
á
á
c ch
c ch


t trao đ
t trao đ


i ion c
i ion c
ó
ó
ch
ch


t gi
t gi
á
á
cellulose

n xu


t este c
t este c


a cellulose.
a cellulose.
(Cellelose
(Cellelose
-
-
O
O
-
-
CH2
CH2


COOH)
COOH)
Khi phân li cho ra COO
Khi phân li cho ra COO
-
-
.
.
Đây l

m c
ó
ó
th
th


a nh
a nh


ng
ng
nh
nh
ó
ó
m amin v
m amin v
à
à
nh
nh


ng nh
ng nh
ó
ó
m ki

h


p ph
p ph


trên c
trên c
á
á
c cationit đư
c cationit đư


c ti
c ti
ế
ế
n h
n h
à
à
nh v
nh v


i nh
i nh



a
a
c
c
á
á
c acid amin diamino
c acid amin diamino
-
-
mono carboxylic như lys
mono carboxylic như lys
, Arg, His)
, Arg, His)
Phương ph
Phương ph
á
á
p s
p s


c ký trao đ
c ký trao đ


i ion.
i ion.
24


a cellulose)
a cellulose)
Cellulose
Cellulose
-
-
O
O
-
-
CH
CH
2
2
-
-
CH
CH
2
2


N
N
-
-
(C
(C
2

C
2
2
H
H
4
4
-
-
N
N
-
-
(C
(C
2
2
H
H
5
5
)
)
2
2
+ H
+ H
2
2
O

2
H
H
5
5
)
)
2
2
+ OH
+ OH
-
-
Đây l
Đây l
à
à
ch
ch


t trao đ
t trao đ


i anion, b
i anion, b


n thân t

á
c anionit đư
c anionit đư


c
c
á
á
p d
p d


ng đ
ng đ


phân t
phân t
í
í
ch c
ch c
á
á
c protein acid c
c protein acid c
ó
ó
th

nh


ng ionit như v
ng ionit như v


y đư
y đư


c ti
c ti
ế
ế
n h
n h
à
à
nh v
nh v


i nh
i nh


ng dung d
ng dung d


-
8,5. (c
8,5. (c
á
á
c
c
protein acid c
protein acid c
ó
ó
ch
ch


a c
a c
á
á
c amino acid monoamin
c amino acid monoamin
dicarboxylic như glu
dicarboxylic như glu
, Asp)
, Asp)
Phương ph
Phương ph
á
á
p s


Nhờ tải bản gốc

Tài liệu, ebook tham khảo khác

Music ♫

Copyright: Tài liệu đại học © DMCA.com Protection Status