BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM
KHOA: CÔNG NGHỆ HOÁ HỌC VÀ THỰC PHẨM
SỰ LÊN MEN SORBOSE THEO PHƯƠNG PHÁP
FED – BATCH SỬ DỤNG PULSE FEEDING VÀ
MULTIPE FEEDING ĐỂ CẢI THIỆN NĂNG
SUẤT

1
GVHD: TS Trịnh Khánh Sơn
Nhóm 10: Đặng Thị Hoàng Dung
Lê Thị Mỹ Duyên
Nguyễn Thị Thảo Hà
Lê Thị Hồng Lụa
Phan Thị Ánh Nguyệt
Nguyễn Thị Thu Thủy
SỰ LÊN MEN SORBOSE THEO PHƯƠNG PHÁP FED – BATCH SỬ DỤNG
PULSE FEEDING VÀ MULTIPE FEEDING ĐỂ CẢI THIỆN NĂNG SUẤT
Bộ kỹ thuật hóa sinh và công nghệ sinh học, Viện công nghệ Ấn Độ, Delhi, New Delhi-
110 016, Ấn Độ.
Tóm tắt
Quá trình oxy hóa vi sinh từ D- sorbitol thành L-sorbitol bởi Acertobacter suboxydans là
một vấn đề quan trọng về mặt thương mại vì đó là quá trình hóa sinh duy nhất tổng hợp
vitamin C. Bước thiết yếu trong quá trình oxy hóa mẻ từ sorbitol thành sorbose là một
quá trình ức chế nghiêm trọng (severely inhibited) bởi sorbitol. Thiết kế phương pháp lên
men fed-batch thích hợp có thể loại bỏ các cơ chất ức chế vốn có và giúp cải thiện năng
suất sản xuất sorbose. Lên men theo phương pháp fed-batch được tiến hành bằng cách sử
dụng hai phương pháp bổ sung chất dinh dưỡng (nutrient feeding strategies). Với việc
lên men theo phương pháp fed-batch sử dụng pulse feeding, cùng với nồng độ sorbitol
cao (600 g/L) các chất dinh dưỡng khác được thêm liên tục vào bốn lần pulse mỗi lần là
0.5 lít khi nồng độ DO tăng. Lên men theo phương pháp fed-batch thực hiện trong 24 giờ

phản ứng đó có một phần môi trường nuôi cấy với nồng độ sorbitol thấp. Do đó, nồng độ
sorbitol cuối cùng trong bình phản ứng có thể giữ tốt dưới mức bị ức chế. Trong lên men,
sự lên men có thể bị ức chế bởi cơ chất (which have inhibition due to substrate), lên men
theo phương pháp fed batch là một trong những quá trình thuận lợi nhất để đạt được tốc
độ gia tăng đặc trưng tối đa trong suốt quá trình nuôi cấy, dẫn đến việc oxy hóa cơ chất
nhanh hơn để tạo thành sản phẩm.
Hiệu quả của phương pháp bổ sung chất dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy thích hợp
trong bình phản ứng là các thông số rất cần thiết để đạt được năng suất cao trong lên men
theo phương pháp fed-batch. Tốc độ hình thành sản phẩm cũng bị ảnh hưởng bởi sự thay
3
đổi phương pháp nuôi cấy. Đối với hệ thống lên men sorbose, việc cung cấp lượng
sorbitol cao cho quá trình lên men nên được ngăn chặn để tránh ức chế sự phát triển của
tế bào trong khi việc nuôi cấy một lượng nhỏ sorbitol dẫn đến việc giới hạn cơ chất, kết
quả là nồng độ sản phẩm cuối cùng thấp. Nồng độ và thời gian thích hợp nhất để thêm
vào sorbitol quyết định đến nồng độ cuối cùng trong bình phản ứng.
Một vài phương pháp nuôi cấy như nuôi cấy theo cấp số nhân, [4] thêm vào liên tục
(intermittent addition) [5] và nuôi cấy theo nồng độ gradient [6] đã được báo cáo trong
lên men sorbose theo phương pháp fed batch. Srivastava và Lasrado [4] đã khởi xướng
(initiated) sự lên men theo phương pháp fed batch với nồng độ sorbitol lúc đầu là 200
g/L và sau 10 giờ phát triển nó chuyển đổi thành fed-batch bằng cách bổ sung chất dinh
dưỡng có chứa 700 g/L sorbitol với tốc độ tăng theo cấp số nhân. Mori và các cộng sự [5]
sử dụng nồng độ sorbitol lúc đầu là 80 g/L và bột sorbitol được cung cấp lên men liên tục
cho sự nuôi cấy fed batch trong một quá trình lên men sử dụng DO-stat. Chúng cũng sử
dụng oxy tinh khiết cung cấp cho quá trình lên men để duy trì mật độ của oxy ở 2-3ppm.
Trong quá trình sử dụng gradient fed-batch được áp dụng bởi Bosjnak và các cộng sự [6],
nuôi cấy mẻ với nồng độ sorbitol lúc đầu là 120g/L được chuyển thành nuôi cấy fed-
batch trong 10 giờ phát triển. Chất dinh dưỡng có chứa nồng độ sorbitol cao (400g/L) sẽ
được bơm tới bình phản ứng với tốc độ bổ sung không đổi. Phương pháp nuôi cấy mà
chất dinh dưỡng được thêm vào gấp đôi với sự đo lường các thông số vật lý đa dạng như
nồng độ phá hủy oxy, pH, nhiệt độ vi sinh (microbial heat) và tốc độ tạo thành cacbon

ammonium dihydrogen phosphate, 3.0; magnesium sulphate, 1.0, pH 6.0. Các ống
nghiệm được ủ ở 30
o
C trong 72 giờ. Sự tăng trưởng được đặc trưng bởi sự xuất hiện của
một màng mỏng trên bề mặt của môi trường và có độ đục đồng nhất. Sau đó được chuyển
vào bình có dung tích 1 lít có chứa 100 ml môi trường có chứa các thành phần (g/L):
sorbitol, 5.0 ; bột cao nấm men, 5.0 ; ammonium dihydrogen phosphate, 3.0; magnesium
sulphate , 1.0, pH, 6.0. Các bình được ủ trong một thiết bị rung lắc (Adolf Kuhner , Thụy
Sỹ) ở 30
o
C và 250 rpm. Sau đó chuyển vào thiết bị lên men khi nồng độ sinh khối khoảng
2.8 đến 3.0 g/L.
5
Quá trình lên men
Điều kiện lên men
Lên men theo phương pháp fed-batch đã được thực hiện trong thiết bị lên men có
dung tích 7.0 lít( Bioengineering AG, Thụy Sỹ) được trang bị hai tầng cánh khuấy tuabin
(two sets of flat blade turbine impellers). Dung tích làm việc là 4.5 lít. Tốc độ sục khí
(aeration) và tốc độ khuấy trộn tương ứng là 2.2 vvm và 700 rpm. Nhiệt độ được duy trì ở
30
o
C và độ pH ở 6.0 bằng cách tự động thêm NaOH 3N và HCl 3N.
Lên men theo phương pháp Fed-batch sử dụng Pulse Feed
Lên men theo phương pháp Fed-batch sử dụng Pulse Feed được bắt đầu như một mẻ
với nồng độ sorbitol ban đầu là 100 g/L. Nồng độ(g/L) của các chất dinh dưỡng khác; bột
cao nấm men, 5.0; ammonium dihydrogen phosphate, 3.0 và magnesium sulphate, 1.0.
Bốn lần sử dụng pulse feeds mỗi lần 0.5 lít, 600 g/L sorbitol cùng với tăng tỷ lệ các chất
dinh dưỡng khác mà chúng không được giới hạn, được bổ sung khi nồng độ oxy hòa tan
trong bình phản ứng tăng lên đột ngột (tại giờ thứ 7, 12, 15 và 20 ) cho thấy sự suy giảm
của nguồn carbon. Sự lên men được dừng lại khi tất cả các sorbitol trong môi trường đã

Nồng độ Sorbitol và Sorbose
Nồng độ sorbitol và sorbose ước tính bởi HPLC (Waters Associates, Mỹ) sử dụng
Supelcosil LC- NH
2
( Supelco, Mỹ) cột ( 25 cm x 4,6 mm ID ) trang bị máy dò RI và sử
dụng acetonitrile-water ( 75:25 ) như là dung môi với tốc độ dòng chảy 1 ml/phút ở nhiệt
độ môi trường.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Fed-batch Fermentation with Pulse Feed
7
Theo biểu đồ 1 cho thấy động học (the kinetics) của quá trình lên men theo phương pháp
fed batch với bốn lần pulse feed mỗi lần 0.5 lít chứa S
0
=
600 g/L sorbose. Quá trình lên
men được kết thúc trong 24h với nồng độ sinh khối và nồng độ sorbose cuối cùng lần
lượt là 12.24 và 320.48g/L. Quá trình lên men cũng chứng minh năng suất của sorbose là
13.35 g L
-1
h
-1
. Biểu đồ 1 cũng cho chúng ta thấy rằng nồng độ sorbitol tối đa trong phản
ứng của quá trình lên men này là 105 g/L ở 7.5h sau khi bổ sung pulse lần thứ nhất bao
gồm 0.5L môi trường chứa 600g/L sorbitol. Lượng sorbitol đã bổ sung lần thứ hai
(second sorbitol feed shot) cũng nhanh chóng được tiêu thụ, có lẽ do nồng độ sinh khối
cao (hoạt động) trong bình phản ứng. Tuy nhiên, hai lượng sorbitol cuối cùng không
những pha loãng nồng độ sorbose hiện tại (the existing sorbose concentration) mà còn
tốn thời gian dài hơn (4 – 5h) cho việc tiêu thụ tổng cơ chất (total substrate consumption).
Điều này có thể do ảnh hưởng của sự pha loãng đến kết quả việc không bổ sung sorbitol
sớm. Tuy nhiên, việc sử dụng Pulse feeding, nồng độ sorbitol cuối cùng được duy trì

h
-1
. Nồng độ sinh khối và sorbose cuối cùng tương ứng là 12.64
và 332.60 g/L. Nồng độ và năng suất sorbose thu được bằng multiple feeding được thấy
là cao hơn so với pulse feeding. Sự cải thiện trong việc tích lũy và cải thiện năng suất
sorbose có thể được cho là do những lý do sau.
- Pulse lần thứ nhất được thêm vào trong suốt pha phát triển theo cấp số mũ
( exponential growth phase) của quá trình nuôi cấy do đó sự pha loãng là do sự
thêm vào môi trường mới không được thể hiện ở tất cả các giá trị của sinh khối và
cơ chất được quan sát, như trường hợp với pulse feeding có lẽ vì cơ chất cho vào
được sử dụng một cách nhanh chóng trong suốt thời gian bổ sung và sau đó quan
sát được rất ít sự ảnh hưởng của việc pha loãng trong việc bổ sung pulse lần thứ
hai và muộn hơn trong việc bổ sung không đổi (the constant feed). Sự phát triển
trong quá trình nuôi cấy đã chứng minh rõ ràng trạng thái ổn định giả (pseudo
steady state) đối với cơ chất và sinh khối trong suốt giai đoạn bổ sung không đổi
cho thấy việc bổ sung dinh dưỡng mới (the fresh nutrient feeding) làm cho cân
10
bằng một cách chính xác sự tăng trưởng và tốc độ tạo thành sản phẩm của sự nuôi
cấy.
- Ngoài ra sự bổ sung sorbitol trong giai đoạn bổ sung không đổi thì về cơ bản đã
duy trì tốc độ sản xuất luân chuyển cao ( high turn over production rates) và sự
nuôi cấy phát triển một cách mạnh mẽ ( đặc biệt với bất cứ độ pha loãng nào), cuối
cùng kết quả quá trình lên men đạt được năng suất cao. Nồng độ sorbose cao
(332.60 g/L) và năng suất sorbose cao ( 15.09gL
-1
h
-1
) thu được từ sorbitol bằng
multiple feeding thì tốt hơn so với pulse feeding .
Điều đó khá thú vị trong việc so sánh năng suất của quá trình lên men này với những

thì có khả thi về mặt kinh tế trong lên men công nghiệp theo quy mô lớn.
KẾT LUẬN
Sự cạn kiệt cơ chất trong quá trình lên men từ sorbitol thành sorbose được chỉ ra bởi sự
tăng lên đột ngột nồng độ oxy hòa tan. Sự cạn kiệt chất dinh dưỡng(cơ chất ) trong quá
trình lên men từ sorbitol thành sorbose bởi Acetobacter suboxydans đã bị loại bỏ bằng
cách áp dụng kỹ thuật "bổ sung khi cơ chất cạn kiệt ". Thiết kế lên men theo phương
pháp fed-batch sử dụng pulse-feed đã được thực hiện. 0.5 lít môi trường sorbitol( có chứa
11
600 g/L sorbitol ) là thêm vào trong bốn pulse-feed, mỗi một lần ngắn ( pulse) có dấu
hiệu do sự gia tăng đột ngột nồng độ DO trong quá trình lên men. Việc này dẫn đến tổng
năng suất của sorbose là 13.35 gL
-1
h
-1
và nồng độ sorbose cuối cùng là 320.48 g/L. Trong
một phương pháp fed-batch khác thiết kế hai lần ngắn, ( pulse ) của chất dinh dưỡng tự
nhiên (0.5 lít, nồng độ sorbitol 600 g/L ) đã được thêm vào và sau đó chất dinh dưỡng tự
nhiên được cung cấp không đổi (nồng độ sorbitol 600 g/L ) được duy trì với tốc độ 0,36
L/h trong các bình phản ứng cho đến khi nó đầy. Dựa trên kết quả quá trình lên men theo
phương pháp fed-batch nồng độ sorbose tích lũy được là 332,60 g/L với tổng năng suất là
15,09 gL
-1
h
-1
. Theo pulse feed, bổ sung cơ chất chậm và liên tục trong suốt thời gian phát
triển theo cấp số nhân sẽ thu được nhiều lợi ích trong việc cải thiện năng suất lên men
cũng như hàm lượng sinh khối và sản phẩm hiện tại không giảm đáng kể trong bình phản
ứng. Hàm lượng sorbose cao và năng suất thu được cho thấy quá trình lên men theo
phương pháp multiple feeding tốt hơn quá trình lên men theo phương pháp pulse feeding.
REFERENCES