Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TIỂU LUẬN
HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài:
DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ
- 1 -
Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:
PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Nguyễn Thị Ái Nhi
Lớp: LL&PP dạy học sinh học- K22
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Huế, 01/2014
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS
Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy giúp em nắm
vững kiến thức trên lớp học. Xin chân thành cảm ơn
các anh chị, các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài
Học viên :
Nguyển Thị Ái Nhi
- 2 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 5
CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP 6
CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR 8
II.1 Các enzyme cắt giới hạn 8
II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì? 8
II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn 8
II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn 8
Vào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đã
tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới hạn cắt
các phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau và nối các đoạn DNA đó bằng enzyme
nối ligase. Phương pháp này ngày càng được mở rộng, đến năm 1973- 1974, nhóm
nhà khoa học Cohen, Henlinski, Boyer đã tạo ra DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh
học. Kỹ thuật mới này được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm invitro để tạo
thành các DNA có hoạt tính, sau đó đưa và gắn vào phân tử DNA khác trong tế
bào sống.
8/1978 Boyer là người cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli. Các
thành tựu đầu tiên này đã mở ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là
công nghệ DNA tái tổ hợp.
Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen
hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được
dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA.
Từ những lí do trên tôi chọn đề tài tiểu luận của mình là: “ DNA tái tổ hợp
và ứng dụng của nó”
- 5 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1
KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP
DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn
vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kĩ thuật ghép
nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài
khác nhau.
Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,
tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:
Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi cho tế
bào cho (ví dụ tế bào của người) để cung cấp DNA.
Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được
giới hạn. Chúng đều đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và
DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau. Cụ thể, các enzyme sửa đổi
(methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl ( -
CH
3
) ở một số baze nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đích (target
sequence). Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hóa hoạt
tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc hiệu chừng nào
nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn
- 8 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
đóng vai trò là rào cản bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm
nhập của các phage lạ.
II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn
Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ở các
eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thống
được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme
được chiết xuất. Chữ cái đầu tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái
tiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để
chỉ nòi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòi
người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống.
Tính chất quan trọng nhất của enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa
là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc hiệu để cắt ở vị trí xác định. Tùy
theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại chính:
- Loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận
biết.
- Loại II bao gồm enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Các
enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng cho phép
thao tác các gen trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn, 4-8 cặp bazo và
đây. Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi các phage
tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính ( positive plaques) trên
nền vi khuẩn.
- 10 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ
Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụng
như:
- Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng. Hệ thống tế
bào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng.
- Dùng để biều hiện gen, đặc biệt ở các sinh vật nhân chuẩn bậc cao như
động vật, thực vật. Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính phù hợp.
- Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp.
Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một loại tế bào chủ thích hợp. Các tế bào chủ
có thể chia làm hai hệ thống chính. Đó là các tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủ
nhân chuẩn.
III.1 Tế bào chủ nhân sơ
Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhân
giống, lại chấp nhận được nhiều vector. Vi khuẩn E.coli đáp ứng các yêu cầu của tế
bào chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen. Do
tính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơ
chế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau. Các nghiên cứu đó làm
cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và công nghệ di truyền.
E.coli là vi khuẩn gram âm, có hình que (dài khoảng 1 micromet), không
gây bệnh, thường gặp trong ruột người. E.coli có 1 nhiễm sắc thể (phân tử DNA)
dạng vòng nằm trong vùng nhân. Kích thước của các phân tử DNA này khoảng
4x10
6
cặp bazo. Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã được xảy
ra đồng thời. Sau khi mARN được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà
- Một số S.cerevisiae có khởi điểm ( promoter) mạnh và có plasmid dùng
làm vector YAC biểu hiện gen.
- S.cerevisiae có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như đường
hóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ các hoạt tính sinh học.
- S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó, nếu
đưa gene lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ tinh sạch.
- S.cerevisiae là loài nấm men được sử dụng rộng rãi trong lên men bánh
mì, lên men rượu, bia. Do đó nó được công nhận là vi sinh vật an toàn,
hầu như không tạo ra độc tố.
- Hệ gen của S.cerevisiae có khoảng 1,35x10
7
cặp bazo đã được giải trình
tự vào năm 1996 và có kích thước nhiều hơn E.coli khoảng 3,5 lần.
Các vi nấm khác cũng được sử dụng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm tạo dòng
gen như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, hoặc pechia pastoris.
Vector biểu hiện gen ở tế bào S.cerevisiae cũng như ở sinh vật nhân chuẩn khác
chúng bao gồm khởi điểm (P- promoter), điểm kết thúc ( T- terminator), khởi điểm
sao chép của E.coli (ori E); khởi đầu sao chép ở tế bào Eukaryota ( ori
euk
); các gen
đánh dấu chọn lọc (ESM); các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn (MCS
multicloning site: điểm tách dòng)
III.2.2 Các tế bào chủ thực vật
Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong các
thí nghiệm thao tác gen. Tảo đơn bào, ví dụ như laoif Chramydomonas rainhardii
có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của
tế bào thực vật. Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thí
nghiệm taho tác di truyền, trong công nghệ di truyền. Tuy nhiên, người ta cũng còn
dùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùng
làm tế bào chủ.
công nghệ DNA tái tổ hợp. Toàn bộ các phân tử DNA của một loài sinh vật được
tách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học, hoặc dùng enzyme giới hạn. Công
đoạn sau đó là gắn các đoạn này vào plasmid. Phương pháp này được sử dụng ngân
hàng DNA của cả hệ gen. Ví dụ, việc lập ngân hàng hệ gen của người được tiến
hành như sau: Đầu tiên tách hệ gen người thành các đoạn DNA dài 300-400kb rồi
gắn vào các vector YAC, hoặc BAC để tạo dòng. Từ các dòng 300-400kb lại lại cắt
thành các đoạn DNA dài từ 30-40kb rồi gắn vào các cosmid. Từ đoạn 30-40kb lại
được cắt thành các đoạn DNA dài trung bình khoảng 4kb, sau đó gắng vào các
plasmid.
b. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học
- 15 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Muốn tổng hợp hóa học đoạn DNA hay một gen cần phải biết trình tự các
đoạn DNA hay gen đó. Sử dụng các máy tổng hợp DNA tự động (DNA
synthesizer). Phương pháp tổng hợp gen bằng con đường hóa học, ví dụ đầu tiên là
tổng hợp gen mã hóa cho hoocmon somarostatin co 14 axit amin được biểu hiện
trong vi khuẩn E.coli. Các nòi E.coli có thể sản sinh ra khoảng 3 triệu phân tử
hoocmon sinh trưởng người có hoạt tính tương tự hoocmon sinh trưởng tự nhiên.
c. Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA):
Đây là phương pháp tạo gen từ mARN nhờ enzyme phiên mã ngược
(reverse transcriptase). Đầu tiên, từ mARN tổng hợp được cDNA mạch đơn. Nhờ
enzyme phiên mã ngược nên bất cứ gen nào có mARN, hoặc một đoạn
polyribonucleotit tổng hợp bằng con đường hóa học đều có thể tổng hợp cDNA.
Từ các cDNA mạch đơn có thể tạo thành cDNA mạch kép nhờ có enzyme DNA
polymerase. Các cDNA mạch kép được gắn vào plasmid để tạo ra plasmid tái tổ
hợp.
Ngân hàng DNA bổ trợ có nhiều ưu thế vì các dòng cDNA chứa đoạn trình
tự nucleotit chỉ gồm các đoạn mã hóa của một gen. Mặt khác, có thể tạo ra những
tế bào vi khuẩn chuyên hóa chỉ tạo ra một loại protein tương ứng với một mARN
cụ thể, từ đó sản phẩm tạo ra dễ được tinh sạch và được sản phẩm như mong
+ Xử lý cDNA mạch kép để tạo dòng cDNA đầu bằng nhờ việc sử dụng
enzym S
1
nuclease.
+ Xử lý các dòng cDNA đầu bằng, bằng enzym terminal tranferase cùng với
oligo (dC) để tạo đầu mút 3’CCCCC.
+ Xử lý plasmid có đoạn trình tự nhận biết của enzym giới hạn REPstI bằng
enzym giới hạn PstI, sau đó ủ với enzym terminal transferase cùng với oligo (dG)
để tạo đuôi 3’GGGGG.
- 17 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
+Trộn lẫn các dòng cDNA và plasmid sau khi xử lý với nhau. Các đầu mút
của hai loại đuôi bổ trợ sẽ bắt cặp bổ sung với nhau. Do vậy, đoạn DNA lạ (từ
cDNA) bắt cặp với plasmid. Nhờ có enzym DNA polymerase I và ligase chúng sẽ
nối với nhau tạo ra plasmid tái tổ hợp.
IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp
Sau khi plasmid tái tổ hợp, hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành, bước tiếp
theo là biến nạp chúng vào tế bào chưa mang plasmid chứa gen lạ, ví dụ biến nạp
vào E.coli. Biến nạp được thực hiện bằng nhiều cách khác nhau.
- Xử lý tế bào chủ nhận bằng hóa chất: Xử lý tế bào vi khuẩn E.coli bằng
CaCl
2
lạnh, kẽm sốc nhiệt (42
o
C trong 2 phút) rồi ủ plasmid tái tổ hợp làm cho khả
năng dung nạp tăng lên hàng trăm lần. Sau khi plasmid mang đoạn DNA lạ biến
nạp chui được vào tế bào E.coli, chúng vẫn còn nguyên ven, đồng thời tế bào chủ
vẫn sống bình thường. Trong quá trình sinh trưởng của E.coli, plasmid tái tổ hợp
được sao chép tạo thành dòng DNA (gen) lạ. Để xác định tế bào chủ E.coli đã tiếp
nhận plasmid tái tổ hợp hay chưa, người ta gắn gen kháng với chất kháng sinh vào
Có 3 hướng chính để chọn lọc dòng DNA là lai axit nucleic dùng mẫu ARN
dò đặc hiệu, phát hiện bằng kiểu hình, hoặc phát hiện bằng phản ứng miễn nhiễm
tùy theo tính chất của dòng gen.
Ví dụ, chọn lọc dòng mang đoạn DNA của ribosome bằng phương pháp lai
axit nucleic được tiến hành như sau:
- Các dòng ADN tái tổ hợp được phân bố đều trên mặt thạch của đĩa petri
chứa môi trường nuôi cấy.
- Đóng dấu các dòng này trên màng lọc nitro-cellulose, hoặc màng nilon
filter. Các tế bào sẽ vỡ ra và DNA thoát ra ngoài.
- Biến tính các dòng DNA bằng nhiệt độ cao.
- Nhúng màng lọc vào mẫu dò ARN đã đánh dấu phóng xạ.
- 19 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
- Các dòng chứa rARN tương ứng với mẫu dò ARN sẽ lai với nhau và tạo
thành đoạn mạch kép.
- Loại bỏ các phần không lai.
- Đặt miếng phim phát quang phóng xạ lên màng lai. Những phần xuất hiện
trên ảnh phóng xạ tự ghi biểu hiện tương ứng với các DNA bổ trợ với mẫu dò
ARN. Từ đó tách được dòng DNA mong muốn.
b. Biểu hiện của gen mong muốn
Muốn gen đã được tạo dòng biểu hiện ra các protein cần phải có vector biểu
hiện mang đầy đủ yếu tố phiên mã và dịch mã. Đối với các dòng gen ở động vật có
vú tạo ra sản phẩm là các protein có hoạt tính sinh học, chúng ta cần với số lượng
lớn và có giá trị thương mại. Sự biểu hiện của các gen này trong tế bào E.coli cần
lưu ý một số nhân tố sau:
- Số lượng bản sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần hợp lý.
- Phải có khởi điểm phiên mã mạnh.
- Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã.
- DNA tái tỏ hợp có sự ổn định lâu dài trong E.coli
- Không có sự phân giải protein của các enzym trong tế bào chủ.
xác định được cấu trúc của gen mã hóa LP, một enzym có vai trò quan trọng trong
sự chuyển hóa Lipoprotein. LP có khoảng 30 Kb
+ Gen của bệnh nhầy nhớt (Mucoviscidosse): Mucoviscidosse là một bệnh
di truyền, trong đó những tuyến ngoại tiết, tiết ra một chất nhầy rất quánh. Bệnh
tác động chủ yếu lên tụy và những tuyến của biểu mô. Mồ hôi có nồng độ cao bất
thường của Cl
-
và Na
+
. Gen của Mucoviscidosse đã được biết và xác định trình tự
năm 1989, gồm 280 Kb. Gen này mã hóa một protein gồm 1480 acid amin có tên
là “CFTR”. CFTR tham gia vào sự vận chuyển Clo qua màng (từ trong ra ngoài tế
bào)
Gen của bệnh loạn dưỡng cơ của Duchenne (DMD): Gen này là gen dài
nhất được biết: nó gồm trên 2000 Kb và trên 75 exon.
V.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với y- dược học
V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y-sinh học bằng công nghệ DNA tái tổ hợp
Nếu như vào năm 1972, giáo sư Roger Guillemin (pháp) phải dùng tới
500.000 não cừu mới tinh chiết được vài miligram somatostatin, một hoocmon
sinh trưởng của vùng dưới đồi thị (với công trình này đã được giải nobel năm
1980), thì vào 10/1977 Hebert Boyer (Mỹ) đã chế tạo thành công hormon này từ
E.Coli bằng phương pháp DNA tái tổ hợp. Đến 8/1978 chính Boyer lại là người
cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli. Các thành tựu đầu tiên này đã mở
ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là công nghệ DNA tái tổ hợp.
- 22 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
Sau đó hàng loạt các chế phẩm khác như các hormon tăng trưởng của người
(HGH), bò (BGH), lợn (PGH), các vaccine và các interferon phóng chống căn
bệnh nan y ở người như ung thư, viêm gan và một số bệnh quan trọng ở gia súc
như hiện tượng “lở mồm - long móng” do virus gây ra tất cả đều được sản xuất
(iii) Phát hiện một số protein có ý nghĩa trong chẩn đoán khối u hoặc một số tính
trạng trước khi sinh.
- 24 -
Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó
(iv) Phát hiện các thuốc bị cấm có trong máu,hoặc kiểm tra nồng độ thuốc có trong
máu và tổ chức nhằm đảm bảo liều thuốc sử dụng sao cho không vượt quá ngưỡng
gây độc v.v
Nhờ có tính đặc hiệu và chính xác cao và sử dụng dễ dàng, việc sản xuất
các kháng thể đơn dòng đã tạo nên một nhánh phát triển mau lẹ nhất của công nghệ
sinh học, và cùng với việc sản xuất văcxin chúng đã trở thành những phương tiện
quan trọng nhất trong chính sách y tế cộng động của các nước đang phát triển và
xét về lâu dài, việc ứng dụng các kháng thể đơn dòng có triển vọng chữa được
nhiều bệnh trong đó có các khối u ác tính.
- 25 -
Hình.Vaccin phòng tránh một số
ung thư
Hình: Sản xuất vaccin tả ở quy
mô lớn
Copyright: Tài liệu đại học ©