RNA CAN THIỆP
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TIỂU LUẬN
HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ
Đề tài:
ARN CAN THIỆP
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 1
Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:
PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Phạm Thị Việt Hà
Lớp: Thực vật học - K22
Huế, 01/2014
RNA CAN THIỆP
A. ĐẶT VẤN ĐỀ
RNA Can thiệp (RNA inteference, RNAi) là một trong những đột phá
công nghệ quan trọng nhất trong sinh học hiện đại. Phát minh RNA can
thiệp – một cơ chế điều khiển hoạt hóa gen mới, mang tính đặc thù cao và
tính phổ biến rộng ở sinh vật nhân chuẩn. RNAi có thể làm ngừng hoàn toàn
( knock out) hoặc làm giảm ( knock down) biểu hiện của gen đặc thù. Hoạt
động của RNAi làm cho cơ thể phân hóa và phát triển bình thường, có khả
năng miễn dich với các tác nhân gây bệnh nhất là virus. Dựa trên cơ chế này,
khoa học hiện đại đã biến chúng thành một công cụ để chữa bệnh và chống
lại các tác nhân gây bệnh ở thực vật, động vật.
B. NỘI DUNG
I. GIỚI THIỆU VỀ RNA CAN THIỆP
1. Khái niệm RNAi
RNA can thiệp ( RNAi, RNA interference ) là một hệ thống bên
trong các tế bào sống , giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động. Đó là
những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự
tương đồng với nó.

"quelling".
Năm 1995, trên tạo chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và
Kemphues đã đưa ra bằng chứng đều tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 3
RNA CAN THIỆP
elegans rằng phân tử RNA chiều thuận vẫn có thể gây ra ức chế gen với hiệu
quả tương đương với phân tử RNA chiều ngược. Trong thí nghiệm này các
tác giả đã tiêm phân tử RNA chiều ngược vào trong C.elegans để ức chế gen
par-1 nhằm xác định chức năng của gen này và đồng thời cũng tiến hành thí
nghiệm tương tự với phân tử RNA chiều thuận. Kết quả là các phân tử RNA
của cả hai chiều đều ức chế sự biểu hiện của gen par-1. Điều này gây ra một
sự lúng túng bởi vì điều mong đợi nhất của các nhà khoa học là phân tử
RNA sẽ bắt cặp với mRNA chiều thuận (sense mRNA) của gen par-1 nhằm
ức chế khả năng mã hóa protein của nó.
Phải đến 3 năm sau, năm 1998, nhóm nghiên cứu của Fire đã giải
thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm cũng trên tuyến trùng
C.elegans. Mục đích của những thí nghiệm này là kiểm tra xem sự hỗ trợ lẫn
nhau giữa các phân tử RNA theo cả hai chiều trong quá trình ức chế sự biểu
hiện của gen. Kết quả là phức chất dsRNA ức chế sự biểu hiện của gen gấp
10 lần so với việc dùng phân tử RNA đơn lẻ theo chiều thuận hay chiều
nghịch. Hơn thế nữa khi loại bỏ dsRNA thì các phân tử đơn RNA theo chiều
thuận hay chiều nghịch dần dần mất tác dụng ức chế gen. Như vậy nhóm
nghiên cứu của giáo sư Fire đã xác định được nguyên ngân chủ yếu của hiện
tượng RNA silencing chính là do phân tử dsRNA gây nên. Hiện tượng này
được các nhà khoa học đặt cho một thuật ngữ là RNA interference (RNAi).
Việc tiêm mRNA mã hóa protein cơ không gây ra sự thay đổi nào ở giun.
Mã di truyền của mRNA được mô tả như là một trình tự “có ý nghĩa”
(sense). Việc tiêm RNA “vô nghĩa” (antisense), một trình tự bổ sung với
mRNA, cũng không mang lại tác động nào. Nhưng khi Fire và Mello tiêm
RNA “có ý nghĩa” và “vô nghĩa” cùng với nhau thì họ quan sát thấy giun có

“ di căn” giữa các tế bào.
Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế
RNAi của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig Mello
(ĐH Massachusetts).
Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu:
+ Cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thưc vật:
Phiên mã bổ nhiệm gen im lặng ( PTGS- post transcriptional gene silening )
từ đó làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong
nhiều năm trước đây.
+ Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin
di truyền trong tế bào
+ RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng
của gene.
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 6
RNA CAN THIỆP
+ Với nghiên cứu mới này , giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng
dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh băng liệu pháp
gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra
các sản phẩm với chất lượng tốt hơn.
+ Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu
và được tạp chí Science bình chọn là “ Break Through in 1998 “(Bước đột
phá của năm 1998 ) dựa theo số lượng ra tăng cấp số nhân các bài báo khoa
học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu.
Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng
RNAi trên loài ruồi dấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard
Cathew tiến hành. Nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng tiêm phân tử
dsRNA vào trong các phôi tế bào của ruối hay dùng súng bắn gen dẫn đến
hiện tượng silencing hiệu quả hơn là dùng các tế bào yeast chứa các dsRNA
cho ruồi dấm ăn. Bằng phương pháp tiếp cận này mà nhóm nghiên cứu của
Cathew đã ức chế được khoảng 20 gen của loải ruồi dấm bao gồm frizzled2

kép và loại trừ RNA mạch đơn tương đồng giúp đề xuất can thiệp RNA cấu
tạo nên cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của virus .Tế bào thực vật có
cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của virus dựa trên hiện tượng gen im
lặng PTGS , đề xuất ứng dụng của can thiệp RNA liên quan tới sự bảo vệ tế
bào chống lại sự xâm nhập của virus.
b. Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen.
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 8
RNA CAN THIỆP
Người ta đã đề xuất sớm rằng RNAi/PTGS ở C.elegans và thực vật
có thể cản trở hoạt động của transposon (các nhân tố di động trong hệ gen).
Tiếp theo, có thể nhận thấy trong cơ chế can thiệp RNA bị đột biến ở
C.elegans, transposon được hoạt hóa và nhân tố di động này là nguyên nhân
xáo trộn chức năng hệ gene. Từ đó các nhà khoa học đề xuất rằng
transposon-chứa đựng những vùng hệ gen chứa cả mạch DNA được phiên
mã, RNA mạch kép được định dạng và quá trình can thiệp RNA loại trừ
những sản phẩm không phù hợp. Như thể là RNA mạch kép ngắn cũng có
thể chỉ đạo điều hành nhiễm sắc tử và tăng cường phiên mã, điều này sẽ gây
nên sự bất hoạt transposon . Ngay nếu như cơ chế này vẫn chưa sảy ra, thì rõ
ràng rằng nếu cơ chế can thiệp RNA không có hiệu lực, các transposon
không bi giữ lại bởi kiểm soát dưới, nó có thể bắt đầu nhảy và là nguyên
nhân của hiệu ứng có hại của hệ gen.
Điều đó chứng tỏ RNA im lặng có thể tái hiện một sự "bảo vệ miễn
dịch" của hệ gene. Gần 50% hệ gene chúng ta có virus và nhân tố transposon
mà chúng phải xâm lấn hệ gene chúng ta trong một khóa học tiến hóa. Cơ
chế can thiệp RNA có thể nhận ra sự xấm lấn của virus RNA mạch kép
(hoặc mạch kép sao chép định dạng từ virus RNA) và tăng cường lây nhiễm
bởi sự suy thoái RNA. Hệ thống can thiệp RNA vì thế chia sẻ những điểm
đặc biệt quan trọng với hệ thống miễn dịch động vật có xương sống: nó nhận
ra các điểm xâm lấn (RNA mạch kép), nuôi dưỡng các phản ứng đáp ứng
ban đầu và tiếp theo khuyếch đại để loại trừ nhân tố ngoại lai.

RNA CAN THIỆP
tăng cường phiên mã. Thêm vào đó, cơ chế can thiệp RNA điều hòa hoạt
động những gene nằm trực tiếp kế bên khối nhiễm sắc đặc. Hiện tượng này
khó giải thích ở mức độ phân tử, mặc dù quá trình biến đổi histone - vị trí
bám chuyên biệt của protein làm cô đặc nhiễm sắc thể (HP1) và methyl hóa
DNA đều đóng vai trò quan trọng. Tuy thế, hoạt động này trên nhiễm sắc tử
là khá quan trọng cho chức năng chính xác của hệ gene và bảo quản hệ gene
được nguyên vẹn.
e. Can thiệp RNA cống hiến một phương pháp mới để kiềm chế gene
chuyên biệt.
Mục tiêu hoạt động của can thiệp RNA trực tiếp đề xuất rằng hiện
tượng này có thể sử dụng như một phương pháp kiểm soát hoạt động của
gen với kiểu hình có thể dự đoán trước nhờ đó mà có thể nghiên cứu được
chức năng của các gen chưa biết trong tổ chức. Sau những nghiên cứu ban
đầu được tìm thấy ở C.elegans, kỹ thuật này gần như có thể ứng dụng được
trên một phạm vi rộng , từ tế bào đến hầu hết các tổ chức khác, kể cả tế bào
động vật có vú. Can thiệp RNA vừa có một ý nghĩa to lớn trong việc nghiên
cứu chức năng các gene riêng biệt. Kỹ thuật này bây giờ được khai thác
không những trong nuôi cấy tế bào mà còn trong cấy chuyển gene. Khung
DNA được gửi gắm vào trong các tổ chức dưới sự kiểm soát của đoạn khởi
động (promoter), và RNA mạch kép cấu trúc thể kẹp tóc được sản xuất và
hoàn thiện hơn nữa để đạt tới những hiệu ứng chuyên biệt trong điều hòa
hoạt động gene.
f. Can thiệp RNA đã đề xuất một giải pháp hiệu quả trong điều trị
bệnh di truyền trong tương lai.
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 11
RNA CAN THIỆP
Khả năng can thiệp của RNA chi phối điều hoà hoạt động gene đặc
biệt là trong cấy chuyển gene đã khuyến khích những nghiên cứu sâu hơn về
vaan đề này, mặt khác có thể là một lựa chọn hữu dụng trong điều trị y học.

protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết
RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA.
Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế : siRNA và
miRNA. Ngoài những yếu tố trên, bộ máy RNA can thiệp thông qua
miRNA còn chứa một số thành phần: Pri- mRNA( primary-mRNA ) là chuỗi
mRNA nguyên thuỷ, dài hàng nghìn nu và mang đầu 5’CAP, đuôi poly A
chứa ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc ( hairpin ) mỗi vòng dài khoảng 70
nu; Hai enzyme cắt: Drosha hoạt động ở trong nhân tế bào và Dicer hoạt
động ở ngoài tế bào chất.
2. Cơ chế RNA can thiệp
a. Cơ chế chung
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 13
RNA CAN THIỆP
Hình 2. Cơ chế RNAi
Quá trình RNAi bao gồm các bước: RNA sợi kép bị cắt thành những
mảnh nhỏ (siRNA) bởi dicer. Sau đó, sợi kép ngắn lại được mở xoắn để tạo
ra hai sợi đơn ngắn và một trong hai sợi đó là sợi là sợi antisence (sợi đối
nghĩa). Sợi antisence ngắn (siRNA) được nạp vào phức hợp risc và antisence
RNA trong phức hợp risc này bắt cặp với mRNA bằng liên kết tương đồng
với các base. Tiếp theo risc sẽ phân hủy mRNA.
Ngoài ra, trong cơ chết gây bất hoạt gen ở giai đoạn phiên mã (TGS),
các phân tử siRNA ngăn cản phiên mã, khống chế số lượng phân tử mRNA.
Cơ chế này xãy ra trong nhân và đích chịu tác động là DNA, gen ( Matzke et
al., 2004; Huettel et al,. 2007). Enzyme methyl hóa DNA ( DNA
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 14
RNA CAN THIỆP
methyltransferase) gắn nhóm methyl vào cytosine (C) ngăn cản quá trình
phiên mã. Enzyme biến đổi nhóm chức của protein( histon) nằm trong lõi
nucleosome . Ví dụ như gắn thêm nhóm methyl hoặc khử nhóm acetyl ở một
số amino acid đặc biệt trên protein histon làm thay đổi cấu trúc không gian

đến các phân tử mRNA có trình tự bổ xung với nó.
Cơ chế tắt gen lúc này phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa siRNA
và mRNA đích. Nếu Sự tương đồng giữa siRNA và mRNA đích là hoàn
toàn thì phân tử mRNA có xu hướng bị cắt và phân giải ( do hoạt tính
nuclease của RISC ) kết quả không có mRNA mã hoá cho protenin đó. Nếu
sự tương đồng giữa siRNA và mRNA chỉ là một phần thì xu hướng xảy ra là
sự ức chế dịch mã do khi chúng bám trên mRNA ngăn cản sự dịch chuyển
của Ribosome trong quá trình dịch mã làm cho quá trình dịch mã bi ngưng
lại kết quả không tạo ra được protein.
Ngoài ra, RISC cũng có thể xâm nhập được vào nhân tế bào và kết
cặp với trình tự tương đồng trên phân tử DNA hệ gen. Nó huy động một số
protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter của gene đẫn đến
kìm hãm phiên mã.
c. Cơ chế làm câm gen bởi miRNA
Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear ) và trong
tế bào chất ( cytoplasma ).
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 16
RNA CAN THIỆP
Hình 3. Cơ chế siRNA và miRNA
- Trong nhân :
Các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các
gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ ( pri- miRNA ), các phân tử này
có chúa các cấu trúc kẹp tóc ( hairpin ). Các phân tử pri- miRNA được cắt
bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre- miRNA ( phân tử tiền
microRNA ). Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào
chất.
- Tại Tế bào chất :
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 17
RNA CAN THIỆP
Trong tự nhiên, ngoài cơ chế điều hòa biểu hiện gene bằng sợi siRNA

dụng công nghệ RNAi trong y học ( Dorsett, Tuschl, 2004; Hannon,
Soutschek et al., 2004). Nhờ vậy, đã xác định RNAi là một quá trình đặc biệt
và đã được kiểm chứng để làm bất hoạt bất kỳ một gen nào ở bất cứ tế bào
nào trong cơ thể đa bào. Các ứng dụng lâm sàng đầu tiên của can thiệp
RNA đã được hướng vào việc điều trị liên quan đến thoái hóa điểm vàng
(AMD), gây mù hoặc tầm nhìn hạn chế trong hàng triệu người lớn tuổi.
Phương pháp điều trị dựa trên RNAi cũng đang được phát triển chống lại sự
xâm nhiễm của virus, bao gồm virus suy giảm miễn dịch của con người
(HIV), viêm gan B và virus C (HBV và HCV), và virus hợp bào hô hấp
(RSV). Chiến lược điều trị các bệnh thoái hóa thần kinh và ung thư cũng
được tiến hành.
Các nhà khoa học hiệp hội ung thư Mỹ cho biết mRNA đóng vai trò
đặc biệt quan trọng trong phát triển bệnh ung thư. Các báo cáo khoa học của
viện Massachusett (MIT) và đại học Harvard năm 2005 cho biết, các mRNA
đóng vai trò qua trọng đối với sinh trưởng, sinh sản và biệt hóa tế bào ở
người. Khi có những thay đổi trong sinh tổng hợp mRNA sẽ dẫn đến các
bệnh ung thư khác nhau. Họ cho biết có thể dễ dàng phân biệt các tế bào ung
thư với tế bào lành và phân biệt các bệnh ung thư khác nhau thông qua sự
khác biệt giữa các mRNA. Hiện nay đã tìm thấy trên 200 các mRNA khác
nhau ở các bệnh ung thư khác nhau. Khả năng điều trị bệnh ung thư bằng
công nghệ RNAi là rất lớn. Đại học Purdue đã thiết kế các hạt nano( phải có
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 19
RNA CAN THIỆP
kích thước nhỏ hơn 100nm đễ lọt qua màng tế bào ) mang các RNA ngắn
nhằm đưa RNAi vào tế bào ung thư với mục đích làm làm bất hoạt các gen
ung thư bướu ( oncogenes).
Công ty Benitec Ltd ( BLT) là công ty đầu tiên sữ dụng RNAi trong tế
bào người và đã được cấp các bản quyền công nghệ tại Mỹ và Anh có giá trị
từ năm 1998. Đó là một kỹ thuật có tính cách mạng đễ làm ngừng biểu hiện
gen ở bất kỳ tế bào nào thông qua RNAi. Bản quyền 6,573,099 tại Mỹ là “

Yellw Dwarf Virus – BYDV) ( Wang et al., 2000).
Tiến sĩ Van Hulten ở CSIRO, cho biết hàng năm bện đốm trắng ở tôm
gây tổn thất khoảng một tỷ đôla cho công nghiệp nuôi tôm toàn cầu. Công
nghệ RNAi là một trong những cơ chế tự bảo vệ của thế bào chống lại virus.
Khi tế bào phát hiện một sơi RNA kéo, nó sẽ sản sinh ra một loại enzyme
gọi là Dicer đễ cắt đứt sợi RNA kép đó, do vậy tiêu diệt virus xâm nhập.
Nhóm của Hulten đã xác địch được gen chịu trách nhiệm tổng hợp enzyme ở
tôm. Nhờ đó họ cho rằng tôm cũng có cơ chế bảo vệ nhờ RNAi. Tiến sĩ Tim
Doran thuộc CSIRO cho biết họ đang sữ dụng công nghệ RNAi để xỹ lý
nhiều loại bệnh khác nhau ở vật nuôi trong đó có bệnh cúm gà là một bệnh
đang lây lan mạnh ở châu Á và bệnh Marek ở gia cầm. Tiến sĩ Jef Hammond
thuộc CSIRO đang nghiên cứu kỹ thuật RNAi đễ kiểm soát bệnh lỡ mồm
lông móng. Người ta hy vọng có thể sữ dụng cho nhiều loại động vật để
kiểm soát các bệnh virus khác nhau. Xữ lý RNAi có thể làm ngừng quá trình
sinh sản ở virus ở bất kỳ động vật nào, làm giảm sự lây truyền của nó.
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 21
RNA CAN THIỆP
Hiện nay, RNAI là một chiến lược chủ lực trong công nghệ sinh học ở
CSIRO. CSIRO đang phát hiện các sản phẩm RNAi cho bảo vệ thực vật, vật
nuôi, thủy sản và phát triển các nghành công nghiệp dược và y sinh.
Các nhà khoa học Brazil gần đay đã công bố tạo được giống đậu
( Phaseolus vulgaris L.) kháng được bênh xoắn lá do virus Bean golden
mosaic virus ( BGMV) gây ra bằng chuyển gen gây bất hoạt gen AC1 của vi
rurus này ( Bonfim et al., 2007). Virus này cùng nhóm với virus gây bệnh
xoắn lá cà chua, tác hại nghiêm trọng đối với sản xuất.
Nhóm nghiên cứu của Keerti Rathore thuộc viện nghiên cứu
Genomics và công nghệ sinh học thuộc đại học Texas đã sữ dụng kỹ thuật
RNAi để loại trừ độc tố ở hạt bông( Gonesan et al., 2006). Họ đã thiết kế
gen tổng hợp RNA sợi kép có khả năng gây bất hoạt gen có vai trò quyết
định đối với sinh tổng hợp độc tố Gosypol của hạt bông. Họ đã sữ dụng một

cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các
cây chuyển gen.
Cho đến nay đã có nhiều loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus
được công nhận và trồng thương mại như: đu đủ chuyển gen kháng bệnh
đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV); bí đao chuyển gen kháng ba loại
vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow
mosaic virus, ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, …
Ngoài ra còn rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác
đang trong giai đoạn khảo nghiệm để được công nhận là giống cây trồng
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 23
RNA CAN THIỆP
thương mại như: khoai mì chuyển gen kháng African cassava mosaic virus
(Begomovirus); bắp chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus);
khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X
(Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus);
lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); khoai lang chuyển
gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus)…. (Reddy và cs,
2009).
Đối với các virus RNA, tiêm vào lá của đậu lăng đen (Vigna mungo)
thông qua bắn phá một cấu trúc hpRNA có chứa các trình tự promoter của
virus khảm vàng geminivirus Vigna mungo (VMYMV) dưới sự kiểm soát
của promoter 35 S cho thấy hầu hết các cây chủ hoàn toàn hồi phục sau khi
bị lây nhiễm VMYMV như vậy chiến lược RNAi cũng có hiệu quả trong các
kỹ thuật để kháng virus DNA. Điều thú vị là, một báo cáo gần đây cho thấy
geminivirus gây bệnh khảm ở cây đậu vàng (BGMV) cũng có thể bị ức chế
bởi sự biểu hiện của gen chuyển hpRNA bắt nguồn từ một replicase mã hóa
chuỗi (AC1) cho thấy một geminivirus có thể là mục tiêu của cả hai cơ chế
PTGS và TGS.
Bằng chứng của ý tưởng cây chủ làm im lặng gen (HIGS) từ gen nấm
gần đây đã thu được ở nấm phấn trắng (Blumeria graminis) trên cây lúa

1. Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus.
HVTH: Phạm Thị Việt Hà 25