1

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
I.1. Đặt vấn đề
Fucoidan là một sulfate polysacarit chỉ có trong thành phần của
ngành rong nâu mà không có trong thành phần của các loài thực vật hay
động vật khác. Fucoidan có cấu trúc hóa học phức tạp bởi tính đa dạng
của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate
được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần chính
của fucoidan là fucose và sulfate, ngoài ra chúng còn có thêm các gốc
đường khác như galactose, glucose, manose, xylose,…và đôi khi là cả
gốc acetyl. Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt
tinh sinh học quý như kháng đông tụ máu, kháng ung thư, kháng viêm,
kháng virút, chống oxi hóa,… với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các
lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm chức năng và dược phẩm. Mặc dù có rất
nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan,
nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc
của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí
các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc
và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được
sáng tỏ. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên
các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc
xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều
tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Ở nước ta hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại,
trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với hơn
60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm. Tuy nhiên
cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ
thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan
từ rong nâu Việt Nam.

độc tế bào ung thư từ rong S. mcclurei đã được thiết lập. Mạch chính của
fucoidan SmF3 gồm →3)-Fucp(4,2SO
3
-
)-(1→3)-Fucp(4,2SO
3
-
)-(1→ họa
tiết xen vào các gốc (1→4)-Fucp(3SO
3
-
) và (→6)-Galp ở cuối đầu khử.
4/ Tất cả các phân đoạn fucoidan từ Sargassum mcclurei ít gây độc tế
bào và ức chế sự hình thành các tế bào ung thư kết tràng DLD-1, chính vì
vậy chúng là các tác nhân kháng ung thư tiềm năng
I.4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 113 trang: Mở đầu (02 trang), Nội dung chính gồm
98 trang được chia làm 03 chương gồm: Chương 1. Tổng quan (33 trang),
Chương 2. Đối tương, phương pháp nghiên cứu và thực nghiệm
(11 trang), Chương 3. Kết quả và thảo luận (52 trang), Kết luận và kiến
nghị (2 trang), Danh mục các công trình công bố có liên quan đến luận án
(01 trang), 143 tài liệu tham khảo (12 trang).
II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
MỞ ĐẦU
Phần mở đầu đề cập tính thực tiễn, ý nghĩa khoa học, đối tượng
nghiên cứu, mục tiêu và nhiệm vụ của luận án.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
Giới thiệu sơ lược về phân bố và phân loại rong nâu trên thế giới và
ở Việt Nam
Giới thiệu về fucoidan, tình hình nghiên cứu cấu trúc, hoạt tính sinh

2.2.4. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan:
được thực hiện theo phương pháp của
Likhitwitaywid và Colburn

2.3. Thực nghiệm
2.3.1. Phương pháp chiết và tách phân đoạn fucoidan từ rong nâu
Phương pháp chiết fucoidan: Fucoidan được thu nhận bằng cách
chiết rong trong dung môi axit HCl loãng (pH: 2-3) ở 70
o
C, trong thời
gian 2 giời (chiết lặp lại 3 lần). Dịch chiết được gom lại và cô đặc bằng
màng siêu lọc 10kDa, dịch chiết sau đó được kết tủa trong cồn 98% hoặc
đông khô để thu bột fucoidan.
Phương pháp tách phân đoạn fucoidan: Fucoidan sau khi được
phân lập từ rong nâu sẽ được tiến hành tách phân đoạn tinh chế bằng sắc
ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose.
2.3.2. Các phương pháp phân tích thành phần của fucoidan
Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: được thực hiện bằng
phương pháp so màu với phenol và axit sulfuric đậm đặc, ở λ = 490 nm.
Phân tích thành phần đường đơn: được thực hiện bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC), sau khi fucoidan được thủy phân bằng
trifluoroacetic axít.

4

Phân tích hàm lượng sulfate: được thực hiện bằng phương pháp đo
độ đục với BaCl
2
/gelatin, ở bước sóng λ = 360 nm
Phân tích hàm lượng axít uronic: được thực hiện bằng phương


Gal Xyl Glc
SO
4
2-

%
w/w
**
Axít
uronic
% w/w
**
1 S.swartzii 0,82 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8 20,40 14,28
2 S.oligocystum 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 3,4 22,46 21,54
3 S.denticapum 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20
4 S.mcclurei 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87
5 S.polycystum 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74
6 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35
7 Turbina ornata 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50
8 Padina australis 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02
* Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo
** Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: không phát hiện thấy

5

3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN
Để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành
thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trường axít. Việc thủy
phân hoàn toàn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trên

S.swartzii (20,40%),
Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác
định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn
tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích
các đặc trưng cấu của chúng.
3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA
CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii,
Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và
Turbina ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân
tích các đặc trưng cấu trúc của chúng. Vì đây là những loài rong phổ biến,
có trữ lượng lớn và có khả năng khai thác ở quy mô công nghiệp.
Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi
anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) được chỉ ra trên hình 3.2-
hình 3.6. Kết quả tách phân đoạn của các mẫu fucoidan cho thấy fucoidan
từ các loài rong S.denticapum, S.polycystum và S.mcclurei đều thu được
03 phân đoạn khác nhau. Kết quả này cho thấy fucoidan từ mỗi loài rong
này sẽ tồn tại ít nhất 03 kiểu cấu trúc khác nhau. Trong khi đó fucoidan từ
hai loài rong Turbinaria ornata và S.swartzii lần lượt thu được 04 và 05
phân đoạn khác nhau, như vậy fucoidan từ hai loài rong này cũng sẽ tồn
tại ít nhất là 04 và 05 dạng cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, các phân đoạn
tương ứng với mỗi loài rong được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl
khác nhau, như vậy có thể đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn tương
ứng với mỗi loài rong sẽ không giống nhau. Kết quả phân tích thành phần
hóa học của mỗi phân đoạn fucoidan từ 05 loài rong nghiên cứu ở trên
(bảng 3.2-3.6) cho thấy thành phần hóa học của các phân đoạn fucoidan
giữa các loài rong là khác nhau và trong cùng một loại rong cũng khác
nhau. Tuy nhiên, chúng đều có đặc điểm chung là hàm lượng sulfate
trong các phân đoạn fucoidan tăng dần theo nồng độ rửa giải của muối
NaCl, hàm lượng fucose và galactose tăng tỉ lệ nghịch với hàm lượng của

0,5
1
1,5
2
NaCl, M

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 100 200 300 400 500 600 700 800
V, ml
A, 490nm
0
0,5
1
1,5
2
NaCl, N

Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan
từ rong S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit ,

0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
V, ml
DO, 490nm
0
0,5
1
1,5
2
NaCl, M
SdF1
SdF2
SdF3
Hình 3.2. Tách phân đoạn fucoidan từ rong
S.denticapum bằng sắc ký trao đổi anion trên
cột DEAE-cellulose
Hình 3.4. Tách phân đoạn fucoidan từ
rong S.polycystum bằng sắc ký trao đổi
anion trên cột DEAE-cellulose
SpF1
SpF2
SpF3
0

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
V, ml
DO, 490nm
0
0,5
1
1,5
2
NaCl, M
SwF1
SwF3
SwF4
SwF5
SwF2
Hình 3.6. Tách phân đoạn fucoidan từ rong
Turbinaria ornata bằng sắc ký trao đổi
anion trên cột DEAE-cellulose
ToF1
ToF2
ToF3
ToF4

8

Bảng 3.3. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan
từ rong S.swartzii thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit, mol% Phân đoạn
fucoidan theo
nồng độ NaCl
Hàm

2-

(%)
Fuc Man Gal Xyl Rham Glc
SpF1-0,5М

18,3 56,43 20,11 28,0 26,7 12,7 11,3 13,1 8,2
SpF2-1,0М

43,2 59,15 25,67 59,2 6,0 26,6 0,2 8,0 nd
SpF3-1,5М

21,0 54,97 33,99 68,6 nd 26,9 4,5 nd nd
Bảng 3.5. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan
từ rong S.mcclurei thu được bằng sắc ký trao đổi anion
Thành phần monosacarit, % mol Phân đoạn
fucoidan
theo nồng
độ NaCl
Hàm
lượng
(%)
*
Tổng
carbohydrate
(%)
*
SO
4
2-


9

Theo các tài liệu đã công bố, fucoidan rong nâu nói chung và
galactofucan sulfate hóa nói riêng sở hữu phổ hoạt tính sinh học rất rộng
và đa dạng như hoạt tính kháng ung thư, kháng đông tụ máu, kháng vi
rút, Do vậy, trước khi tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về các đặc trưng cấu
trúc của fucoidan rong nâu Việt Nam nhằm mục đích ứng dụng chúng
làm thực phẩm chắc năng và dược liệu. Chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt
tính ức chế một số dòng tế bào ung thư người.
3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN
3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan
Fucoidan từ 06 loài rong S.mcclurei (F-Sm), S.polycystum (F-Sp),
S.swartzii (F-Ss), S.denticapum (F-Sd), S.oligocystum (F-So) và
Turbinaria ornata (F-To) được chúng tôi lựa chọn thử nghiệm hoạt tính
gây độc tế bào trên 05 dòng ung thư của người là ung thư gan (Hep-G2),
ung thư màng tim (RD), ung thư phổi (LU), ung thư ruột kết (DLD-1) và
ung thư vú (MDA-MB-231). Thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa
học các Hợp chất thiên nhiên-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Nga và Viện Sinh học và
Công nghệ sinh học - Hàn Quốc. Kết quả cho thấy tất cả các mẫu
fucoidan thử nghiệm đều cho kết quả dương tính với ít nhất 02 dòng tế
bào ung thư, trong đó fucoidan từ rong S.swartzii cho kết quả dương tính
trên 04 dòng tế bào ung thư (bảng 3.7 và 3.8).
Bảng 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan
từ 06 loài rong nâu của Việt Nam
Dòng tế bào ung thư của người Fucoidan
Hep-G2

RD

(µg/ml)
Dòng tế bào
Fucoidan
Hep-
G2
RD LU DLD-1
MDA-
MB-231
Kết luận
Chứng (+) 0,25 0,1 0,32 0,1 0,2
F-Sp 4,5 7,1 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng
F-Sm 2,4 20,0 CXĐ 6,5 CXĐ Dương tính 02 dòng
F-So 18,5 10,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng
F-Ss 3,8 16,7 15,5 CXĐ 5,4 Dương tính 04 dòng
F-Sd 8,1 15,4 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng
F-To 12,8 10,9 CXĐ CXĐ CXĐ Dương tính 02 dòng
3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân
lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei
Trong số 06 mẫu fucoidan được thử nghiêm hoạt tính gây độc tế
bào ở trên, chúng tôi lựa chon các phân đoạn của fucoidan từ S.swartzii
và S.mcclurei tiếp tục thử nghiệm với dòng tế bào ung thư vú và ung thư
ruột kết. Kết quả cho thấy tất cả các phân đoạn thử nghiệm đều cho kết
quả dương tính với các mức độ ức chế khác nhau (hình 3.7 và 3.8). Như
vậy có thể thấy hoạt tính sinh học của fucoidan phụ thuộc vào các yếu tố
đặc trưng cấu trúc của fucoidan
0
20
40
60
80

3.5 . ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
3.5.1. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR
Các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3, SmF3 và ToF2 từ 05 loài rong
có hoạt tính sinh học tốt, đồng thời có thành phần đường đơn giản nhất so
với các phân đoạn fucoidan còn lại được lựa chọn để phân tích các đặc
trưng cấu trúc. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của các phân đoạn
fucoidan đều thu được những dải hấp thụ chính ở số sóng từ 1240-
1272cm
-1
cho thấy sự có mặt của nhóm sulfate. Ngoài ra, các dao động
hấp thụ trong vùng số sóng từ 800-845 cm
-1
cho biết vị trí của nhóm
sulfate trên các gốc đường pyrannose (bảng 3.9).
Bảng 3.9. Một số vân phổ đặc trưng trong phổ hồng ngoại của fucoidan
được chiết tách từ một số loài rong nâu Việt Nam
Mẫu Số sóng dao động
đặc trưng (cm
-1
)
Vị trí nhóm sulfate
SdF3 847,90 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4
SpF3 835,40 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4
SwF5 803,77 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2
và/hoặc C3
SmF3

839,22 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4
ToF2 820,00 Nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C2
và/hoặc C3

12
O
6
) khác nhau, điều này rất khó để giải thích được một cách đầy
đủ về cấu trúc của chúng. Tuy nhiên, trên phổ
13
C-NMR của tất cả các
phân đoạn fucoidan đều có những đặc điểm chung để nhận biết fucoidan
thông qua các tín hiệu của gốc α-L-Fucp đó là những tín hiệu mạnh xuất
hiện trong vùng trường cao 15-18 ppm đặc trưng cho nhóm metyl (CH
3
-)
và các tín hiệu trong vùng trường thấp 97-102 ppm đặc trưng cho cacbon
α-anomeric (C1) của gốc đường 1→3)-α-L-fucopyranose, vùng tín hiệu
67-86 ppm là vùng của cacbon C2-C5 của vòng pyranoid. Bên cạnh đó,
phổ
13
C-NMR cũng cho thấy sự có mặt của gốc đường β-D-Galactose
thông qua các tín hiệu đặc trưng cho cacbon C6 không liên kết và cacbon
C1 của gốc β-D-Galactose tương ứng ở độ dịch chuyển hóa học trong
vùng 61-62 ppm và 103-104 ppm. Ngoài ra, các tín hiệu ở độ dịch chuyển
hóa học 20,9 ppm và vùng (173-175 ppm) trên phổ
13
C-NMR của các
phân đoạn SpF3 và SwF5 còn chỉ ra sự có mặt của nhóm O-acetyl trong
phân tử của hai loại fucoidan này.


thích thỏa đáng tất cả các tín hiệu trên phổ này. Mặc dù vậy, cũng giống
như các loại fucoidan đã được công bố trước đó, trên phổ
1
H-NMR của cả
05 phân đoạn fucoidan SdF3, SpF3, SmF3, SwF5 và ToF2 đều xuất hiện
những tín hiệu mạnh ở vùng trường cao 1,2-1,8 ppm đặc trưng cho proton
H6 của nhóm methyl vòng fucose và các tín hiệu xuất hiện trong vùng
4,9-5,2 ppm đặc trưng cho proton H1 của vòng 1→3)-α-L-fucopyranose.
Bên cạnh đó trên phổ
1
H-NMR cũng xác nhận sự có mặt của gốc
galactose thông qua các tín hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 3,1-3,3 ppm và
5,3-5,4 ppm đặc trưng cho proton H6 và H1 của vòng β-D-Galactose.
Ngoài ra, trên phổ của các phân đoạn SdF3, SwF5, SpF3 và ToF2 còn
xuất hiện nhóm tín hiệu trong vùng 2,1-2,3 ppm cho thấy sự có mặt của
nhóm O-acetyl.

3.6. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN
SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM
MCCLUREI.
Theo kết quả ở mục 3.3, phân đoạn SmF3 có thành phần chính là
fucose, galactose và sulfate (35%), tỉ lệ fucose:galactose ≈ 1:0,71, ngoài
ra không chứa thêm các thành phần đường khác (bảng 3.5). Phổ FT-IR
của phân đoạn SmF3 giúp ta nhận biết sự có mặt của nhóm sulfate thông
qua các tín hiệu ở 1262,73 cm
-1
(S=O) và 839,22 cm
-1
(S-C-S) (hình 3.13),
ngoài ra đỉnh hấp thụ ở số sóng 839,22 cm
-1
còn cho biết vị trí nhóm thế
sulfate trong phân tử fucoidan SmF3 ở axial (C4) chiếm ưu thế. Tuy
nhiên, dữ liệu phổ hồng ngoại chỉ cho biết thông tin nhóm sulfate ở vị trí
axial (C4) hay equatorial (C2 hoặc C3) của vòng pyranose nói chung mà
không phân biệt được nó thuộc vòng fucose hay galactose. Vì vậy, để giải
quyết vấn đề này chúng tôi sẽ tiến hành phân tích bằng phương pháp phổ
cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối.
H1(α-anomeric) của gốc 1→3)-α-L-Fucp, tín hiệu nhỏ hơn ở 5,0 ppm là
H1 của gốc 1→4)-α-L-Fucp. Bên cạnh đó, các tín hiệu đặc trưng cho
proton H6 và H1 của gốc β-D-galactose được xác nhận thông qua các tín
hiệu ở độ dịch chuyển hóa học 3,7 ppm và 5,4 ppm.
* Khử sulfate
Khử sulfate được thực hiện nhằm mục đích làm đơn giản hóa cấu
trúc của fucoidan phân đoạn SmF3. Kết quả đo phổ
13
C-NMR của
fucoidan đề sulfate hóa SmF3-Ds cho thấy tín hiệu đặc trưng của cacbon
C-6 không liên kết của gốc β-D-Galactose ở 61,7 ppm đã tăng lên đáng
kể so với trước khi được khử sulfate, điều này chỉ ra nhóm sulfated có thể
tồn tại ở vị trí C-6 của một số gốc galactose.
* Phân tích liên kết bằng phương pháp methyl hóa
Kết quả phân tích liên kết bằng methyl hóa của fucoidan SmF3
(bảng 3.10) cho thấy chủ yếu là các gốc fucose liên kết 3 (46%), cùng với
một lượng ít hơn các gốc galactose liên kết 4 (18%), fucose liên kết 4
chiếm 12% và galactose liên kết 6 chỉ có 2%. Fucoidan SmF3 có chứa

2,3,4,6-tetra-O-methyl-galactitol

8 Gal1→
2,3,6-tri-O-methyl-galactitol 18 →4Gal1→
2,3,4-tri-O-methyl-galactitol 2 →6Gal1→
3,4-di-O-methyl-galactitol 1 →2,6Gal1→
2,4-di-O-methyl-galactitol 2 →3,6Gal1→
1,2,3,4-tetra-O-methyl-galactitol

6 →6Gal
Như vậy, bằng các phương pháp phân tích hóa học và phân tích
phổ IR, NMR, đặc trưng cấu trúc của fucoidan SmF3 đã được xác định
như sau: mạch chính được tạo nên chủ yếu bởi gốc α-L-fucose-(1→3),
trong thành phần mạch chính và/hoặc mạch nhánh còn chứa các gốc
α-L-fucose-(1→4); galactose-(1→4) và galactose-(1→6). Nhóm sulfate ở
vị trí C2 và/hoặc C4 trên gốc đường fucose và galactose.
Để khẳng định lại cấu trúc dự đoán trên và xác định trật tự liên kết
giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan SmF3, các oligofucoidan
SmF3 sẽ được phân tích bằng khối phổ nhiều lần (MALDI-TOF/MS/MS
và ESI-MS/MS).
* Phổ khối của oligosacarit được điều chế bằng phương pháp
tự thủy phân fucoidan SmF3
Hiệu suất của phân đoạn oligosacarit SmF3-AH đạt được là 85% so
với SmF3. Kết quả phân tích thành phần monosacarit của phân đoạn này
cho thấy hàm lượng (% mol) fucose chiếm 68,5%, hàm lượng galactose
chiếm 31,5%. Kết quả phân tích thành phần monosacarit của phân đoạn
trọng lượng phân tử cao thu được sau thủy phân cho thấy hàm lượng
galactose giảm xuống (14,7%) và hàm lượng fucose tăng lên (85,3%). So
với các kết quả thu được khi phân tích fucoidan từ các loài rong thuộc bộ
Laminariales trong cùng điều kiện tự thủy phân cho thấy trong phân tử

-

ESI
[M - nNa]
n−

Thành phần/đặc trưng cấu trúc của monosacarit
và oligosacarit
243,00 243,016 Fuc(4 SO
3
−
), Fuc(2 SO
3
−
), Fuc(3 SO
3
−
)
- 259,012 Gal(4(6) SO
3
−
), Gal(2 SO
3
−
)
389,10 389,077 [Fuc
2
(SO
3
)]

−
)-(1,4)-Fuc (2,3 SO
3
−
)
Fuc(2,4 SO
3
−
)-(1,3)-Fuc **
- 187,654
2-
Gal(4/6,3 SO
3
−
)-(1,3/4)-Fuc(2/3SO
3
−
)
Fuc(2,4 SO
3
−
)-(1,4)-Gal(2 SO
3
−
)

18

507,03 242,008 Gal(2 SO
3

- 236.341 [Fuc
2
Gal(SO
3
)
3
]
3−

653,05 315,040
2-
[Fuc
2
Gal(SO
3
Na)
2
− Na]
−

681,16 - [Fuc
4
(SO
3
)]
−

697,15 - [Fuc
3
Gal(SO

-
)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(SO
3
-
)-(1,3)-Fuc(SO
3
-
)
Gal(4/6,2 SO
3
-
)-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc-(1,3)-Fuc(2 SO
3
-
)
Fuc-(1,4)-Gal(3SO
3
-
)-(1,3)-Fuc(2SO
3
-
)-(1,3)-Fuc(2SO
3
-
)
827,13 - [Fuc
5
(SO
3
)]

3
Gal
2
(SO
3
Na)
2
- Na]
-

- 339,051
3-
[Fuc
3
Gal
2
(SO
3
)
3
]
3−

989,05 - [Fuc
5
Gal(SO
3
)
−


4
Gal
2
(SO
3
Na)
2
− Na]
−

*M: muối natri sulfate oligosacarit ** Các ion mảnh đặc trưng cho kiểu liên kết có cường độ thấ
p
Trên phổ ion-âm ESI-MS/MS của mảnh monosulfated galactose
[GalSO
3
]
-
ở m/z 259,02 xuất hiện hai tín hiệu chính có cường độ mạnh
tương đương nhau ở số khối m/z 138,98 (
0,2
X) và m/z 198,99 (
0,2
A). Theo
công bố của Tissot và cộng sự, vị trí nhóm sulfate ảnh hưởng đến cơ chế
phân mảnh vòng đường. Các tín hiệu ở m/z 138,98 (
0,2
X) và m/z 198,99
(
0,2
A) đặc trưng cho vị trí nhóm sulfate ở C-2 và C-4. Kết quả đo phổ

hơn C-2. Như vậy, phổ MS/MS của mảnh ở m/z 243,0 cho thấy nó là hỗn
hợp của hai monosulfate fucose gồm Fuc(4 SO
3
-
) và Fuc(2 SO
3
-
).

Hình 3.16. Phổ MALDI-MS/MS của mảnh [FucSO
3
]
-
ở số khối 225,0 (A)
và phổ ESI-MS/MS của mảnh [FucSO
3
]
-
ở số khối 243,02 (B)
Trên phổ MALDI-TOF/MS/MS của mảnh [Fuc
2
(SO
3
Na)
2
-Na]
-
ở
m/z 491,0 (hình 3.17A) xuất hiện tín hiệu của các mảnh ion chính như B
1

3
)
3
]
3−
tại m/z 182,33 (3.17B) thu được các tín hiệu của ion Y
1
’ ở
m/z 160,98 tương tứng với gốc disulfated fucose ở phía đầu khử, ion B
1
ở
m/z 225,01 tương ứng với gốc monosulfated fucose ở đầu không khử, ion
0,2
X
o
ở m/z 138,9 tương ứng với gốc sulfate ở vị trí C-2, ion
2,4
A
2
ở m/z
181,99 được sinh ra từ sự phân mảnh của gốc fucose ở phía đầu khử được
sulfate hóa kép ở vị trí C-2 và C-3. Như vậy, mảnh [Fuc
2
(SO
3
)
3
]
3-
tại m/z

và [FucGal(SO
3
-
)
2
]
2-
(bảng 3.11). Kết quả
phân tích phổ khối nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS của các mảnh ion này
cho thấy vị trí liên kết thích hợp nhất của các gốc galactose là điểm cuối
của đầu mạch không khử. Các kết quả này chỉ ra rằng các gốc galactose
có thể ở vị trí cuối cùng trên các đoạn mạch có cấu tạo là các gốc α-L-
Fucp liên kết 3. Để làm sáng tỏ thêm nhận định trên, chúng tôi tiến hành
phân tích phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS của mảnh ion [GalFuc(SO
3
-
)
3
]
3-

ở số khối m/z 187,65 (Hình 3.18)

Hình 3.18. Phổ khối nhiều lần ESI-MS/MS của mảnh ion
[GalFuc(SO
3
-
)
3
]

C-3 của gốc galactose phía đầu mạch khử. Như vậy, mảnh
[GalFuc(SO
3
)
3
]
3-
m/z 187,65 là hỗn hợp của hai disacarit có cấu tạo như
được trình bay trong bảng 3.11 và hình 3.18.
Kết quả phân tích phổ ESI-MS/MS của ion triply sulfated
tetrasacarit [Fuc
3
Gal(SO
3
)
3
]
3-
ở m/z 285,03 (Hình 3.19) cho thấy khả
năng mảnh này tồn tại ít nhất 3 biến thể cấu trúc (bảng 3.11). Lần đầu
tiên, bằng phương pháp phân tích phổ khối nhiều lần MS/MS của

21

fucooligosacarit sulfate hóa đã xác định được cấu trúc của fucoidan có
mạch nhánh: do không phát hiện thấy các ion của gốc fucose lần lượt
được tách ra (dựa vào các ion chuẩn đoán dạng B
-
). Tín hiệu của mảnh
ion Y

Hình 3.20. Phổ khối Negative-ion tandem MALDI-TOF/MS
của ion mảnh [Fuc
3
Gal
2
(SO
3
Na)
2
- Na]
-
tại m/z 960,95.

22

Từ kết quả phân tích phổ khối nhiều lần MALDI-TOF/MS của ion
[Fuc
3
Gal
2
(SO
3
Na)
2
- Na]
-
(hình 3.20) có thể đưa ra dự đoán ít nhất bốn
biến thể cấu trúc của ion này như trình bày trong bảng 3.11. Trong đó với
tập hợp đầy đủ các ion kiểu Y
-

-
), Fuc-(1→3)-Fuc(2,4SO
3
-
),
Fuc(2SO
3
-
)-(1→4)-Fuc(2,3SO
3
-
), Fuc(2,4SO
3
-
)-(1→3)-Fuc;
Gal(4/6,3SO
3
-
)-(1→3/4)-Fuc(2/3SO
3
-
) và Fuc(2,4SO
3
-
)-(1→4)-Gal(2SO
3
-
).
Dựa trên kết quả phân tích methyl hóa đã xác định được kiểu liên
kết chủ yếu của gốc β-D-Galp là liên kết (1→4), trong trường hợp này

phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối, cấu trúc của
fucoidan SmF3 có thể được mô tả như sau: mạch chính của polysacarit
gồm →3)-Fuc(2,4SO
3
-
)-(1→3)-Fuc(2,4SO
3
-
)-(1→, họa tiết xen vào các

23

gốc (1→4)-Fucp(3SO
3
-
) và (→6)-Galp ở cuối đầu khử. Các vị trí mạch
nhánh thích hợp là các gốc galactose liên kết 1,2,6- hoặc 1,3,6- (kết quả
phân tích methyl hóa, bảng 3.10) và/hoặc các gốc fucose liên kết 1,3,4-
(kết quả phân tích phổ khối, hình 3.19), các gốc này có khả năng tạo liên
kết glycoside với các gốc galactose ở cuối mạch hoặc với các mạch được
tạo thành bởi các gốc α-L-Fucp sulfate hóa và β-D-Galp sulfate hóa liên
kết luân phiên nhau. Cả hai gốc α-L-Fucp và β-D-Galp được sulfate hóa ở
vị trí C-2 và/hoặc C-4 (đôi khi là C-6 của gốc β-D-Galp) và có thể ở vị trí
C-3 của các gốc: β-D-Galp ở cuối mạch, β-D-Galp liên kết 4 và α-L-Fucp
liên kết 4.
Lần đầu tiên đã phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc
→3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Galp liên kết luân phiên nhau trong
galactofucan từ chi rong Sargassum.
3.7. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU
TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN

S.swartzii, S.mcclurei và Turbinaria ornata. Kết quả chỉ ra rằng:
- Cấu trúc mạch chính của 05 phân đoạn fucoidan được tạo thành
chủ yếu bởi các gốc 1→3)- α-L-Fucopyranose.
- Nhóm sulfate gắn chủ yếu ở vị trí C-4 và một phần ở vị trí C-2
trên các gốc đường pyranose.
Việc phân tích các đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn fucoidan có
hoạt tính tốt cho phép chúng tôi đưa ra một số nhận định ban đầu về các
yếu tố cấu trúc có ảnh hưởng đến hoạt tính kháng u của fucoidan từ một
số loài rong thuộc chi Sargassum Việt Nam.
6) Bằng phương pháp tự thủy phân (autohydrolysis) sử dụng chính
các nhóm (-SO
3
H) của phân tử fucoidan làm nguồn axít để chuyển hóa
polysacarit fucoidan về dạng oligosacarit-fucoidan phù hợp cho phân tích
khối phổ. Đây là một nét mới của luận án.
7) Lần đầu tiên tại Việt Nam đã kết hợp 2 kỹ thuật phân tích khối
phổ nhiều lần MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS trong phân tích cấu
trúc của polysacarit. Nhờ vậy đã giúp giải thích được một cách tường
minh hơn cấu trúc phức tạp của fucoidan có nguồn gốc từ rong Việt Nam.
Đây là tính mới của luận án so với các nghiên cứu cùng lĩnh vực này ở
trong nước.
Lần đầu tiên cấu trúc của phân đoạn fucoidan SmF3 có hoạt tính
gây độc tế bào ung thư từ rong Sargassum mcclurei đã được thiết lập.
Mạch chính của fucoidan SmF3 gồm: →3)-Fucp(4,2SO
3
-
)-(1→3)-
Fucp(4,2SO
3
-