ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o TRẦN THỊ THANH HUYỀN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH
GAN THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA VIỆT NAM
Pangasius hypophthalmus BẰNG KỸ THUẬT LAMP
(Loop - mediated isothermal amplification)
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

H NI – 2013

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NÔI

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam là người hướng dẫn chính
của tôi trong nghiên cứu này. GS định hướng nghiên cứu, tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi có
cơ hội tiếp cận với các khía cảnh mới của công nghệ sinh học và hoàn thành tốt luận án của
mình, đồng thời luôn luôn động viên, khích lệ tôi trong công việc. Tôi xin được bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Kiều Hữu Ảnh là người đồng hướng dẫn của tôi. PGS đã là
người chỉ đường, định hướng cho tôi không chỉ trong công việc chuyên môn mà truyền tải cho
tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong cuộc sống của mình
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Nguyễn Thị Trung – Phòng Kỹ
thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học người đã cận kề cùng tôi trong công việc và dành
nhiều thời gian thảo luận các phương pháp nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành được luận án
của mình. Đồng thời, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn đến các cán bộ Phòng Kỹ thuật di
truyền, Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo, hướng dẫn cho tôi từ những
ngày đầu làm việc nơi đây cho đến khi tôi hoàn thành toàn bộ kết quả luận án. Tôi xin bày tỏ
lòng biết ơn đến TS. Bùi Thị Việt Hà – Chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật học – Khoa Sinh học,
Trường Đại học Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện về mặt thời gian cho tôi trong thời gian
làm luận án.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới Bố-Mẹ tôi, người đã nuôi dưỡng
và dạy dỗ tôi, Chồng và con là chỗ dựa tinh thần và nguồn động viên để tôi có đủ nghị lực để
hoàn thành nhiệm vụ của mình.

Hà nội, ngày 15 tháng 9 năm 2013
TRẦN THỊ THANH HUYỀN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của một tập thể mà tôi là thành viên chính thức
thực hiện các nghiên cứu. Các số liệu và kết quả thí nghiệm được trình bày trong luận án là trung thực

Danh mục các hình

MỞ ĐẦU
1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
6
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
6
1.1.1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus
6
1.1.2. Bệnh gan mủ thận
9
1.1.2.1. Tác nhân gây bệnh
9
1.1.2.2. Đường lây truyền
11
1.1.2.3. Triệu chứng bệnh
12
1.1.2.4. Bệnh tích
13
1.1.2.5. Khả năng bùng phát bệnh
16
1.1.2.6. Điều trị bệnh
16
1.2. VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri
18


40
1.5.5. Ưu điểm của phương pháp LAMP
42
1.5.6. Các hướng nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật LAMP tại Việt
Nam
43
Chương 2. NGUYÊN LIỆU V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
46

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ MÁY MÓC
46
2.1.1. Vật liệu
46
2.1.2. Hóa chất và máy móc thiết bị
47
2.2. PHƯƠNG PHÁP
48
2.2.1. Phương pháp vi sinh và hóa sinh
49
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử
51
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ vi khuẩn
51
2.2.2.2. Tách chiết DNA plasmid từ tế bào E. coli
51
2.2.2.3. Điện di DNA trên gel agarose
52

2.2.3.3. Xác định nồng dNTPs tối ưu
61
2.2.3.4. Xác định tỉ lệ mồi tối ưu
61
2.2.3.5. Xác định nồng độ betaine tối ưu
61
2.2.3.6. Xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu
61
2.2.3.7. Xác định thời gian phản ứng tối ưu
61
2.2.3.8. Xác định độ đặc hiệu của phản ứng LAMP
61
2.2.3.9. Xác định giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP
62
2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào vật chủ
62
2.2.4.1. Thiết kế thí nghiệm cảm nhiễm
62
2.2.4.2. Xác định LD
50

63
2.2.4.3. Giải phẫu mô học
64
2.2.5. Xử lí số liệu bằng phần mềm vi tính
64
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
66
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁ TRA VIỆT NAM
66

3.3.2. Tách dòng gen eip18 bằng vector pJet 2.1/blunt
81
3.3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen eip18 trong vector tái tổ hợp
81
3.3.4. Xác định trình tự gen eip18
83
3.4. THÍ NGHIỆM CẢM NHIỄM VI KHUẨN E. ictaluri
86
3.4.1. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E5
86
3.4.2. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E7
87
3.4.3. Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri E40
88
3.4.4. Dấu hiệu bệnh lý của cá sau khi cảm nhiễm
91
3.4.5. Kết quả tái phân lập và định danh vi khuẩn
93
3.5. PHÁT HIỆN GEN eip18 CỦA VI KHUẨN E. ictaluri BẰNG KỸ
THUẬT LAMP
95

3.5.1. Khuếch đại gen eip18 bằng kỹ thuật LAMP
95
3.5.2. Tối ưu các điều kiện của phản ứng LAMP
97
3.5.2.1. Ảnh hưởng nhiệt độ phản ứng

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

at
Attogram

BHI
Brain Heart Infusion
Môi trường dịch thể BHI
BHIA
Brain Heart Infusion Agar
Môi trường thạch BHI
Bp
Base pair
Cặp bazơ
CFU
Conoly forming unit
Đơn vị hình thành khuẩn lạc
cs
Cộng sự

CT
Công thức

Da

quang

fg
Femtogram

ha
Hecta

Kb
Kilo base

Mb
Mega base

LAMP
Loop-mediated isothermal
amplification
Khuếch đại đẳng nhiệt có tạo
thành vòng
OD
Optical Density

PCR
Polymerase chain reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
rDNA
Ribosomal Deoxyribonucleic acid

22
3
Bảng 2.1. Danh sách các mồi nhân gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
bằng kỹ thuật LAMP và PCR
47
4
Bảng 2.2. Mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) trước khi gây cảm
nhiễm
63
5
Bảng 2.3. Bố trí công thức thí nghiệm cảm nhiễm cá tra
63
6
Bảng 3.1. Kí hiệu và nguồn gốc các chủng vi khuẩn phân lập từ cá tra
Việt Nam
66
7
Bảng 3.2. Hoạt tính phân giải chondroitin của các chủng nghiên cứu
75
8
Bảng 3.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập từ
cá tra Việt Nam
76
9
Bảng 3.4. So sánh trình tự gen eip18 của các dòng E5/4, E40/3 và Ei/10
với trình tự gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri và gen evpC của
vi khuẩn E. tadar bằng chương trình ClustalW
84
10
Bảng 3.5. LD

13
3
Hình 1.3. Vi khuẩn Edwardsiella ictaluri soi dưới kính hiển vi điện tử
(A) và nhuộm Gram (B)
19
4
Hình 1.4. Bộ kit API-20E với các giếng phản ứng sinh hóa
29
5
Hình 1.5. Nguyên tắc thiết kế mồi cho phản ứng LAMP
34
6
Hình 1.6. Nguyên lý khuếch đại ADN của phản ứng LAMP
38
7
Hình 1.7. Quy trình phát hiện tác nhân gây bệnh bằng phương pháp
LAMP
39
8
Hình 1.8. Nguyên tắc của sự phát quang bởi Calcein
41
9
Hình 1.9. Phát hiện phản ứng LAMP bằng đo độ đục, bằng huỳnh
quang hoặc soi dưới đèn UV
42
10
Hình 2.1. Bản đồ vector tách dòng pJet 1.2/blunt
46
11
Hình 3.1. A- Giải phẫu nội tạng cá tra khỏe mạnh A và

E.i- E. ictaluri ATCC 33202
72
18
Hình 3.8. Hoạt tính chondroitinase của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
74
19
Hình 3.9. Hoạt tnh tan huyết của các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
75
20
Hình 3.10. Điện di kiểm tra sản phẩm tách genom trên gel agarose
77
21
Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại của các mẫu vi khuẩn E5, E7 và
E40 phân lập tại Việt Nam so với các loài gần gũi dựa trên
trình tự rADN 16S
78
22
Hình 3.12. Sơ đồ thiết kế tách dòng gen eip18 của vi khuẩn E. ictaluri
79
23
Hình 3.13. Phân lập gen eip18 từ vi khuẩn E. ictaluri
80
24
Hình 3.14. A. Kết quả điện di sản phẩm DNA plasmid tách từ tế bào
E. coli DH 10B. B. Kết quả PCR đoạn gen eip18 trên plasmid
bằng cặp mồi Eip18
82
25
Hình 3.15. A - Kết quả điện di đồ sản phẩm cắt plasmid bằng enzym
hạn chế BglII. B - Kiểm tra điện di đồ sản phẩm cắt plasmid

91
32
Hình 3.22. Đặc điểm mô bệnh học của cá tra gây cảm nhiễm bởi vi
khuẩn E . ictaluri
92
33
Hình 3.23. Kết quả tái phân lập vi khuẩn trên cá tra sau khi cảm nhiễm
bằng các mẫu vi khuẩn nghiên cứu
94
34
Hình 3.24. Phản ứng LAMP khuếch đại gen eip18
95
35
Hình 3.25. Cắt sản phẩm LAMP bằng enzyme Mnl I
97
36
Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
98
37
Hình 3.27. Ảnh hưởng của thời gian tới phản ứng LAMP khuếch đại
gen eip18 của mẫu vi khuẩn E. ictaluri E7
99
38
Hình 3.28. Ảnh hưởng của nồng độ dNTPs đến phản ứng LAMP
100
39
Hình 3.29. Ảnh hưởng của tỷ lệ mồi (A) và nồng độ Betain (B) đến
phản ứng LAMP
101
40

Hình 3.35. Giới hạn phát hiện gen eip18 của phản ứng LAMP
106
46
Hình 3.36. Độ đặc hiệu của cặp mồi khuếch đại gen eip18 bằng phản
ứng LAMP
108
1 MỞ ĐẦU
Nuôi trồng thủy sản trong đó có nuôi cá tra thương phẩm hiện đóng một vai trò
quan trọng trong ngành xuất khẩu nói chung và xuất khẩu thủy sản nói riêng. Hoạt
động này đã và đang được nhiều chính phủ khuyến khích nhằm tạo ra lượng hàng hóa
có giá trị kinh tế cao, giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động, tăng thu nhập và
góp phần đẩy lùi nghèo đói ở các nước đang phát triển. Ở Việt Nam, trong 10 năm trở
lại đây nghề nuôi cá tra đang phát triển rất nhanh với quy mô lớn tại một số tỉnh đồng
bằng Sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang… với
diện tích nuôi trồng đạt 6.300 ha mặt nước tnh đến năm 2011 [15]. Cá tra Pangasius
hypophthalmus là loài đặc hữu của lưu vực sông Mê Kông và được xem là một trong
những đối tượng xuất khẩu tiềm năng. Ước tính trung bình kim ngạch xuất khẩu cá tra
hàng năm đóng góp khoảng 10% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo thống kê của Hiệp
hội nuôi trồng và xuất khẩu thủy sản, năm 2008 xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới
đạt 1,2 tỷ USD, năm 2009 đạt 1,34 tỷ USD, năm 2010 đạt 1,4 tỷ USD, năm 2011 đạt
1,8 tỷ USD, dự kiến kim ngạch xuất khẩu cá tra ra thị trường thế giới bao gồm Châu
Âu, Mỹ, Mexico… đạt 1,8 đến 2 tỷ USD đến hết năm 2012 [16].
Sự phát triển quá nhanh không theo quy hoạch của ngành nuôi cá tra tại khu vực
Đồng bằng sông Cửu long đã dẫn đến sự bùng nổ dịch bệnh trên diện rộng, dịch bệnh

nhân gây hoại tử gan, thận và nhiễm trùng huyết trên cá nheo Mỹ Ictalurus punctatus
là vi khuẩn E. ictaluri [94]. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu khẳng định tác
nhân gây bệnh gan thận mủ là E. ictaluri nhưng bên cạnh đó vẫn tồn tại những ý kiến
cho rằng đó là do vi khuẩn khác gây ra. Như vậy, việc xác định tác nhân chính gây
bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam là vấn đề cần phải được làm sáng tỏ.
Có rất nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự có mặt của một tác nhân
gây bệnh từ những phương pháp truyền thống như: phân lập trên môi trường chọn lọc,
xác định đặc tnh sinh lý, hóa sinh, phương pháp huyết thanh học… đến các phương
pháp phân tử như PCR, RT-PCR, multiplex PCR… Tuy nhiên, việc phát triển một 3

phương pháp chẩn đoán nhanh, chnh xác tác nhân gây bệnh và có khả năng ứng dụng
nhanh bên ngoài phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng không chỉ góp phần khẳng
định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam mà còn có ý nghĩa quan trọng
trong phòng chống, kiểm soát và điều trị bệnh. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến
hành đề tài:

“Nghiên cứu xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam
Pagasius hypophthalmus bằng kỹ thuật LAMP (Loop-mediated isothermal
amplification”
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Việt Nam Pangasius
hypophthalmus.
- Chẩn đoán nhanh, chính xác tác nhân gây bệnh trên các mẫu bệnh phẩm bằng
kỹ thuật LAMP. 4
6

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁ TRA VÀ BỆNH GAN THẬN MỦ
1.1.1. Cá tra Pangasius hypophthalmus
Cá tra và cá basa là hai trong số 11 loài thuộc họ cá tra Pangasiidae đã được xác
định ở sông Cửu Long. Theo dẫn liệu từ [124], hệ thống phân loại
của loài cá tra được xác định như sau :
Giới: Animalia Linnaeus, 1758
Ngành: Chordata Bateson, 1885
Ngành phụ: Vertebrata Cuvier, 1812
Tổng lớp: Osteichthyes Huxley, 1880 – Bony fishes
Lớp: Actinopterygii Huxley, 1880 – Ray-finned fishes
Lớp phụ: Neopterygii
Tổng bộ: Ostaryphysi
Bộ: Siluriformes
Họ cá tra: Pangasiidae - Bleeker, 1858
Giống cá tra dầu: Pangasius Valenciennes in Cuvier and Valenciennes, 1840
Loài cá tra: Pangasius hypophthalmus (Sauvage, 1878)
Các đồng danh của loài cá tra bao gồm:
- Helicophagus hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878
- Pangasius pangasius non Hamilton,1822
- Pangasius pleurotaenia non Sauvage, 1878
- Pangasius sutchi Fowler, 1937
Cá tra phân bố tự nhiên chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mê kông, có mặt ở cả bốn
nước Lào, Việt Nam, Campuchia, Thái Lan. Tài liệu phân loại gần đây nhất của tác giả

8

90% [3]. Bệnh nếu không được phát hiện và điều trị kịp thời sẽ rất khó kiểm soát và
ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất mùa vụ và việc xuất khẩu ra thị trường thế giới.
Bảng 1.1. Diện tích và sản lượng nuôi cá tra ở các địa phương năm 2011 [15]
Tỉnh
Sản lượng (tấn)
Diện tích nuôi trồng (ha)
Tây Ninh
4.500
25
Tiền Giang
36.700
180
Bến Tre
126.750
650
Trà Vinh
28.622
131,7
Vĩnh Long
111.517
405,9
Đồng Tháp
341.884
1529
An Giang
245.000
1330
Cần Thơ