LỜI CẢM ƠN
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Phương Phú Công, người đã trực tiếp, tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong tổ Vi sinh vật học và toàn thể các thầy cô
khoa Sinh - KTNN trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu tại đây.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ em trong
suốt thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, các kết quả thu
được trong khoá luận là trung thực, chưa từng được công bố trong bất kì công trình khoa học
nào.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Hà Nội, tháng 05 năm 2013 Sinh viên
Nguyễn Thị Dung
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 1 K35B - SP Sinh
DANH MUC BẢNG
•
Bảng 1.1. Thành phần lignocellulose trong rác thải và phế phụ phẩm
DANH MUC HÌNH
•
CÁC THUẢT NGỮ VIẾT TẮT
Cs : Cộng sự
CMC : Cacboxyl methyl cellulose
CMC - ase : Cacboxylmethylcellulase
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 2 K35B - SP Sinh
nấm men trong chế biến bãi thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc ; Nguyễn Lân Dũng
(1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergi niger sản phẩm dùng làm
thức ăn cho bò; Phương Phú Công (2008) Tuyển chọn và ứng dụng một số chủng vi sinh vật có khả
năng lên men xylan trên phế phụ phẩm nông nghiệp để thu xylanase phục vụ cho chăn nuôi và đã
thu được kết quả cho nhiều triển vọng.
Xuất phát từ những yều cầu cấp thiết như trên tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu tiềm năng ứng
dụng của chủng nấm mốc M4V có khả năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp để
thu ceỉỉuỉase phục vụ chăn nuôi ”
2 . Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V trong việc phân giải cellulose trên
các phế phụ phẩm nông nghiệp để thu cellulase phục vụ chăn nuôi.
3 . Nội dung của đề tài
3.1. Tuyển chọn và nghiên cứu chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase trên các phế phụ
phẩm nông nghiệp.
3.2. Bước đầu đánh giá sản phẩm lên men từ chủng nấm mốc M4V để bổ sung vào thức ăn làm
tăng năng suất vật nuôi.
4 . Ỷ nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa lý luận
Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu tiềm năng ứng dụng của chủng nấm mốc M4V có khả
năng phân giải cellulose trên phế phụ phẩm nông nghiệp.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Bước đầu nghiên cứu nâng cao chất lượng phế phụ phẩm trong ngành nông nghiệp Việt
Nam để phục vụ chăn nuôi.
Khóa luận tốt nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 4 K35B - SP Sinh
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cellulose y à sự phân bố cellulose trong thực yật
1.1.1, Cellulose
Cellulose là hợp chất hữu cơ có công thức cấu tạo (CeHio05)
n
[27].
Cellulose có cấu tạo tương tự carbohydrate phức tạp như tinh bột và glycogen.
Các polysaccharide này đều được cấu tạo từ các đơn phân là glucose. Cellulose là
glucan không phân nhánh, trong đó các gốc glucose kết hợp với nhau qua liên kết ß-1
—>4- glycoside, đó chính là sự khác biệt giữa cellulose và các phân tử carbohydrate
phức tạp khác. Giống như tinh bột, cellulose được cấu tạo thành chuỗi dài gồm ít nhất
500 phân tử glucose. Các chuỗi cellulose này xếp đối song song tạo thành các vi sợi
cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm. Mỗi chuỗi có nhiều nhóm - OH tự do, vì vậy
giữa các sợi ở cạnh nhau kết hợp với nhau nhờ các liên kết hydro được tạo thành giữa
các nhóm - OH của chúng. Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hơn
hay còn gọi đó là bó mixen có đường kính 20 nm, giữa các sợi trong mixen có những
khoảng trống lớn. Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào già
thì chứa đầy lignin và hemicellulose [27].
Cellulose có cấu trúc rất bền và khó bị thuỷ phân. Người
và động vật không có enzyme phân giải cellulose
(cellulase) nên không tiêu hoá được cellulose, vì vậy
cellulose không có giá trị dinh dưỡng. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu cho thấy cellulose có thể có vai trò điều hoà
hoạt động của hệ
Khóa luận tất nghiệp Trường ĐHSP Hà Nội 2
SVTH: Nguyễn Thị Đung 6 K35B - SP Sinh
thống tiêu hoá. Vi khuẩn trong dạ cỏ của gia súc, các động vật nhai lại và
động vật nguyên sinh trong ruột của mối sản xuất enzyme phân giải cellulose. Nấm
cũng có thể phân huỷ cellulose, vì vậy chúng có thể sử dụng cellulose làm thức ăn
[24].
1.1.2. Sự phân bổ cellulose trong thực vật
Cellulose được tổng hợp hàng năm với khối lượng lớn. Sinh
khối thực vật của trái đất là 1800 tỷ tấn, thì cellulose
chiếm tới 720 tỷ tấn. Khối lượng cellulose khổng lồ này
ngoài việc chứa trong quần thể thực vật chủ yếu còn có
Hạt bông 80-95 5-20
0
Giây báo 40-55 25-40 18-30
Giây thải từ bột giây hoá học 60-70
10-20
5-10
Chất rắn nước thải ban đầu 8-15
-
24-29
Chât thải của lợn
6
28
-
Phân bón gia súc 1.6-4.7 1.4-3.3 2.1-5.1
Cỏ ở bờ biển Bermuda 25 35.7 6.4
Cỏ mềm 45 31.4
12
Các loại cỏ (trị số trung bình 25-40 25-50 10-30
cho các loại)
Bã thô 33.4 30 18.9
1.2. Cơ chế phân giải cellulose của enzyme cellulase
1.2.1. Hệ thống cellulase
Cellnl ase
Cellulose oligosaccharides, glucose
OH
Cellulose “
po Iyme r of jS-( 1
-A
)-D- gIyoũ pyran osyl un its
Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-P-l,4-glucanase,
❖ Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết a-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và
a- D glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose
phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
♦♦♦ Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi
cellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.
❖ Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành glucose
[28].
1.3. ứng dụng của cellulase
1.3.1. Cellula.se với công nghiệp thực phẩm
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi
loại rau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của ngành trồng trọt và nông
nghiệp. Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có
giá trị làm tăng tiêu hoá, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hoá.
Chế phẩm cellulase thường dùng để: Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc,
tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật [31].
ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để
tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực
vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ em và nói chung chất lượng thực phẩm được
tăng lên. Một số nước đã dùng cellulase để xử lí các loại rau quả cải bắp, hành, cà rốt,
khoai tây, táo và lương thực như gạo. Người ta còn xử lí cả chè và các loại tảo biển,
[25].
Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase thành tế bào của hạt đại mạch
bị phá huỷ tạo điều kiện tốt cho tác động của protease và đường hoá. Trong sản xuất
agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase đã làm tăng chất lượng agar-agar hơn so
với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào. Đặc biệt là việc sử dụng chế
phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thuỷ phân, dùng làm thức ăn gia
súc và công nghệ lên men. Những ứng dụng của cellulase trong công nghiệp thực
phẩm đã có kết quả rất tốt. Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là khó thu được chế phẩm có
cellulase hoạt độ cao
[25].
bằng phương pháp khô, phương pháp này cho chất lượng cà phê không cao. Để tiến
hành nâng cao chất lượng cà phê, phương pháp lên men đã được áp dụng. Đó là quá
trình sử dụng phức hệ enzyme cellulase và pectinase để xử lí bóc vỏ cà phê và làm
tăng khả năng trích li dịch quả. Trong khâu bóc vỏ, cellulase gây hiện tượng thẫm
màu, làm giảm chất lượng sau khi sấy, đồng thời cản trở cho việc bóc vỏ. Khi sử
dụng chế phẩm A. niger có tên thương mại là Biovina-09 có hoạt tính pectinase và
cellulase cho thấy số lượng cà phê được bóc vỏ tăng, hạt cà phê được bóc vỏ bằng
chế phẩm không còn nhớt như hạt không sử dụng chế phẩm enzyme và hiệu suất bóc
vỏ khá cao. Trong quá trình trích li dịch quả, cellulose và pectin cản trở sự thoát các
chất hoà tan trong tế bào ra ngoài tế bào. Khi sử dụng chế phẩm Biotin-09 hiệu suất
trích li cao hơn mẫu không sử dụng là 46% [9].
1.3.4. Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Trong giai đoạn đường hoá của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành
phần chính trong quá trình thuỷ phân tinh bột. Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá
huỷ thành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng
đường tạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất
thu hồi rượu tăng lên 1,5% [27].
1.3.5. Trong công nghệ xử lí rác thải và sản xuất phân bón vỉ sinh
Thành phần hữu cơ chính trong rác thải là cellulose, nên việc sử dụng
công nghệ vi sinh trong xử lí rác thải cải thiện môi trường rất có hiệu quả. Enzyme
này có khả năng thuỷ phân chất thải chứa cellulose, chuyển hoá các hợp chất kiểu
lignocellulose và cellulose trong rác thải tạo nên nguồn năng lượng thông qua các sản
phẩm đường, ethanol, khí sinh học hay các sản phẩm giàu năng lượng khác [27].
Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để chứ rác thải thì việc tạo ra
các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và
sản xuất.
Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lí nguồn nước thải do các nhà máy giấy
tạo ra. Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao). Sinh khối này
chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết
định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose. Vì vậy nước thải của các nhà máy
Như vậy, hiệu quả của việc bổ sung enzyme vào thức ăn chăn nuôi là rõ ràng
làm tăng tỉ lệ tiêu hoá cho vật nuôi và giảm chi phí. Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam
chế phẩm enzyme thường phải được nhập khấu với giá thành cao nên nghiên cứu và
sản xuất chế phẩm enzyme là vấn đề vô cùng cần thiết.
1.4. Các nhóm vi sinh vật tham gia phân giải cellulose
1.4.1. Vi khuẩn
Pseudomonas fluorescens var cellulose - Acetobacter xylinum
Cellulomonos phân giải mạnh cellulose bã mỉa Cytophaga
Sporocytophaga myxococcoỉdes.
Cellvỉbrỉo gilvus, cellvỉbrio fulvus [7].
1.4.2. Xạ khuẩn loài Actimomyces (Streptomyces)
Actimỉmyces coelỉcolor; Act. sulfureus.
Act. cellulosae; Act. diastaticus.
Act. hydroscopicus; Act. themofuscus.
Act. bovis; Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala [7].
1.4.3. Nấm sợi
Đối tượng chủ yếu trong các nghiên cứu về cellulase hiện nay thường là nấm
(nấm mốc và nấm quả thể). Rất nhiều loài nấm đã tổng hợp cellulase có hoạt tính khá
cao trong đó đáng kể là một số chủng loại sau:
Asp. flavus; Asp. niger; Asp. oryzae; Asp. terreus;
Asp. amstelodamy; Asp. fumigates.
Chaetomium globosu
Mucor pusiỉỉus.
Pénicillium notatum, Pen. variabite; Pen. pusillum
Tricoderma koningi; Trlignorum Tr. viride.
Sporotrichum pruinosum.
Myro thecium verrucaris.
Chrysosporium lignorum [7].
1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật
1.5.1. Giống vi sinh vật
nhất lại là (NIỈ4)2HP04. Nói chung các muối amon ít có tác dụng nâng cao hoạt lực
enzyme này, thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì môi trường các muối này làm
cho môi trường axit hoá. Điều này không những ức chế quá trình tổng hợp enzyme
mà còn làm mất hoạt tính sau khi tạo thành [13].
Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hoá, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo
thành cellulase. Các hợp chất nitơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase.
Cao ngô và cao nấm men có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật. Tác
dụng kích thích của hợp chất này do sự có mặt của các axit amin, các nhân tố khoáng
và những nhân tố sinh trưởng khác
[13].
Ngoài nitơ và cacbon thì những nguyên tố khoáng như Fe, Mn, Bo, Mo, Cu,
cũng có ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật. Các nguyên
tố khoáng Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thành enzyme ở nhiều chủng [13].
1.5.3. Điều kiện nuôi cấy
1.5.3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau.
Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường rắn là
25^40°C. Nhiệt độ dưới 25°c hoặc trên 40°c nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi
kéo dài giảm khả năng sinh tổng hợp enzyme [11], [12].
1.5.3.2. Ảnh hưởng của độ ẩm
Trong quá trình lên men bề mặt, độ ẩm 60-70% là độ ẩm tương đối thích hợp
với các chủng nấm mốc khi nuôi cấy trên các khay. Nếu để độ ẩm quá thấp 50% môi
trường sẽ khô nhanh, sinh bào tử mạnh đồng thời giảm sinh enzyme. Hơn nữa, độ ẩm
môi trường ảnh hưởng đến độ thoáng khí khi lên men bề mặt không có đảo trộn [10].
1.5.3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme. Theo Lương
Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp. awamori để sản xuất enzyme nhiều
nhất vào thời điểm khoảng 36-40 giờ [13]. Đối với nấm mốc Aspergillus tạo thành
enzyme cao nhất lúc bắt đầu sinh bào tử, sau khi sinh bào tò lượng enzyme tiết ra ít
thậm chí giảm đi rất nhiều [7].
KC1 0,5 g/1
NaCl 1%
FeSƠ4 (dạng vết) 1-2 hạt
Thạch agar 20 g/1
H
2
o
1 lit
KH2PO4 2g/l
2.2. Phương pháp nghiền cứu
2.2.1. Phương pháp vỉ sinh
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Môi trường Czapek-dox cơ sở thay sacaroza bằng lõi ngô ( vỏ trấu, vỏ lạc )
Hóa chất Nồng độ
NaN0
3
10g/l
MgS0
4
.7H
2
0 0,5 g/1
KC1 0,5 g/1
NaCl 1 %
FeSƠ4 (dạng vêt) 1-2 hạt
Thạch agar 20g/l
H
2
o
1 lit
thời gian và địa điểm mẫu được lấy.
2.2.1.2. Chuẩn bị môi trưởng phân lập và bảo quản
Khi tiến hành phân lập thì điều kiện đầu tiên là khử trùng thiết bị và dụng cụ
thí nghiệm. Sau khi vô trùng các dụng cụ xong tiến hành cân đo môi
trường, cụ thể là môi trường Czapek-Dox cơ sở để làm môi trường phân lập,
môi trường được hấp thanh trùng ở 121 °c trong 45 phút sau đó phân phối khoảng 25
ml môi trường vào hộp lồng đã vô trùng. Để có môi trường thạch nghiêng giữ giống
thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào ống nghiệm, đậy nút
bông rồi đem thanh trùng. Sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn
đang nóng.
2.2.1.3. Hoạt hoả vi sinh vật
Lấy 10 ống nghiệm, nhỏ vào mỗi ống 9 ml nước cất. Cân 1 gam mỗi mẫu đem
tán nhỏ rồi cho vào ống nghiệm đầu tiên lắc thật đều. Dùng pipet hút 1 ml dung dịch
mẫu đó nhỏ vào ống nghiệm thứ 2 lắc đều, sau đó dùng pipet hút 1 ml dung dịch ở
ống thứ 2 nhỏ vào ống thứ 3. Cứ làm như vậy cho tới ống thứ 10.
Dùng pipet hút 1 ml dung dịch mẫu ở từng ống nghiệm nhỏ vào hộp lồng
tương ứng đã chứa môi trường phân lập, lấy que trang trang đều, làm như vậy cho tới
hộp lồng thứ 10. Cứ làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi chang mẫu vào
các hộp lồng xong đánh dấu rồi gói cẩn thận lại đem nuôi trong tủ ấm khoảng 30° để
theo dõi từng ngày.
Thường xuyên kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày. Nếu thấy có khuẩn lạc
mới mọc lên thì cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồiđánh dấu
cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi 3-4 ngày. Đối với những chủng không lên thì loại bỏ,
chủng nào lên thì giữ lại, bảo quản trong tủ lạnh ở 0 - 4°c để giữ giống dùng cho việc
nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phương pháp hoá sinh
2.2.2.1. Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường giữ giống
trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 36 đến 48 giờ.
❖ Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chẩm điểm
gian là 36 giờ. Sau đó lấy dịch enzyme xác định hoạt tính cellulase bằng phương
pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase
Dựa theo phương pháp của Miller.
• Nguyên lý
CMC-ase phân cắt cacboxymethylcellulose (CMC) và amylase phân cắt tinh bột
thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc
trưng với thuốc thử DN s khi đun nóng.
❖ Tiến hành thỉ nghiệm
Pha dung dịch gốc 10 |xmol/ml D-glucose trong đệm 50 mM Na-acetate. Từ đó
pha loãng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (^mol/ml). Lấy 50 |xl dịch D-glucose ở
mỗi nồng độ trên + 450 |J,1 dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750 (0.1 dịch
thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng Ằ,540nm .
❖ Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây
dựng nhờ chương trình Microsoft Excel thể hiện ở phương trình thể hiện mối tương
quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị ODs40nm là y = 18,582x+0,261.
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong lml dịch X là giá trị OD54Q
nm
tương ứng Hệ số tương quan R
2
= 0,9876 chứng tỏ mối liên quan giữa X và y là rất
chặt chẽ.
❖ Xác định hoạt tính của CMCase
❖ Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được
mẫu cần kiểm tra. Sau đó lấy 450 |J,1 dung dịch 0,5% CMC + 50 Jil dịch enzyme đã
pha loãng thích hợp. ủ ở 50°c trong 30 phút, sau đó bổ sung 750 |J,1 dung dịch DNS
để dừng phản ứng.
❖ Mầu đối chứng: 50 |J,1 dịch enzyme đã pha loãng thích hợp + 750 |J,1 dung dịch
DNS làm bất hoạt enzyme + 450 p.1 dung dịch 0,5% CMC , ủ ở 50°c trong 30 phút.
= 0,9928 chứng tỏ mối liên hệ giữa
y
và
X
là chặt chẽ.
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc
thu được mẫu cần kiểm tra. Xác định protein tổng số, tiến hành thí nghiệm bằng cách
lấy 800 nl dung dịch protein cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm
200 (0.1 thuốc thử Bradford, ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở
A595JUI1. Xác định hàm lượng protein theo phương trình thu được y = 22,786x-
0,3047 trong đó y là lượng BSA có trong 1 ml dịch,
X
là giá trị OD595
nm
tương ứng.
Từ kết quả phân tích ta tính ra được lượng protein tổng số/ gam mẫu
[22].
2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng đường tổng sổ
Phương pháp phenol-acid-sulfuric của Michel và Cs *1* Nguyên lý
Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các
ether methyl) không hoặc có các nhóm có tính khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý
bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
❖ Tiến hành thỉ nghiêm
Dung dịch gốc 10 ^mol/ml D-xylose, sau đó pha loãng thành các nồng độ 0,2
đến 2,0 |a.mol/ml. Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5 ml
dung dịch 5% phenol, 2,5 ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng
Copyright: Tài liệu đại học ©