Tạp chí NN&PTNT số 19/2007, trang 69-75
ứng dụng của chỉ thị phân tử (RAPD v ADN lục lạp) trong
nghiên cứu đa dạng di truyền v xây dựng vờn giống cây
cóc hnh
TS. Nguyễn Việt Cờng TTCNSH lâm nghiệp
TS. Phạm Đức Tuấn Cục Lâm Nghiệp Dự án DANIDA

Tóm tắt
ứng dụng của chỉ thị phân tử (RAPD và ADN lục lạp) trong nghiên cứu đa dạng di truyền cho 40 dòng cây trội
Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta excelsa) đợc tuyển chọn trong rừng khộp tự nhiên khô hạn của ở 6 xã
của 2 huyện Ninh Sơn và Bắc Aí thuộc tỉnh Ninh Thuận. Mồi sử dụng cho nhân PCR là các mồi ngẫu nhiên
RAPD của hãng OPERON (Mỹ) gồm: OPC10, OPC18, OPC14, OPC20, OPB17, OPC13 (bảng 2) và 2 mồi lục
lạp gồm rnH - trnK và atpB - rbcL. Kết quả cho thấy 40 dòng cây trội Xoan chịu hạn Ninh Thuận (Azadirachta
excelsa) có mức độ đa dạng di truyền thấp, mặc dù các cây trội đợc chọn lọc đều ở rừng tự nhiên và có khoảng
cách về không gian khá xa. Từ bảng hệ số tơng đồng của các dòng cây trội, có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có
quan hệ di truyền xa nhau khi xây dựng vờn giống nhằm nâng cao khả năng tổ hợp chung của các cây trong
vờn giống khi giao phối với nhau. Các dòng có quan hệ di truyền quá gần gũi cần phải loại bỏ là X11, X22,
X35, X37, X43, X50, nh vậy 34 dòng còn lại vẫn đáp ứng đợc tiêu chuẩn công nhận giống cây lâm nghiệp
TCN 147 -2006 về xây dựng vờn giống.
Từ khóa: Chỉ thị phân tử, trình tự cpADN, cây Cóc hành

I. Đặt vấn đề
Ngày nay công nghệ sinh học đã có những tiến bộ vợt bậc giúp cho các nhà khoa học
rút ngắn đợc quá trình nghiên cứu chọn tạo giống của mình. Kỹ thuật nhân ADN đặc hiệu,
còn gọi là chuỗi phản ứng trùng hợp hay kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) đợc
hoàn thiện vào giữa những năm 80 đã đem đến sự tiến bộ ở tất cả các lĩnh vực của sinh học
hiện đại, trong đó chỉ thị phân tử đóng vai trò ngày càng quan trọng trong nghiên cứu đa dạng
di truyền (7). Những ứng dụng này giúp các nhà chọn giống loại bỏ nhanh và chính xác các
cây có quan hệ di truyền quá gần gũi trong xây dựng vờn giống.
Trong nghiên cứu đa dạng di truyền chỉ thị RAPD (Ramdom Amplified Polymorphism
DNA đa hình các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên) đợc dùng phổ biến vì kỹ thuật này đơn giản,


Bảng1: Một số đặc trng hình thái của 3 loài( Xoan ta, Cóc hành, Xoan chịu hạn)
Tên thờng gọi
Tên khoa học
Xoan ta
M. azedarach L
Cóc hành
A. exselsa Jack
Xoan chịu hạn (Neem)
A. indica A.Juss
Chiều cao (m) 15 - 20 20 - 30 25 - 30
D
1.3
(cm) 30 - 70 50 - 60 50 70
Vỏ Xám, nâu trơn Xám, trắng, nâu đỏ,
nứt dọc, rộng
Nâu đen hay xám, nứt
dọc, rảnh
Tán lá Rụng lá mùa đông,
xanh đậm
Thờng xanh, xanh
bóng
Thờng xanh, vàng
nhạt mùa khô
Lá Kép lông chim 2
lần, lẻ, mép răng ca
Kép lông chim 1 lần,
chẵn, mép răng ca
Kép lông chim 1 lần,
chẵn, mép răng ca

TT Tên mồi lục lạp Trình tự
1
trnH -
trnK
ACG GGA ATT GAA CCC GCG CA
CCG ACT AGT TCC GGG TTC GA
2
atpB -
rbcL
TAG TCT CTG TTT GTT CTC AT
ATT TGA ACT GGT GAC ACG AG
2. Phơng pháp
ADN genome của các cây trội Cóc Hành đợc tách từ các mẫu lá khô đợc bảo quản
bằng silicagel theo phơng pháp CTAB của Saghai Maroof. Sản phẩm PCR đợc điện di trên
gel agarose 0,8% (thông thờng ở các cây nông nghiệp sản phẩm PCR đợc điện di trên gel
agarose từ 1-1,5% để có độ phân giải tốt hơn, tuy nhiên đối cây rừng khi sử dụng agarose
0,8% đã cho độ phân giải rất tốt, xem các hình 1 từ 1 đến 5, do vậy trong nghiên cứu này
không sử dụng agarose ở nồng độ cao để tiết kiện kinh phí), quan sát dới đèn cực tím và chụp
ảnh bằng hệ thống Thermal Imaging SystemFTI-500, Farmacia Biotech.
Kỹ thuật PCR với các mồi ngẫu nhiên RAPD đợc tiến hành với tổng thể tích là
25l/mẫu gồm những thành phần sau: ADN tổng số (50 ng); mồi RAPD (10 ng); dNTP (2,5
mM); MgCl
2
(50 mM); enzym Taq polymerase (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu
trình nhiệt bao gồm các bớc: 94
o
C - 4 phút; 94
o
C - 1 phút; 34
o

nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker). Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu
là 0. Các số liệu này đợc đa vào sử lý theo chơng trình NTSYS pc để tính ma trận tơng
đồng giữa các đôi mẫu theo phơng pháp UPGMA dựa vào hệ số tơng đồng di truyền
Jaccard:
J
ij
= a/(n-d)
Trong đó: a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j; d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng
i và j; n: Tổng số băng thu đợc; J
ij
: Hệ số tơng đồng Jaccard giữa hai dòng i và j. Số liệu thu đợc
đợc sử lý bằng phần mềm NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tơng đồng di truyền và đợc biểu
hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa các dòng cây trội Xoan chụi hạn Ninh Thuận (Azadirachta
excelsa).
III. Kết quả nghiên cứu v THảO luận
1. Kết quả phân tích với các mồi RAPD

3
S¶n phÈm PCR víi c¸c måi RAPD ®−îc ®iÖn di trªn gel agarose 1% (h×nh 1, 2 vµ 3) A
1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 M
28 29 30 32 33 34 35 36 37 39 40 41 42 43 44 46 47 48 49 50 M B

Hình 3 . Sản phẩm PCR ADN genome của một số cây trội Cóc Hành với mồi OPB10
(A) và OPC13 (B).
Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy: Các sản phẩm PCR ADN genome của các cây
trội Cóc Hành với 6 mồi RAPD cho thấy chỉ có mồi OPC20 là không cho đa hình, 5 mồi còn
lại cho đa hình nhng mức độ đa hình thấp. Điều này cho thấy sự đa dạng thấp ở các cây trội
đã chọn lọc ở rừng tự nhiên tại 6 xã thuộc 2 huyện của tỉnh Ninh Thuận. Trong 5 mồi này có
các mồi OPC13, OPB10 và OPB17 cho nhiều băng đa hình hơn. ở mồi OPC13 các mẫu X40,
X42, X43 và X46 đợc nhận biết do sự vắng mặt của các băng 5, 7,10, 12, 13, 15 và sự có mặt
của băng số 6, cũng có thể nhận biết 4 mẫu này ở mồi OPB10. ở mồi OPC14 mẫu X28 đợc
nhận biết do sự vắng mặt của các băng 1-7. 6
2. Kết quả phân tích với các mồi lục lạp
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
26
M 2 26 27 28 29 30 32 33 34 35 36 37 3940 41 42 43 44 46 47484950
M 1 3 5 6 8 11 13 14 15 16 17 18 19
25 20 21 22 23 24 25 26 28 29 30 32 33 34 35 36 37 39404142 43 Hình 4. Sản phẩm PCR ADN genome
của một số cây trội Cóc hành với mồi
lục lạp atpB bcL.

trong vờn giống khi giao phối với nhau.
Nhìn vào hình 6, 7 ta có thể lựa chọn các cặp bố mẹ có quan hệ di truyền xa nhau để
xây dựng vờn giống, có 6 cặp Cóc hành có quan hệ di truyền rất gần gũi nh cặp X32 và
X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37 cần phải loại một nửa trong số đó
trong vì chúng có hệ số tơng đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981. Nh vậy 6 dòng (cây trội )
cần loại khi xây dựng vờn giống là X11, X22, X35, X37, X43, X50. Theo tiêu chuẩn công
nhận giống cây lâm nghiệp TCN 147 -2006 (Quyết định 4108/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng
12 năm 2006) khi xây dựng vờn giống vô tính thế hệ một cần phải có ít nhất 30 dòng vô tính,
đối chiếu với tiêu chuẩn công nhận giống, số dòng Cóc hành đa vào xây dựng vờn giống là
số lợng dòng vô tính (34 dòng).
Coefficient
0.60 0.70 0.80 0.90 1.00

X1
X23
X44
X16
X3
X17
X5
X21
X47
X30
X32
X35
X8
X11
X34
X50
X13

1. Các dòng Cóc hành đợc nghiên cứu ở 6 xã thuộc 2 huyện của tỉnh Ninh Thuận
có mức độ đa dạng di truyền thấp.
2. Có 6 cặp Cóc Hành có hệ số tơng đồng gần bằng 1 từ 0,978 đến 0,981 là cặp
X32 và X35, X8 và X11, X34 và X50, X13 và X22, X19 và X37.
3. Các dòng Cóc hành có quan hệ di truyền gần gũi cần loại khi xây dựng vờn
giống là X11, X22, X35, X37, X43, X50.
2. Kiến nghị: Đây mới là các nghiên cứu bớc đầu về đa dạng di truyền (mới sử dụng 6 mồi
RAPD và 2 mồi lục lạp). Để có thể phân tích sâu sắc và toàn diện hơn về sự khác nhau giữa
các dòng Cóc hành, nên tiếp tục phân tích các mẫu với một số mồi lục lạp khác và tất cả các
sản phẩm PCR với các mồi lục lạp cần đợc cắt với các enzym giới hạn với mục đích tìm ra sự
khác nhau trong trình tự cpADN (chloroplast DNA).

Ti liệu tham khảo
1. Danh mục các loài thực vật Việt Nam tập II, nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội 2003
2. Lee. S. L. Wickneswari R., Mahani M. C., Zarki A. H. (2000), Mating System
parameters in a Tropcal Tree Species, Shorea Leprosula Miq. (Dipterocarpaceae), from
Malaysian Lowland Dipterocarp Forest. Biotropica 32 (4ê): 693-702
3. Nguyễn Tích và Trần Hợp , 1971. Cây rừng Việt Nam. Nhà xuất bản Nông thôn, Hà
Nội.
4. Nicolosi E, Deng. Z. N, Gentile .A, La Malfa. S, Continella. G, Tribulato. E. (2000),
Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular
markers. Theor. Appl. Genet., 100, pp. 1155-1166.
5. Phạm Hoàng Hộ, 1991. Cây cỏ Việt Nam. Nhà xuất bản Montréal.
6. Rohlf F. J. (1993), NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis
system, Version 1.80. Applied Biostatitics, New York.
7. Richar. G, Olmstead, Jeffrey. D, Palmer (1994), Chloroplast DNA Systematics:
Areview of methods and data anlysis. American Journal of Botany, Vol. 81, No. 9,
1205 1224.
8. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W, (1994),
Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity,
10