a

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI
QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018


b

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MÔI TRƯỜNG

LÊ HOÀNG KHẨN

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI
TRUYỀN CỦA CÂY BA KÍCH TẠI
QUẢNG NAM-ĐÀ NẴNG BẰNG CHỈ THỊ
PHÂN TỬ RAPD

Đà Nẵng – Năm 2018


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. I
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... II
MỤC LỤC ........................................................................................................... III
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. V
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ............................................................... VII
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH ............................................................... 3
1.1.1. Phân loại khoa học .......................................................................... 3
1.1.2. Giá trị dược liệu .............................................................................. 3
1.1.3. Phân bố............................................................................................ 4
1.1.4. Một số nghiên cứu đa dạng di truyền và thành phần hóa học của cây
Ba kích trong và ngoài nước ................................................................................. 4
1.2. CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ DỰA TRÊN PHẢN ỨNG PCR TRONG
NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN ............................................................. 6
1.2.1. Chỉ thị RAPD .................................................................................. 6
1.2.2. Kỹ thuật RAPD-SCAR ................................................................... 8
1.2.3. Kỹ thuật ISSR ................................................................................. 9
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 11
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU .............................................. 11
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 11
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 12
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 12


iv
2.2.1. Phương pháp đánh giá hình thái ..................................................... 12
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA ......................................................... 13
2.2.2. Phương pháp điện di trên gel agarose ............................................. 14

arbitrary primed polymerase chain reaction

bp

base pair

CAPS

cleaved amplified polymorphics sequences

cs

cộng sự

CTAB

cetyltrimethyl-ammonium bromide

DAF

DNA amplification fingerprinting

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleoside triphophate


polymerase chain reaction

RAPD

randomly amplified polymorphic DNA


vi
SRAP

sequence related amplified polymorphism

SSR

simple sequence repeats

PIC

Polymorphic Information Content

TAE

Tris-Acetic acid-EDTA


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Danh mục các bảng:
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu mẫu............................................................... 12

NTSYSPC 2.0 với hệ số là NEI72, phương pháp Clustering SAHN. ................ 26


1

MỞ ĐẦU
Cây Ba kích (Morinda officinalis How.) thuộc họ cà phê (Rubiaseae) là loại
thảo dược quý. Ba kích thường mọc trong tự nhiên, mọc dại ở những vùng đồi,
núi đồi trung du miền núi phía bắc Việt Nam như: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc
Giang, Hà Giang, Quảng Nam....
Củ của cây Ba kích được sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác
dụng bổ thận âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức đề kháng, sức dẻo
dai và khử phong thấp [22]. Dịch chiết từ củ Ba kích có tác dụng giảm huyết áp,
tác dụng nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não giúp ăn và ngủ ngon [21]. Ở Việt
Nam, nghiên cứu của Trần Mỹ Tiên và cs. (2012) khi thử nghiệm trên chuột, đã
chứng minh dịch chiết của rễ cây Ba kích có ảnh hưởng đến tính sinh dục đực
[12].
Thực trạng hiện này cho thấy nhu cầu sử dụng rễ Ba kích ngày càng tăng
dẫn đến hiện tượng khai thác quá mức làm cho số lượng cây trong tự nhiên giảm
nhanh. Chính vì vậy Ba kích rơi vào tình trạng gần như tuyệt chủng trong tự nhiên
và đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam cần được bảo vệ [1].
Ở Việt Nam, tỉnh Quảng Nam đã từng xảy ra tình trạng khai thác cạn kiệt
nên tỉnh đã bắt đầu đưa loại cây này vào sản xuất từ năm 2006, nhưng nguồn
giống vẫn chưa ổn định về tính di truyền, vẫn chưa xác định được quan hệ họ hàng
các giống giữa các vùng.
Mỗi vùng đều có những điều kiện sinh thái nhất định ảnh hưởng đến quá
trình sống cũng như bảo tồn nguồn gen của chúng, qua quá trình chọn lọc tự nhiên
có những giống mang được các đặc tính di truyền quý của địa phương, có những
giống lại không đáp ứng được điều đó. Ban đầu huyện Tây Giang (Quảng Nam)
là nơi phát hiện và trồng cây Ba kích, sau đó nhân rộng và được trồng ở nhiều khu

dạng di truyền của cây Ba kích tại Quảng Nam-Đà Nẵng bằng chỉ thị phân
tử RAPD”,


3

Phần 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CÂY BA KÍCH

1.1.1. Phân loại khoa học
Ba kích có tên khoa học là Morinda officinalis How., thuộc họ Cà phê Rubiaceae, tại Việt Nam Ba kích còn có nhiều tên gọi: Dây ruột gà, Ba kích thiên,
Liên châu Ba kích, Chẩu phòng xì (Mông), Sáy cáy (Thái), Thau tày cáy (Tày),
Chồi hoàng kim (Mường), Chày kiàng đòi (Dao).
Ba kích là cây lâu năm, dạng thân leo cuốn vào giá đỡ. Rễ có thịt dày, hình
trụ tròn, cong queo, thắt thành từng đoạn như ruột gà, được chế biến sử dụng làm
thuốc. Thân hình trụ tròn, phân nhánh nhiều. Cành non có lông thô màu nâu khi
già nhẵn không lông. Lá đơn nguyên, mọc đối chéo chữ thập, có cuống. Lá kim
nhỏ hợp thành ống màu xám nâu. Phiến lá hình elip thuôn dài, lá non màu tím có
lông, lá già màu xanh không lông. Cụm hoa ở nách lá hay đầu cành. Hoa nhỏ màu
trắng ngà. Quả khi còn non màu xanh, khi chín màu hồng
1.1.2. Giá trị dược liệu
Theo y học hiện đại Ba kích có tác dụng: Tăng cường sức đề kháng của cơ
thể đối với các yếu tố độc hại, chống viêm, điều hoà hoạt động nội tiết. Đối với
nam giới có hoạt động sinh lý yếu Ba kích có tác dụng làm tang khả năng giao
hợp. Đối với người già hoặc những bệnh nhân đau mỏi khớp, Ba kích có tác dụng
giảm đau rõ rệt sau khi sử dụng Ba kích dài ngày. Rễ Ba kích chiết xuất bằng rượu
có tác dụng giảm áp huyết, có tác dụng nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng
cường não [5].

ở mức độ phân tử [16].
b. Các nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu của Chu Thị Thu Hà về tính đa dạng di truyền của cây Ba kích
ở tỉnh Quảng Ninh bằng chỉ thị ISSR năm 2015 đã chọn được 6 mồi ISSR để tiến
hành phân tích bằng phương pháp PCR-ISSR cho tỉ lệ băng đa hình là 93,2% và


5
giá trị PIC trung bình là 0,7799. Kết quả cho thấy các mẫu Ba kích được chia
thành 2 nhóm với hệ số tương đồng di truyền dao động trong khoảng 0,32 đến
0,88 từ đó khẳng định có sự đa dạng mức loài ở cây Ba kích ở mức độ phân tử
[5].
Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích của Võ Châu Tuấn và cs (2010).
Trong nghiên cứu này tác giả đã sử dụng đoạn thân (khoảng 1cm) để tái sinh chồi
in vitro trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,25 mg/L Kinetin. Sau đó các
chồi này tiếp tục được nhân nhanh trong các môi trường có bổ sung các chất kích
thích sinh trưởng. Số lượng chồi đạt nhiều nhất trên môi trường MS có bổ sung
3,5 mg/L BA + 0,2 mg/L IBA là 15 chồi/ mẫu cấy. Chồi được đưa vào môi trường
tái sinh rễ tốt nhất là môi trường MS có bổ sung 0,25 mg/L IBA. Cây con in vitro
được đưa ra nhà lưới thu được kết quả đạt 97,9% thích nghi [11].
c. Tình trạng khai thác cây Ba kích tại Quảng Nam – Đà Nẵng
Thấy được giá trị dược học, giá trị kinh tế của cây Ba kích vô cùng to lớn,
điều đó dẫn đến việc khai thác một cách ồ ạt, thiếu kiểm soát. Chính vì vậy đã làm
cho số lượng cây Ba kích ngoài tự nhiên giảm mạnh, tính đa dạng về cây Ba kích
giảm nhanh, có nguy cơ tuyệt chủng. Ba kích đã được đưa vào Sách đỏ Việt Nam
cần được bảo vệ [1]. Tình trạng này cũng đã và đang xảy ra tại vùng Quảng NamĐà Nẵng.
Sau tình trạng khai thác ồ ạt, tính từ sau năm 2006, tại khu vực Quảng NamĐà Nẵng đã tiến hành trồng cây Ba kích. Ban đầu, giống Ba kích được lấy từ khu
vực vùng núi xã Lăng (Tây Giang, Quảng Nam) và được trồng nhiều tại đây bằng
phương pháp dâm hom. Sau đó, Ba kích được trồng sang nhiều khu vực khác:
Nam Giang, Đông Giang, Hòa Khánh (Đà Nẵng) …. Không những thế, trong

phân tử để có được các thông tin di truyền nhưng RAPD vẫn được sử dụng bởi
một số lý do. Phương pháp này có những thuận lợi đáng kể so với các phương
pháp khác bởi vì nó nhanh, yêu cầu lượng DNA ít, phù hợp khi làm việc trên
genome chưa từng biết trước, có tính kinh tế, không liên quan đến các thủ tục
phức tạp liên quan đến xác định trình tự DNA, chỉ yêu cầu một phòng thí nghiệm
đơn giản với phương tiện tối thiểu cho thực hiện PCR, và có thể phát hiện đa hình
trong bất kì loại trình tự nào [6], [14].


7
Theo nguyên tắc của kỹ thuật RAPD, hai cá thể hoàn toàn giống nhau sau
khi thực hiện phản ứng PCR-RAPD ở những điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng
và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay
mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng và chiều dài các đoạn DNA
khác nhau giữa các cá thể. RAPD là công cụ hữu hiệu, đã được ứng dụng rộng rãi
để phân tích đa dạng di truyền cũng như xác định mối quan hệ họ hàng giữa các
loài với nhau [6], [14].
Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR, sử dụng một mồi duy
nhất, một đoạn oligonucleotide ngẫu nhiên được chọn để khuếch đại vùng gene
bên cạnh của hai vị trí gắn mồi có chiều ngược nhau. Thông thường, trong phân
tích RAPD, mỗi mồi là một đoạn oligonucleotide dài 10 mer với khoảng 60-70%
G+C và không tự bắt cặp với nhau, nhiệt độ bắt cặp thấp (37 - 40°C). Mồi bắt cặp
với trình tự mà giống hệt hoặc tương đồng cao trên DNA khuôn mẫu mặc dù có
một vài điểm không tương đồng, đặc biệt là ở đầu 5’. Sự đa hình được phát hiện
là do sự xuất hiện hay không xuất hiện băng và có thể do cả việc thay đổi trong
trình tự bắt cặp của mồi và cả do hiện tượng chèn đoạn/mất đoạn giữa hai vị trí
gắn mồi [6], [14].
Hầu như tất cả các marker RAPD là maker trội. Nó không có khả năng phân
biệt đoạn DNA được khuếch đại từ một locus là đồng hợp (2 bản sao) hay dị hợp
(1 bản sao). Hiếm khi có marker RAPD đồng trội nhận biết được kích thước khác

tra bằng phân tích RAPD. Dữ liệu cho thấy C.maxima cùng nhóm với các loài C.
hongheensis và C.latipes. Thanh yên (C. medica) cùng nhóm với C.indica, chanh
cốm, chanh và các dạng gần gũi. Quýt không thực sự thuộc về nhóm trên mà là
một loài khác, kết quả nghiên cứu cũng cho thấy có rất nhiều mẫu đã được xác
định loài sai [9].
1.2.2. Kỹ thuật RAPD-SCAR
Kỹ thuật SCAR là một trong những kỹ thuật được cải tiến từ kỹ thuật RAPD.
Phân tích RAPD đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu di truyền học quần thể, bản
đồ gene, … và là marker hỗ trợ lựa chọn các đặc điểm tốt quan tâm. Tuy nhiên, phân
tích RAPD nhạy cảm với những điều kiện phản ứng, thỉnh thoảng dẫn đến kết quả


9
không thể lặp lại. Do đó, những amplicon RAPD được phát triển thành marker
SCAR. Đối với kỹ thuật này, marker RAPD được giải trình tự và những primer có
chiều dài lớn hơn được thiết kế để sử dụng đặc hiệu cho từng locus cụ thể. Những
mồi SCAR dài hơn (thường 18-24 nucleotide) có nhiệt độ gắn mồi cao hơn nên đặc
hiệu và có thể lặp lại. SCAR sử dụng hiệu quả cho nghiên cứu lập bản đồ gene
(SCAR đồng trội), so sánh bản đồ gene, hay nghiên cứu mối quan hệ tương đồng
giữa các loài, kiểu gene và marker hỗ trợ chọn lọc các đặc điểm tốt quan tâm [6],
[14].
Trong các chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở PCR được sử dụng rộng rãi nhất
trong các nghiên cứu đa dạng di truyền, SCAR có những ưu điểm như ít nhạy cảm
hơn đối với điều kiện của một phản ứng PCR chuẩn do kích thước primer của nó
dài hơn nhiều so với RAPD do đó tính đặc hiệu và tính lặp lại cao hơn. Hơn nữa,
SCAR không yêu cầu hóa chất đồng vị phóng xạ và chỉ phát hiện các locus đơn.
Marker SCAR đã được sử dụng để nhận dạng loài trong đa dạng loài như ở thực
vật, côn trùng, vi sinh vật và động vật [14].
1.2.3. Kỹ thuật ISSR
Chỉ thị ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) được sử dụng lần đầu tiên vào

thu mẫu sẽ tìm hiểu kỹ nguồn gốc của giống, nơi cung cấp giống, và nơi xuất
giống, qua đó mở rộng phạm vi thu mẫu, khảo sát mẫu.


12
Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu mẫu
Địa điểm thu
mẫu

Nguồn gốc

Toạ độ

Ký
hiệu

Cây trồng

15.858786,107.473520

BK1

Xã Lăng, Tây
Giang, Quảng
Nam

Xã A Tiêng,
Tây Giang,
Quảng Nam


BK5

Phòng CNSH khoa SinhMôi trường, ĐH Sư
phạm- ĐH Đà Nẵng

16.062573,108.158239

BK8

Quảng Ninh

16.058450,108.135388

BK2

Phú Thọ

16.058450,108.135388

BK9

Quảng Trị

16.058450,108.135388

BK3

Đà Nẵng.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu

20 mmol/l

NaCl

0.25 mol/l

1.4 mol/l

1%

0%

β-mercaptoethanol
Quy trình thực hiện:

⁃ Lấy khoảng 0,3g mẫu nghiền thành bột mịn trong ống eppendorf 1.5 ml có

bổ sung 1ml dung dịch đệm rửa (đã được làm mát ở 40C) (chứa 0.2 mol/l TrisHCl, 50 mmol/l EDTA, 0.25 mol/l NaCl, pH = 8) cùng với 10 µl βmercaptoethanol, trộn đều; giữ ở 00C trong 10 phút, ly tâm 7 000 vòng trong 10
phút; thu kết tủa.
⁃ Lặp lại bước trên.
⁃ Bổ sung 1ml CTAB (chứa 1.4 mol/l NaCl, 1mol/l Tris, 20 mmol/l EDTA,

20 g/l CTAB, pH =8; 650C), trộn đều; ủ ở nhiệt độ 650C trong 1h (cứ 15 phút lắc
1 lần); Ly tâm 7 000 vòng trong 10 phút; dịch nổi được chuyển sang một
eppendorf vô trùng khác.
⁃ Bổ sung một lượng thể tích tương đương dung dịch choloroform/isoamyl

(24:1), lắc đều; ly tâm 10 000 vòng trong 10 phút; chuyển phần dịch dịch nổi sang
một ống eppendorf vô trùng khác.
⁃ Lặp lại bước trên


Trình tự đoạn mồi STT Tên đoạn Trình tự đoạn mồi (3’-

mồi

(3’-5’)

mồi

5’)

1

OPA-02

TGCCGAGCTG

6

OPD-01

ACCGCGAAGG

2

OPA-17

GACCGCTTGT

7


OPC-04

CCGCATCTAC

10

OPF-11

TTGGTACCCC

2.2.5. Phân tích sản phẩm phản ứng PCR-RAPD
Sau khi phản ứng PCR kết thúc, điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose
1.5% với điều kiện điện di 30 Vol trong thời gian 3 giờ. Hình ảnh gel được hiển
thị bằng thiết bị UV ECX-20.C (European Economic Community).
Các băng DNA được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở
các mẫu nghiên cứu và tính toán theo DNA Ladder. Nếu một băng DNA xuất hiện
ở mẫu A nhưng không xuất hiện ở mẫu B hoặc đồng thời xuất hiện ở cả A và B
nhưng không xuất hiện ở các mẫu khác thì băng DNA này được gọi là DNA đa
hình. Ngược lại, nếu băng DNA này xuất hiện ở tất cả các mẫu thì gọi là băng đơn
hình.
Các băng được mã hoá bằng số tự nhiên 0 và 1. Nếu mẫu nào có băng thì kí
hiệu là 1, không có kí hiệu là 0. Các số liệu này được phân tích bằng phần mềm