BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG
DI TRUYỀN CỦA CÂY ĐƢỚC ĐÔI (RHIZOPHORA APICULATA
BLUME) Ở KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN
CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: VÕ CÔNG DANH

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007
iii

LỜI CẢM TẠ

Không ngôn từ nào có thể nói hết tình yêu con dành cho Ba Mẹ, ngƣời sẵn sàng hy
sinh tất cả vì con.
Cảm ơn các anh em, những ngƣời luôn tạo động lực cho tôi tiến lên.
Em xin chân thành cảm ơn:
Các Thầy Cô trong trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận
tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt bốn năm học.
Ban chủ nhiệm cùng các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học
đã động viên, giúp đỡ em trong thời gian thực hiện khóa luận.
Thầy Bùi Minh Trí đã tận tình chỉ dẫn em trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận.
Chị Hƣng, chị Dung, chi Trân, anh Thế, anh Phƣơng, anh Khoa cùng
các anh chị trong Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Công nghệ
Môi trƣờng đã động viên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện khóa
luận.
Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình thu thập mẫu.
Anh Bình, anh Kiệt cùng các anh trong phòng Kỹ thuật thuộc Ban quản
lý Rừng phòng hộ Cần Giờ đã tận tình giúp đỡ em trong quá trình thu
thập mẫu. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học 29 đã cùng tôi
chia sẻ biết bao niềm vui, nỗi buồn trong suốt bốn năm đại học.
( II )
( III )
v

SUMMARY

VO CONG DANH, Nong Lam University Ho Chi Minh City, September 2007.
“DEVELOP A METHOD TO ACEESS THE GENETIC DIVERSITY OF
Rhizophora apiculata Blume IN CAN GIO MANGROVE BIOPHERE RESERVE
BY RAPD-PCR”
Mangrove population (Rhizophora apiculata Blume) in Can Gio swamp
forest eco-conservation area has a high economic and environmental value.
Researching the genetic diversity of this plant is necessary to preserve and develop
this area in a sustainable way.
Obtained results were:
Collected 40 samples of Rhizophora apiculata
Found out the best conditions to preserve Rhizophora apiculata
Completed DNA extraction protocol from Rhizophora apiculata
Established RAPD protocol for Rhizophora apiculata
We analysed 10 samples using RAPD with primer OPAC 10 and got 5
polymorphic bands (100 – 600kb) and 1 monomorphic band (170 kb) which made
up 83,3 percents and 16,7 percents of bands.
Analyse RAPD data with NTSYSpc software showed following results:
Rhizophora apiculata planted in 1978, 1980 had high similarity from 0,83 to 1,00.
Compare R. apiculata planted in 1978 with the one planted in 1980 showed a
similarity from 0,50 to 0,83. The similarity of local R. apiculata and the one planted
in 1991 or in 1996 is 0,50. While the local R. apiculata and the one from Camau
plants had long distance from 0,33 to 0,67.

2.4. PCR (Polymerase chain reaction) 12
2.4.1. Khái niệm 12
2.4.2. Nguyên tắc 13
2.4.3. Ứng dụng 13
2.4.4. Ƣu và nhƣợc điểm 13
2.5. Đa dạng di truyền 14
2.5.1. Khái niệm 14
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền 14
2.6. Chỉ thị phân tử DNA (DNA marker) 15
2.6.1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 16
2.6.2. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 17
2.6.3. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18
2.6.4. Một số nghiên cứu về chỉ thị phân tử trên cây đƣớc 21
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 22
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 22
3.1.1. Thời gian thực hiện 22
3.1.2. Địa điểm thực hiện 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm 22
3.1.2. Mẫu đƣớc đôi 22
3.2.2. Hoá chất thí nghiệm 23
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 24
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 25
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 25
3.3.2. Phƣơng pháp ly trích DNA 25
3.3.3. Kiểm tra kết quả ly trích 28
3.3.4. Kỹ thuật RAPD 30
viii

3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS 34
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

EB: Extraction Buffer
EDTA: Ethylene diaminetetra acetic acid
ng: Nanogram
OD: Optical density
PCR: Polymerase chain reaction
RNA: Ribonucleic acid
RNase: Ribonuclease
RAPD: Random Amplified Polymorphism of DNA
SDS: Sodium Dodecyl Sulfate
SIDA: Swedish Inernaional Devolopment cooperration Agency
TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA
TE: Tris EDTA
Tm: Melting temperature
UNESCO: United Nations Educational Scientific and Cultural Organization
UBND: Ủy ban Nhân dân
UV: Ultra Violet x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 4
Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 19
Hình 3.1 Lá, hoa, trái của cây đƣớc đôi 23
Hình 4.1 Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 36
Hình 4.2 DNA tổng số của 4 mẫu đƣớc thu thập ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập
mặn Cần Giờ (Ly trích theo 3 quy trình ) 40
Hình 4.3 DNA tổng số của 6 mẫu lá đƣớc (Lá già và lá non) thu thập ở khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ (Ly trích theo quy trình 3). 40

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD 31
Bảng 3.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg
2+
đến sản phẩm RAPD
với primer OPAC10 32
Bảng 3.4
Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD
với primer OPAC10 33
Bảng 3.5 Thực hiện phản ứng RAPD với primer OPA10 và OPAC10. 33
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất thích hợp sử dụng trong phản ứng RAPD 33
Bảng 4.1 Bảng giá trị OD của 6 mẫu đƣớc (Lá non và lá già) thu thập ở khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 10 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với
chỉ thị phân tử RAPD 42
Bảng 4.2 Bảng giá trị OD của 10 mẫu đƣớc dùng để thực hiện phản ứng PCR với
chỉ thị phân tử RAPD 43
Sơ đồ 4.1 Sơ đồ ly trích DNA từ lá đƣớc đôi theo quy trình 3 39
1 Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đƣớc đôi hay đƣớc (Rhizophora apiculata Blume) là cây có giá trị về kinh
tế và môi trƣờng. Gỗ đƣớc đƣợc sử dụng rộng rãi trong xây dựng nhà cửa, đóng vật
dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh bắt thủy sản. Than đƣớc
cho nhiệt lƣợng cao và ít khói [13]. Vỏ có nhiều tanin đƣợc dùng trong công nghệ
thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo dán. Rừng đƣớc sản
sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa
sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng
sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở và ngăn

rừng ngập mặn Cần Giờ.
1.2.2. Yêu cầu
Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số từ mẫu lá đƣớc
Nắm vững kỹ thuật RAPD, hạn chế sai sót khi thực hiện
Hiểu rõ phần mềm NTSYSpc 2.1
1.2.3. Giới hạn đề tài
Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu đối với quần thể đƣớc tại một số tiểu khu
trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
Chỉ tiến hành kiểm tra 2 primer chọn lọc dùng trong RAPD
Thời gian thực hiện từ ngày 08/05/2007 đến 30/08/2007.

3 Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
2.1.1. Giới thiệu khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ nằm ở địa bàn huyện Cần Giờ,
đƣợc hình thành ở hạ lƣu sông Đồng Nai - Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam
Thành phố Hồ Chí Minh có tọa độ địa lý nhƣ sau:
Vĩ độ Bắc 10
0
22’14’’ – 10
0
37’9”
Kinh độ Đông 106
0
46’12’’ – 107
0
Thảm thực vật Cần Giờ là môi trƣờng sống cho nhiều loài động vật; Theo
thống kê năm 1999 nhƣ sau:
Khu hệ động vật thủy sinh không xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ,
19 bộ, 6 lớp, 5 ngành.
Khu hệ cá có trên 137 loài thuộc 39 họ và 13 bộ.

Ghi chú:
Vùng đệm

Vùng lõi

hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.
Bảo tồn thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển để tái sinh tự nhiên
cả các loài thực vật lẫn động vật.
Nghiên cứu khoa học
6 Du lịch sinh thái (Phải có giới hạn). [5]
2.1.2.2. Vùng đệm
Tổng diện tích: 37.339 ha bao gồm các tiểu khu 1, 2, 4a, 5, 7, 9, 10, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 và 24.
Chức năng: phục hồi các hệ sinh thái dựa trên các quần xã chiếm ƣu thế, bao
gồm:
Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.
Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hoá nhân văn phục vụ cho du lịch sinh
thái.
Các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với môi trƣờng cũng đƣợc ứng
dụng trong vùng này cho cƣ dân địa phƣơng.
2.1.2.3. Vùng chuyển tiếp
Tổng diện tích: 29.310 ha bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ
cả các khu lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ biển dọc theo ven biển Cần
Thạnh, Long Hoà, Lý Nhơn.
Chức năng:
Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các
loại sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất
và tài nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với
mục tiêu của khu dự trữ sinh quyển. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên
nhiên cần phải đƣợc hài hòa.
Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục
tiêu mở rộng không gian có sẵn nhƣ môi trƣờng sống cho các loài thú

. [5]
Các loài vi sinh vật trong đất, trong nƣớc sinh sôi phát triển nhƣ vi khuẩn,
nấm sợi, nấm men. Chúng có khả năng phân huỷ các chất hữu cơ rơi rụng, các xác
bã động thực vật, khoáng hóa thành các chất dinh dƣỡng, thức ăn cung cấp cho các
loài động thực vật rừng ngập mặn. Đặc biệt một số loài nấm sợi, nấm men có khả
năng phân giải dầu DO rất mạnh, làm cho nguồn nƣớc bị ô nhiễm trở nên trong
sạch. [5]
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là môi trƣờng cung cấp thức
ăn và bảo vệ các loài thuỷ sản sinh sôi, phát triển. Cây rừng có tác dụng điều hoà
nhiệt độ nƣớc và không khí. Nguồn lợi thủy sản xuất khẩu của Cần Giờ mang lại là
rất lớn. Hàng năm đạt từ 400 - 500 tỷ đồng, góp phần quan trọng nâng cao đời sống
nhân dân vùng rừng Cần Giờ. [5]
Sau khi rừng Cần Giờ đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển của thế giới,
lƣợng du khách đến tham quan, nghỉ ngơi, học tập và nghiên cứu khoa học ngày
càng tăng và số tiền thu đƣợc mỗi năm hàng chục tỷ đồng. Các hoạt động du lịch
8 sinh thái đã và đang tăng lên, tạo ra thêm nhiều công ăn việc làm nâng cao đời sống
ngƣời dân. [5]
2.2 Đặc điểm sinh vật học và hình thái học của cây đƣớc đôi
Giới: Plantae
Nhóm: Tracheophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Rhizophorales
Họ: Rhizophoraceae
Giống: Rhizophora
Loài: Rhizophora apiculata
2.2.1. Hình thái học
Thân: cây cao 20 – 30 m, đƣờng kính có thể đạt tới 50 cm vỏ đen hay nâu sậm

dựng nhà cửa, đóng vật dụng, làm tà vẹt, chống lò, làm giấy và làm dụng cụ đánh
bắt thủy sản. Than đƣớc cho nhiệt lƣợng cao và ít khói. Vỏ có nhiều tanin đƣợc
dùng trong công nghệ thuộc da, công nghệ dƣợc phẩm, kỹ nghệ in, nhuộm, làm keo
dán. Đƣớc sau khi trồng 15 năm có thể thu đƣợc 15 tấn gỗ/ha [13]. Rừng đƣớc sản
sinh nhiều bã mùn làm nền tảng cho chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển, cửa
sông. Các khu rừng đƣớc có vai trò vô cùng quan trọng vào việc duy trì cân bằng
sinh thái làm cho khí hậu dịu mát, giảm biên độ nhiệt, giảm quá trình xói lở, sa mạc
hóa, ngăn chặn có hiệu quả tác động công phá của sóng biển. Hơn thế nữa các khu
rừng đƣớc là nơi cƣ trú của nhiều loài động vật hoang dã quý hiếm.
2.3. Quy trình ly trích DNA thực vật
Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott O.Rogers
và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990), quy trình
của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm
riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng đƣợc cũng nhƣ yêu cầu về chất lƣợng, số
lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá thành cũng
10 là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp tách chiết
thích hợp.
Phƣơng pháp ly trích DNA cơ bản gồm ba bƣớc:
Bƣớc 1: phá màng tế bào và màng nhân bằng phƣơng pháp cơ học (nghiền).
Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào, trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS,
Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ màng tế bào
và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời phân hủy các protein liên
kết với DNA. Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt
động của các enzyme thủy phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào
bằng cách nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (-198
0
C). Sau đó sử

OD trong điều kiện sóng 260 nm (OD
260
) sẽ cho kết quả nồng độ DNA ở 50 μg/ml
của DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid
tinh sạch. Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị hấp thu
bƣớc sóng 280 nm (OD
280
). Tỷ số OD
260
/OD
280
là chỉ số cho thấy độ nhiễm các chất
nhƣ phenol hoặc protein. Tỷ số OD
260
/OD
280
là 1,8 đối với DNA tinh khiết.
2.3.1.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của acid nucleic là ở pH trung tính
chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung photphodiester
của các sợi acid nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi
đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một giá thể bán rắn gọi
là gel có tác dụng phân tách các phân tử acid nucleic theo kích thƣớc. Các phân tử
acid nucleic đi qua những lỗ nhỏ trong gel, kích thƣớc phân tử càng lớn thì di
chuyển càng chậm trong gel. Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng
đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các
lỗ có trong gel. Tùy theo kích thƣớc các phân tử cần phân tích ngƣời ta sử dụng 1
trong 2 loại gel:
Polyacryamid: phân tích DNA sợi đơn kích thƣớc dƣới 500 bp. Gel đƣợc đổ
giữa 2 tấm thuỷ tinh và phƣơng điện di là phƣơng thẳng đứng. Các phân tử DNA

thu nhận từ DNA mẫu. [6]
Loại gel
Phạm vi phân tách (bp)
0,3% agarose
50.000 đến 1000
0,7% agarose
20000 đến 300
1,4% agarose
6000 đến 300
4% acrylamid
1000 đến 100
10% acrylamid
500 đến 25
20% acrylamid
50 đến 1
13 2.4.2. Nguyên tắc
Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 25-35 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các
bƣớc: Biến tính DNA, gắn mồi và kéo dài.
Biến tính: đây là bƣớc làm biến tính DNA mẫu từ sợi kép thành sợi đơn.
Nhiệt độ thiết kế là 94
0
C
Gắn mồi: đây là bƣớc primer gắn đặc hiệu vào sợi DNA đích (sợi đơn).
Nhiệt độ thay đổi từ 50 - 60
0
C. Nhiệt độ trong bƣớc này tùy thuộc vào độ
dài của cặp primer.

2.4.4.1. Ƣu điểm
Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện
đƣợc.
2.4.4.2. Nhƣợc điểm
Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong
một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì
phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.
2.5. Đa dạng di truyền
2.5.1.Khái niệm
Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần gene giữa các cá thể trong cùng
một loài và giữa các loài khác nhau; là sự đa dạng về gene có thể di truyền đƣợc
trong một quần thể hoặc giữa các quần thể. [18]
2.5.2. Ý nghĩa nghiên cứu đa dạng di truyền
Việc nghiên cứu đa dạng di truyền có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong chiến
lƣợc quản lý, bảo vệ và phát triển khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ.
Kết quả quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ luôn luôn là
kế hoạch dài hạn. Từ 1978 – 1983 trồng phủ xanh bằng cây đƣớc (Rhizophora
apiculata), từ 1984 – 1999 trồng đa dạng loài để đạt đa dạng sinh học. Từ năm 2000
trở đi, quan sát động lực phát triển và mối quan hệ với các hệ sinh thái tiếp giáp,
theo dõi độ tăng đa dạng sinh học.[5]
Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đƣớc để tìm hiểu hệ số đồng dạng di
truyền, nhằm điều chỉnh kịp thời độ đa dạng di truyền của khu dự trữ sinh quyển
rừng ngập mặn Cần Giờ. Bởi vì khi hệ số đồng dạng di truyền cao thì ảnh hƣởng
của các tác nhân nhƣ sâu bệnh là rất lớn và thiệt hai nếu xẩy ra là vô cùng nghiêm
trọng.