TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THỊ NGỌC
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM
RẠ MỤC
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN
SINH POLYHYDROXYALKANOATE (PHA) PHÂN LẬP TỪ RƠM
RẠ MỤC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. ĐOÀN VĂN THƢỢC
`HÀ NỘI, 2014
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm
ơn đến thầy giáo TS. Đoàn Văn Thƣợc - giảng viên Bộ môn Công nghệ
Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội - ngƣời
đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và
hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi tới cô giáo PGS. TS. Đinh Thị Kim Nhung lời cảm ơn chân
quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không
trùng với tác giả khác.
Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Công thức tổng quát của polyhydroxyalkanoate (PHA) với
R là hydro hoặc nhóm ankyl (C
1
- C
13
), x = 1 - 4 và n = 100 -
30.000 9
Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát quá trình sinh tổng hợp PHA ở vi khuẩn 10
Hình 1.3. Ba bƣớc của con đƣờng sinh tổng hợp PHB. Một promoter
nằm trƣớc gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh
tổng hợp 12
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc hạt PHA 12
Hình 3.1. Khả năng sinh sinh khối và tích lũy PHBV trong các chủng
vi khuẩn 28
Hình 3.2. Khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trên môi
trƣờng MT2 đặc 29
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Khu vực phân bố và nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4
Bảng 1.2. Thành phần hóa học của rơm rạ 5
Bảng 1.3. Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ 5
Bảng 1.4. Ứng dụng rơm rạ trong nông nghiệp 6
Bảng 1.5. Ứng dụng rơm rạ trong lĩnh vực hóa chất 7
Bảng 1.6. Tên gọi của một số PHA tƣơng ứng với nhóm R và x 9
Bảng 1.7. Bốn nhóm enzyme PHA synthase 11
Bảng 1.8. So sánh tính chất vật lý của một số dạng PHA với
polypropylene 14
Bảng 1.9. Các công ty thƣơng mại tham gia nghiên cứu, sản xuất và
ứng dụng PHA 16
Bảng 2.1. Công thức của các loại môi trƣờng sử dụng trong nghiên cứu 19
Bảng 3.1. Các chủng vi khuẩn thu đƣợc qua 5 lần phân lập 26
Bảng 3.2. Các chủng vi khuẩn tuyển chọn bằng sử dụng thuốc nhuộm
Nile blue A và quan sát dƣới kính hiển vi quang học 27
: Gen quy định enzyme PHB polymerase
P(3HB-co-3HV)
(hay PHBHV)
: Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)
PHV (hay P(3HV))
: Poly(3-hydroxyvalerate)
PLA
: Polylactic acid
scl (short-chain-length)
: Mạch ngắn
UV (Untraviolet)
: Tia tử ngoại
wt% (weight percent)
: Phần trăm khối lƣợng
%, w/v
: Phần trăm khối lƣợng trên thể tích MỤC LỤC
MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ 4
1.1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam 4
1.1.2. Thành phần chính của rơm rạ 5
1.1.3. Ứng dụng của rơm rạ ở thế giới và ở Việt Nam 6
1.1.4. Hệ vi sinh vật trong rơm rạ 7
2.3.8.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn 24
2.3.8.2. Hoạt hóa chủng nghiên cứu 24
2.3.8.3. Ảnh hƣởng của pH đến sự sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn. 24
2.3.8.4. Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến sự sinh trƣởng, phát triển và
tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 25
2.3.8.5. Động thái sinh trƣởng và hàm lƣợng PHA tích lũy trong tế bào
các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các thời điểm khác nhau 25
2.3.9. Phƣơng pháp thống kê toán học trong xử lý số liệu 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Kết quả phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sinh PHA từ rơm rạ mục 26
3.2. Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn 29
3.2.1. Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn tuyển chọn….………….29
3.2.2. Hình thái tế bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn… …… ………29
3.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của
các chủng vi khuẩn tuyển chọn 30
3.4. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh trƣởng, phát triển của các
chủng vi khuẩn tuyển chọn 32
3.5. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng sinh trƣởng, phát
triển và tích lũy PHA của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 33
3.6. Động thái sinh trƣởng, phát triển và tích lũy PHA của các chủng
vi khuẩn tuyển chọn 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO 39
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 1 K36B - Sinh
Nghiên cứu để tìm ra một loại vật liệu mới, có khả năng phân hủy mà
không gây hậu quả cho môi trƣờng và giá thành chấp nhận đƣợc là nhiệm vụ
hàng đầu của các nhà khoa học. Polyme có khả năng phân hủy sinh học là
một trong nhiều loại vật liệu lý tƣởng có thể thay thế các polyme truyền thống
nhƣng vẫn đảm bảo các tính năng cơ lý của polyme truyền thống. Một số
polymer sinh học có những tính chất vật lý, hóa học gần giống các polymer có
nguồn gốc từ dầu mỏ đang sử dụng hiện nay, nhƣng nổi bật hơn ở khả năng
phân hủy sinh học (biodegradable). Chính nhờ khả năng này mà các sản phẩm
đƣợc chế tạo từ polymer sinh học sau khi qua sử dụng có thể phân hủy hoàn
toàn thành CO
2
và CH
4
, hoặc CO
2
và H
2
O… trong thời gian ngắn. Các dạng
chính của polymer sinh học bao gồm: polylactic acid (PLA),
polyhydroxyalkanoate (PHA), dẫn xuất cellulose, những plastic có nguồn gốc
từ tinh bột [31]. Trong đó PLA và PHA là 2 dạng polymer có khả năng tự
phân hủy triệt để, đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều.
PHA là polymer phân hủy sinh học đƣợc sinh tổng hợp một cách tự
nhiên bởi quá trình lên men đƣờng và các hợp chất cacbon-hydrate nhờ các vi
sinh vật. PHA rất đa dạng về mặt cấu tạo, có hơn 100 loại monomer khác
nhau tham gia cấu tạo PHA, vì vậy chúng có những đặc tính lý hóa đa dạng
tƣơng tự nhƣ polymer đƣợc tổng hợp từ dầu mỏ [19]. Điểm khác biệt là
chúng có khả năng phân hủy sinh học. Chính vì vậy PHA đƣợc coi là loại vật
liệu lý tƣởng nhằm thay thế các polymer hóa dầu hiện nay [17, 21].
Ở Việt Nam, polymer sinh học vẫn còn là lĩnh vực khá mới mẻ, nên
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
4.1.
Nghiên cứu đi sâu vào tìm hiểu các chủng vi khuẩn có khả năng sinh
PHA và đặc tính sinh học của chúng.
4.2.
Đƣa ra ứng dụng chuyển hóa rơm rạ thành nhựa sinh học.
5. Điểm mới của đề tài
Tìm ra đƣợc chủng vi khuẩn sinh polyhydroxyalkanoate từ rơm rạ mục
tối ƣu nhất.
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 4 K36B - Sinh
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về rơm rạ và hệ vi sinh vật trong rơm rạ
1.1.1. Nguồn rơm rạ ở Việt Nam
Cây lúa luôn giữ vị trí trung tâm trong nông nghiệp và kinh tế Việt
Nam. Đặc biệt hai vựa thóc lớn là Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) và
Đồng bằng sông Hồng (ĐBSH). Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nông
dân tham gia sản xuất lúa gạo. Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lƣợng lớn
phụ phẩm từ cây lúa - rơm rạ.
Bảng 1.1. Khu vực phân bố và nguồn rơm rạ ở Việt Nam [12]
Khu vực
Tổng
diện tích
(10
3
ha)
miền Trung
9588.6
1221.6
6252.0
7971.3
Tây Nguyên
5464.1
213.6
994.3
1267.7
Phía Đông Nam
2360.5
306.7
1322.4
1686.1
Đồng bằng sông Cửu Long
4051.9
3872.9
20483.4
26116.3
Cả nƣớc
33105.1
7440.1
38895.5
49591.8
Thu hoạch 1kg hạt lúa thì sẽ thu đƣợc tƣơng ứng 1 - 1,5 kg rơm. Ƣớc
tính khoảng 5 triệu tấn rơm rạ đƣợc sản xuất mỗi năm ở nƣớc ta. Với sự gia
tăng sản lƣợng lúa gạo và đẩy mạnh trồng trọt, việc quản lý các sản phẩm phụ
của cây lúa đang trở thành một vấn đề nhƣng cũng có thể mở ra một cơ hội.
Bảng 1.3. Hàm lƣợng một số chất có trong rơm rạ
Cacbon-hydrate
Rơm rạ (%)
Glucose
41 – 43.4
Xylose
14.8 – 20.2
Mannose
1.8
Galactose
0.4
Arabinose
2.7 – 4.5
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 6 K36B - Sinh
1.1.3. Ứng dụng của rơm rạ ở thế giới và ở Việt Nam
Theo các dữ liệu thu thập đƣợc, cách sử dụng sản phẩm phụ rơm rạ
theo truyền thống chủ yếu bao gồm sử dụng để làm củi đốt, làm vật liệu xây
dựng, nuôi gia súc và trồng nấm.
Ngoài ra, rơm rạ còn có thể tận dụng trong nhiều lĩnh vực ứng dụng
khác nhau, ví dụ nhƣ trong ngành hóa chất rơm rạ đƣợc sử dụng làm nguyên
liệu thô để sản xuất các sản phẩm hóa chất. Trong lĩnh vực công nghiệp và
xây dựng, rơm rạ có thể tận dụng cho một loạt các ứng dụng nhƣ làm các vật
liệu xây dựng nhƣ tấm lớp nhà, cách nhiệt, panen tƣờng hay làm giấy… (bảng
1.4. và bảng 1.5.). Đặc biệt phải kể đến nhũng ứng dụng quan trọng nhƣ: sản
xuất năng lƣợng, khí hóa để sản xuất năng lƣợng, chuyển hóa thành đƣờng để
dùng trong công nghệ lên men [30].
Bảng 1.4. Ứng dụng rơm rạ trong nông nghiệp
Phủ đất
Nguyễn Thị Ngọc 7 K36B - Sinh
Bảng 1.5. Ứng dụng rơm rạ trong lĩnh vực hóa chất
Quy trình xử lý
Sản phẩm
Thủy phân
Pentose, glucose và lignin, các thành
phần tan trong nƣớc
Các quá trình nhiệt phân
Khí tổng hợp
Xử lý kết hợp
Tấm xơ ép và alcohol
Hòa tan xenluloza nhớt
Sợi nhân tạo tổng hợp
Linhin bột
Chất keo dán
Thủy phân axit - lên men
Glucose, cellobiose hay xylose
Lên men vi sinh
Protein đơn bào
Quá trình Gulf đƣờng hóa song song
và lên men (SSF)
Sản xuất ethanol
1.1.4. Hệ vi sinh vật trong rơm rạ
Hệ vi sinh vật trong rơm rạ rất phong phú và đa dạng, trong đó có rất
nhiều vi sinh vật có lợi. Những năm gần đây các nhà khoa học phân lập và lƣu
giữ đƣợc nhiều loài rất có ý nghĩa, ví dụ nhƣ Cytophaga, Cellulomonas, chi
Bacillus, chi Clostridium, Aspergillus và Penicillium… có khả năng sinh các
enzyme ngoại bào có hoạt tính cao nhƣ cellulase, xylanase… [9]. Đặc biệt,
trƣờng. Bởi vậy một trong những giải pháp cho vấn đề này là phát triển và sử
dụng các polymer sinh học.
Các dạng chính của polymer sinh học bao gồm: polylactic acid (PLA),
polyhydroxyalkanoate (PHA), dẫn xuất cellulose và những plastic có nguồn
gốc từ tinh bột [31]. Trong đó PLA và PHA là 2 dạng polymer có khả năng tự
phân hủy triệt để, đang đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều.
1.2.2. Polyhydroxyalkanoate (PHA)
PHA là polyester của các hydroxyalkanoate (HA) (hình 1.1), chúng
đƣợc tích lũy trong tế bào nhƣ là nguồn dự trữ cacbon và năng lƣợng bởi rất
nhiều vi sinh vật, thƣờng là trong điều kiện thiếu một vài chất dinh dƣỡng
thiết yếu nhƣ oxy, nito, photphat, lƣu huỳnh, mangan và dƣ thừa cacbon [27].
PHA là polymer của khoảng 10
3
đến 10
4
monomer, chúng tồn tại dƣới dạng
các hạt riêng biệt trong tế bào. Có khoảng 5 - 13 hạt PHA trong một tế bào,
kích thƣớc hạt từ 0.2 đến 0.5 µm [27]. Sau khi tách chiết ra khỏi tế bào, các
PHA thể hiện các tính chất đặc trƣng nhƣ không độc hại, không tan trong
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 9 K36B - Sinh
Hình 1.1. Công thức tổng quát của polyhydroxyalkanoate (PHA) với R
là hydro hoặc nhóm ankyl (C
1
- C
13
), x = 1 - 4 và n = 100 - 30.000
nƣớc, tƣơng thích sinh học cao, có khả năng tự phân hủy, là những nhựa ƣa
nhiệt có thể tái sử dụng.
1
1
2
2
Poly(3-hydroxypropionate)
Poly(3-hydroxybutyrate)
Poly(3-hydroxyvalerate)
Poly(3-hydroxyhecxanoate)
Poly(4-hydroxybutyrate)
Poly(4-hydroxyvalerate)
P(3HP)
P(3HB)
P(3HV)
P(3HHx)
P(4HB)
P(4HV)
Từ khi poly ( 3-hydroxybutyrate) (PHB, P (3HV)) đƣợc tìm ra vào năm
1926, cho đến nay đã có hơn 150 loại PHA (Bảng 1.6) đƣợc phân lập từ hơn
300 vi khuẩn [27].
Tích lũy PHA là cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ
cacbon và năng lƣợng khi hàm lƣợng các nguyên tố dinh dƣỡng trong môi
trƣờng sống mất cân bằng. Việc polymer hóa các phân tử chất tan thành các hạt
PHA (không hòa tan) không làm thay đổi áp suất thẩm thấu của tế bào, ngƣợc
lại, điều này giúp ngăn cản sự thất thoát của các hợp chất có giá trị, chúng sẽ
đƣợc dự trữ để duy trì sự ổn định của tế bào [18]. Con đƣờng sinh tổng hợp
PHA từ các nguồn cacbon khác nhau có thể đƣợc tóm tắt trong hình 1.2. [27].
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 11 K36B - Sinh
PHA synthase nhóm I, ngoài ra chúng còn có thể polymer hóa các phân tử 3-
HA có từ 6 - 8 nguyên tử cacbon. PHA synthase nhóm IV cũng đƣợc cấu tạo
từ hai tiểu phần protein (PhaC và PhaR), chúng sử dụng các phân tử 3-HA có
từ 3-5 nguyên tử cacbon làm nguồn cơ chất cho quá trình sinh tổng hợp [27].
Bảng 1.7. Bốn nhóm enzyme PHA synthase
Loại PHA đầu tiên đƣợc các nhà khoa học phát hiện và cũng là loại PHA
đƣợc nghiên cứu chi tiết nhất cho đến thời điểm hiện tại chính là poly(3-
hydroxybutyrate) (PHB) [28]. Những nghiên cứu trên loài Cupriavidus necator
cho thấy quá trình sinh tổng hợp PHB chịu sự chi phối của 3 gen, đƣợc điều hòa
hoạt động bởi cùng một operon có tên là operon phbCAB. 3 gen này mã hóa cho
3 enzyme thực hiện 3 phản ứng tổng hợp kế tiếp nhau (hình 1.3). Phản ứng đầu
tiên là biến đổi hai phân tử acetyl coenzyme A (Acetyl-CoA) thành phân tử
acetoacetyl-CoA nhờ xúc tác của β-ketoacyl-CoA thiolase (mã hóa bởi gen
phbA). Phản ứng thứ hai có sự tham gia của NAD(P)H kết hợp với acetoacetyl-
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 12 K36B - Sinh
Hình 1.3. Ba bước của con đường sinh tổng hợp PHB. Một promoter
nằm trước gen phbC đóng vai trò khởi động quá trình sinh tổng hợp
[27]
CoA reductase (mã hóa bởi gen phbB) biến đổi acetoacetyl-CoA thành (R)-3-
hydroxybutyryl-CoA. Cuối cùng, các phân tử (R)-3-hydroxybutyryl-CoA đƣợc
polymer hóa thành poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) nhờ sự xúc tác của PHB
polymerase (mã hóa bởi gen phbC) [27]. Trong quá trình sinh trƣởng của vi
khuẩn, enzyme β-ketothiolase bị ức chế bởi hàm lƣợng Coenzyme A tự do giải
phóng từ chu trình Krebs, nhƣng khi sự tiếp nhận acetyl-CoA vào chu trình
Krebs bị giới hạn (xảy ra khi môi trƣờng sống bị hạn chế một vài nguyên tố dinh
dƣỡng thiết yếu, nguồn cacbon vẫn dồi dào) thì lƣợng acetyl-CoA dƣ thừa đó sẽ
-C
5
) và nhóm PHA mạch trung bình (mcl-PHA) đƣợc tổng hợp từ các
hydroxyacid có 6-16 nguyên tử cacbon trong phân tử (C
6
-C
16
). PHA mạch
ngắn có tính cứng, giòn gần giống với các loại polymer thông thƣờng trong
khi PHA mạch trung bình là loại nhựa mềm dẻo, hàm lƣợng tinh thể thấp, có
khả năng đàn hồi [19]. Một vài chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp phân tử
PHA chứa cả scl- và mcl-monomer [19].
Sau khi đƣợc tách chiết và tinh sạch, các PHA thể hiện một số tính chất
đặc trƣng nhƣ: bền nhiệt, không dẫn điện, cứng hoặc mềm dẻo (tùy loại
PHA), không thấm nƣớc, không cho không khí đi qua… [10]. Khối lƣợng
phân tử trung bình của các PHA thƣờng gặp dao động từ 2 x 10
5
đến 3 x 10
6
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp
Nguyễn Thị Ngọc 14 K36B - Sinh
Dalton. Các polymer sinh học này có tính chất cơ bản giống với polymer
thông thƣờng nhƣ polyethylene (PE) hay polypropylene (PP) (bảng 1.8) [27].
Bảng 1.8. So sánh tính chất vật lý của một số dạng PHA với
polypropylene
Polymer
Nhiệt độ nóng
chảy (ºC)
60-80
34
69
56
50
40
15
45
34
30
50-70
40
104
38
35
32
30
17
17
21
10
34.5 - 38
Ghi chú:
(1)
T
m
(melting temperature): Nhiệt độ mà ở đó polymer chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái lỏng.
(2)
đoạn. Giai đoạn 1970 - 1990 đƣợc xem là giai đoạn khởi thủy của các nghiên
cứu về 35 vật liệu polymer sinh học với số lƣợng sáng chế đăng ký rất khiêm
tốn (năm có số lƣợng sáng chế nhiều nhất là 1989 với 52 sáng chế, năm có số
lƣợng sáng chế ít nhất là 1979, 1983 với 1 sáng chế). Giai đoạn 1991 - 2000
đƣợc xem là giai đoạn cao trào của các nghiên cứu về polymer sinh học với số
lƣợng sáng chế tăng lên liên tục (năm 1991 - 1992 tăng từ 140 lên 233 sáng
chế, 1994 - 1995 tăng từ 270 lên 373 sáng chế). Giai đoạn 2001 - 2010 là giai
đoạn có số lƣợng sáng chế tăng vọt lên đến đỉnh điểm (năm 2003 có số lƣợng
sáng chế nhiều nhất là 645 sáng chế). Từ năm 2006 trở về sau, số lƣợng sáng
chế giảm dần, năm 2010 chỉ còn 154 sáng chế đƣợc đăng ký [4].
Ngày nay, trƣớc yêu cầu cấp thiết của việc giải quyết bài toán ô nhiễm
môi trƣờng do nhựa không tự phân hủy gây ra, các hƣớng nghiên cứu và ứng
dụng polymer sinh học ngày càng đƣợc đề cao. Tuy nhiên do giá thành sản
xuất cao (gấp khoảng 2 đến 4 lần so với polymer hông tự phân hủy) nên việc
Copyright: Tài liệu đại học ©