TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH – KTNN
************ DƯƠNG THỊ MINH
NGHIÊN CỨU TẠO VẬT LIỆU IN VITRO
VÀ BƯỚC ĐẦU NHÂN NHANH CÂY XẠ ĐEN
BẰNG PHƯƠNG PHÁP TẠO ĐA CHỒI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật
HÀ NỘI - 2014
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo Th.S La Việt
Hồng và Th.S Ong Xuân Phong đã nhiệt tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
khích lệ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài khoá luận tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ đang công tác tại Trung tâm Hỗ
trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, trường Đại học Sư
phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện, môi trường làm việc tốt nhất cho em thực
hiện nghiên cứu và hoàn thành đề tài.
Em xin cảm ơn tới toàn thể các thầy cô đang công tác tại khoa Sinh –
KTNN, đó là những người đã cho em nguồn kiến thức vô cùng quý giá để em
có thể hoàn thành tốt đề tài.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn.
Ngày 19 tháng 05 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Dương Thị Minh
Hình 3.5. Khối mô sẹo sau 7 ngày theo dõi 28
Hình 3.6. Khối mô sẹo sau 15 ngày theo dõi 28
Hình 3.7. Chồi mới tạo ra và sinh trưởng mạnh 30
Hình 3.8. Chồi mới không phát triển 30
Hình 3.9. Không tạo chồi mới 31
Hình 3.10. Chồi mới tạo ra chậm phát triển 31
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện hệ số nhân chồi ở các môi trường của cây
Xạ đen 31
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và thời gian
xử lý mẫu 9
Bảng 2.1. Công thức thí nghiệm tạo vật liệu in vitro cây Xạ đen 17
Bảng 2.2. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi in vitro 19
Bảng 3.1. Tạo vật liệu in vitro sau 5 ngày nuôi cấy 24
Bảng 3.2. Thời gian hình thành mô sẹo trên môi trường MS cơ bản có bổ sung
nồng độ BAP khác nhau. 27
BAP: 6 – Benzyl amino Purine
ĐC: Đối chứng
CT: Công thức
MS: Muashige and Skoog
MỤC LỤC
Xạ đen 27
3.2.1. Sự hình thành mô sẹo (callus) 27
3.2.2. Hệ số nhân chồi và chiều cao chồi mới in vitro 29
3.3. Một số chỉ tiêu sinh lí của chồi đỉnh tái sinh in vitro 32
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35
PHỤ LỤC…………………………………………………………………… 37
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN TÁC GIẢ… 38
1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Ngày nay y dược học phát triển, cùng với nó là những bài thuốc dân gian
cũng dần dần được tìm ra và một trong số những bài thuốc dân gian đó là tìm
ra cây thuốc trong tự nhiên có những tác dụng ưu việt trong điều trị các bệnh
ung thư, mụn nhọt của con người. Một trong nhưng cây thuốc dân gian đó là
cây Xạ đen, nó có rất nhiều tác dụng và đóng vai trò không thể thiếu trong các
bài thuốc cổ truyền.
Hiện nay cây Xạ đen là loại cây nhỏ được trồng phổ biến ở các tỉnh như
Sơn La, Hoà Bình, Hà Nam, Quảng Bình. Xạ đen được dùng trong y dược
học cổ truyền Việt Nam để chữa các bệnh như viêm dạ dày, ung nhọt, trị khối
u, ung thư, chống oxi hoá [12].
Tỷ lệ ung thư trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng ngày càng
tăng cao. Hiện trên thế giới mỗi năm có khoảng 12 triệu người được phát hiện
của cây Xạ đen.
Xác định một số chỉ tiêu sinh lý của chồi đỉnh tái sinh in vitro.
3. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn
- Ý nghĩa lý luận: bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu in vitro cây Xạ
đen
- Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài có thể được sử dụng trong nuôi
cấy mô tế bào cây dược liệu. Góp phần sản xuất và nhân nhanh cây giống có
hiệu quả cao, chất lượng tốt ứng dụng vào sản xuất cây trồng dược liệu phục
vụ cho các ngành khoa học khác.
3
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhân giống cây trồng in vitro
1.1.1. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro)
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh
vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học. Nhờ áp dụng kỹ
thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp
nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ
nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ ban đầu, làm rút ngắn thời gian đưa một
giống mới vào sản xuất [1], [3].
Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản cây
trồng quý hiếm.
Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật nuôi cấy mô bắt đầu bằng một mảnh
nhỏ thực vật vô trùng đặt vào môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay
mô sẹo (callus) mà mẫu cấy này tạo ra bằng sự tăng sinh, được phân chia và
cấy chuyền để nhân giống [3].
tính với tốc độ cực nhanh cây trồng phục vụ sản xuất, cây lương thực (khoai
tây), cây cảnh (phong lan), cây lâm nghiệp (bạch đàn, tếch,…), cây làm
thuốc,…
- Khả năng bảo quản các nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm,
khả năng trao đổi quốc tế các nguồn gen sạch bệnh dưới dạng cây nuôi trong
ống nghiệm.
- Khả năng tạo các cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn, từ đó
tạo ra các dòng đồng hợp tử tuyệt đối và nhờ đó rút ngắn được chu trình lai
tạo.
- Khả năng hấp thu AND ngoại lai vào tế bào nhờ công nghệ gen.
5
- Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật như nuôi cấy vi sinh vật và qua đó
ứng dụng di truyền phân tử vào thực vật bậc cao phục vụ công tác tạo giống.
- Kỹ thuật nuôi cấy protoplast và khả năng dung hợp protoplast, tái sinh
cây hoàn chỉnh từ các protoplast lai.
- Khả năng sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất thụ khi
lai xa.
- Khả năng tồn trữ các tế bào thực vật sống trong thời gian dài và ở
nhiệt độ thấp không mất tính toàn thể của tế bào.
Đồng thời việc nuôi cấy mô tế bào cũng tạo những cơ sở cho quá trình
nghiên cứu di truyền thực vật.
Ngày nay cùng với công nghệ gen, nuôi cấy mô tế bào là một phần
quan trọng không thể thiếu, thúc đẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong
các ngành kinh tế.
1.1.3. Ưu điểm của nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Bùi Bá Bổng (1995), nhân giống bằng nuôi cấy mô có những ưu
điểm sau:
Nuôi cấy mô giống như nhân giống vô tính vì phương pháp này tạo ra
cây con đồng nhất và giống như cây mẹ về mặt di truyền. Đối với cây trồng
chất auxin/cytokinin ngoại sinh đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, cần
phải quan tâm đến tuổi sinh lý của mẫu cấy. Theo Anolerson (1980) mẫu
nuôi cấy của cây được lấy vào thời kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả
quan trong tái sinh chồi.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đích
tạo ra hệ số nhân cao nhất. Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạn
then chốt của quá trình.
7
Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh
dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin,
Gibberelin), các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết giấm men, dịch
thủy phân Casein kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp. Tùy
thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kích
thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay sự phát triển của chồi
nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính.
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giai
đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau từ 1 – 2 tuần, từ những chồi riêng
lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các Auxin, các chất - indole -
acetic acid (IAA), Indode - 3 - butyric acid (IBA), α - Napthalene acelic acid
(α-NAA) và 2,4 - dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) được sử dụng, nghiên
cứu nhiều nhất.
Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Ở giai đoạn này, đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm
ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết
định khả năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất.
Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ,
cấy chúng ta phải thực hiện yêu cầu sau:
- Vô trùng mẫu nuôi cấy bằng cách rửa sạch mẫu tự nhiên dưới vòi nước,
rồi đưa vào buồng cấy và rửa sạch mẫu lại lần nữa bằng nước cất vô trùng,
sau đó tiến hành xử lý sơ bộ bằng cồn (etanol) 70% và một số hoá chất xử lý
9
vô trùng khác như Hydroperoxid (H
2
O
2
), hoặc javen với các nồng độ và thời
gian khử trùng thích hợp.
- Vô trùng dụng cụ thuỷ tinh ta sử dụng cồn để đốt các dụng cụ cấy mẫu
này.
- Vô trùng môi trường nuôi cấy và nút đậy bằng nồi hấp khử trùng.
- Thao tác nuôi cấy phải hết sức cẩn thận, không đưa tay qua bề mặt
thoáng của dụng cụ nuôi cấy cũng như môi trường nuôi cấy để tránh rơi nấm,
bụi hoặc khuẩn lên bề mặt môi trường nuôi cấy.
- Khi cấy mẫu vô trùng vào môi trường cần phải tiến hành gần ngọn lửa
đèn cồn.
Mô cấy có thể là các bộ phận khác nhau của thực vật, tuỳ theo sự tiếp
xúc với môi trường bên ngoài mà các bộ phận này chứa nhiều hay ít vi khuẩn,
nấm. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay là dùng các hoá chất
có hoạt tính diệt nấm, khuẩn. Hiệu lực diệt nấm, khuẩn của các chất này phụ
thuộc vào thời gian xử lý, nồng độ và khả năng xâm nhập của chúng trên bề
mặt mô cấy. Các chất kháng sinh ít được sử dụng vì tác dụng không triệt để
và ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng của mô cấy.
Trần Văn Minh (2004) đưa ra nồng độ, thời gian và hiệu quả sử dụng các
chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như sau [7].
Bảng 1.1. Hiệu quả của các chất khử trùng với các nồng độ và
Thời gian xử lý
(phút)
Hiệu quả
HgCl
2
0.1 – 1
2 – 10
Trung bình
Chất kháng sinh
4 – 5 (mg/l)
30 – 60
Khá tốt
Trong quá trình xử lý mô cấy phải ngập hoàn toàn trong dung dịch diệt
nấm, khuẩn.
Môi trường nuôi cấy
Trong tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần chính
sau đây:
- Các muối khoáng đa lượng.
-Các muối khoáng vi lượng.
- Các Vitamin.
- Đường làm nguồn cacbon.
- Các chất điều hòa sinh trưởng.
Ngoài ra, người ta còn bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần
xác định như acid amin, Ethylendiamin Tetraacetic Acid (EDTA), hoặc không
xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men,… vào trong môi trường tuỳ theo
nhu cầu riêng của từng đối tượng nuôi cấy. Trong hàng trăm môi trường do
rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, có thể phân loại ra 3
môi trường:
- Gibberellin: hiệu ứng chính của các gibberellin là kéo dài thân, kích
thích sự kéo dài lóng. Gibberellin kích thích mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ
và biểu bì.
Kích thích sự kéo dài lóng, vừa do sự kéo dài vừa do sự phân chia tế
bào thân, là đặc tính nổi bật của gibberellin. Xử lý gibberellin làm tăng năng
12
suất mía cây và đường (do kích thích sự kéo dài lóng). Gibberellin liều cao (hay
phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá. Trên lá yến mạch hay
diệp tiêu lúa, gibberellin chỉ có vai trò làm tăng hiệu ứng auxin [9].
Ảnh hưởng của pH và Agar
pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 5,8 – 6 thì tốt trong nuôi
cấy mô. Nếu pH môi trường thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát
triển của mô [1], [8].
Agar xuất phát từ rong biển, được sử dụng như là chất keo trong hầu hết
môi trường dinh dưỡng. Agar là polysaccharide, trọng lượng phân tử cao có khả
năng làm đông môi trường. Agar hoà tan hình thành chất keo kết dính với nước và
hấp thụ hoá chất. Nồng độ agar thường sử dụng trong nuôi cấy mô là 0,6 – 0,8 %.
1.2. Giới thiệu về cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth)
1.2.1. Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Celastrales
Họ: Celastraceae
Chi: Celastrus
Loài: Celastrus hindsii Benth
Một số tên gọi khác của cây Xạ đen (Celastrus hindsii Benth) như: cây
Bách giải, cây Đồng triều, cây Bạch vạn hoa, dây gối, quả nâu, người Mường
gọi là cây ung thư.
Xạ đen [16].
Đến năm 1998, một chuyên gia Nhật Bản cũng đã chiết xuất được một
chất có tác dụng hạn chế sự phát triển của ung thư từ cây Xạ đen.
Ở nước ngoài các nhà khoa học chủ yếu quan tâm nghiên cứu về thành
phần các chất có trong cây Xạ đen và tác dụng của các chất đó đối với cơ thể [10].
1.2.3.2.Tình hình nghiên cứu cây Xạ đen ở Việt Nam
Mở đầu cho công trình nghiên cứu về cây Xạ đen đó là tác giả Lê Thế
Trung ông đã biết đến “mối quan hệ” giữa cây Xạ đen và căn bệnh ung thư từ
năm 1989. Ông quan tâm tới các thành phần hoá dược của cây Xạ đen, ở lá,
thân, rễ của cây đều có 4 chất chính (chỉ khác nhau về hàm lượng) là:
Fanavolnoid, Quinon, Saponin Triterpenoid và Tanin Pyrocatechic, 4 chất này
có tác dụng hạn chế sự phát triển của các khối u trên cơ thể động vật mà ông
thí nghiệm ban đầu [15].
Ngày nay có thêm các nghiên cứu khác về cây Xạ đen, và các nghiên
cứu này tập trung chủ yếu vào nhân giống cây Xạ đen bằng kĩ thuật giâm,
hom,… truyền thống.
15
1.2.4. Công dụng
Cây Xạ đen là một cây thuốc nam mọc tự nhiên trong các khu rừng của
nước ta. Công dụng của cây Xạ đen không chỉ về mặt y học mà nó còn có giá
trị về mặt kinh tế, và đây cũng là cây trồng “xoá đói giảm nghèo” ở một số
huyện của tỉnh Hoà Bình.
Cây Xạ đen có vị đắng chát, tính hàn, có công dụng hữu hiệu trong điều
trị mụn nhọt, ung thũng, tiêu viêm, giải độc, giảm tiết dịch trong sơ gan cổ
chướng và đặc biệt trong chữa trị bệnh ung thư, tăng cường sức đề kháng của
cơ thể. Có tác dụng thông kinh lợi niệu. Cây dùng trị kinh nguyệt không đều,
bế kinh, viêm gan, bệnh lậu [12].
Qua nghiên cứu về thực vật học, hoá dược, dược lý, nghiên cứu thực nghiệm
trên động vật được gây ung thư, các bác sỹ đã phát hiện ra công dụng hạn chế sự
Các dụng cụ sử dụng.
Dao, kéo, panh, khay cấy, giấy thấm khử trùng, đèn cồn, bình tam giác,
nút bông khử trùng, túi nilong khử trùng,…
2.2.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng là môi trường MS cơ bản [11].
Các chất điều hoà sinh trưởng được sử dụng khi tiến hành thí nghiệm
nuôi cấy cây Xạ đen là chất kích thích sinh trưởng chồi BAP (mg/l).
2.2.3. Điều kiện nuôi cấy
Ánh sáng: các mẫu đều được nuôi cấy dưới ánh đèn Neon với cường độ
chiếu sáng 2000 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng từ 16 giờ sáng/8 giờ tối.
Nhiệt độ: 20
0
C - 25
0
C.
Độ ẩm: 50 – 60%.
Copyright: Tài liệu đại học ©