TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

LÊ THỊ THÙY DUNG
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ NĂNG
PHÂN HỦY RƠM RẠ THÀNH
PHÂN HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học


Lê Thị Thùy Dung
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài “
thành là do tôi thực hiện, không
sao chép lại của ai. Tất cả các số liệu đều thu thập từ thực nghiệm, qua xử lí
thống kê, không có số liệu sao chép không trùng với kết quả của tác giả nào
đã công bố. Trong đề tài tôi có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả
khác, tôi xin phép tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận tốt nghiệp
của mình.
Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.   2014

MT : Môi trường
NM : Nấm mốc
PTN : Phòng thí nghiệm
RBBR : Remazol Brilliant Blue R
STT : Số thứ tự
TN : Thí nghiệm
U : Ủ
UBND : Ủy ban nhân dân
U
n
: Nấm mốc mẫu ủ
U
v
: Vi khuẩn mẫu ủ
U
x
: Xạ khuẩn mẫu ủ
V : Vi khuẩn mẫu làm giàu
VK : Vi khuẩn
VQG : Vườn quốc gia
VSV : Vi sinh vật
X : Xạ khuẩn mẫu làm giàu
XK : Xạ khuẩn MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1

2.2. Hóa chất, thiết bị 19
2.2.1. Hóa chất 19
2.2.2. Thiết bị 19 2.3. Các loại môi trường nuôi cấy 19
2.3.1. Môi trường phân lập và giữ giống vi khuẩn MPA 19
2.3.2. Môi trường phân lập và giữ giống xạ khuẩn Gauze I 20
2.3.4. Môi trường phân lập và giữ giống nấm mốc Crapeckdox 20
2.3.5. Môi trường phân lập và giữ giống nấm men Hansen 20
2.3.6. Môi trường thử hoạt tính sinh tổng hợp enzyme của các chủng VSV 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu 21
2.4.1. Phương pháp vi sinh học 21
2.4.2. Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu. 24
2.6. Địa điểm thực hiện đề tài 25
2.7. Thời gian thực hiện đề tài 25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 26
3.1.1. Kết quả lấy mẫu 26
3.1.2. Thí nghiệm với khối ủ mẫu lớn 29
3.1.3. Kết quả phân lập 31
3.2. Tuyển chọn tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ 33
3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn 41
3.3.1. Kết quả kiểm tra tính đối kháng của các chủng VSV tuyển chọn 41
3.3.2. Kết quả xác định hàm lượng giống ban đầu bổ sung vào khối ủ 43
3.3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô phòng thí nghiệm 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47


DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1. Môi trường thử hoạt tính 20
Bảng 3.1. Kết quả lấy mẫu 26
Bảng 3.2. Hàm lượng nitơ bổ sung 27
Bảng 3.3. Độ giảm trọng lượng cơ chất, m(g), sau 4 tuần ủ làm giàu ở nhiệt độ phòng 28
Bảng 3.4. Tỉ lệ phối trộn tiến hành thí nghiệm ủ mẫu 29
Bảng 3.5. Kết quả phân lập 32
Bảng 3.6. Theo dõi hoạt tính của các chủng có hoạt tính lignocelluase 34
Bảng 3.7. Hoạt tính enzyme ngoại bào của 10 chủng VSV tuyển chọn 37
Bảng 3.8. Hàm lượng vi khuẩn bổ sung 43
Bảng 3.9. Hàm lượng xạ khuẩn, nấm mốc bổ sung 43
Bảng 3.10. Tỉ lệ phối trộn các thành phần ủ rơm rạ 44

1
MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài
Hàng năm, tại vùng nông thôn miền Bắc sau thu hoạch lúa sinh ra một
lượng rơm rạ khổng lồ. Với phế phẩm giàu cellulose này, một lượng rất ít

2
2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập, tuyển chọn được tổ hợp vi sinh vật có khả năng phân hủy rơm
rạ thành phân hữu cơ.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Phân lập VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân hữu cơ
3.2. Tuyển chọn tổ hợp VSV có khả năng phân hủy rơm rạ thành phân
hữu cơ
3.3. Thử nghiệm ủ rơm rạ quy mô PTN với các chủng VSV tuyển chọn
4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
Đề tài nhằm phân lập tuyển chọn được các chủng vi sinh vật có khả
năng sinh enzyme phân giải lignocellulose. Góp một phần nhỏ bổ sung cho
các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh vật sử dụng trong sản xuất phân bón nói
riêng và ứng dụng trong đời sống nói chung phù hợp với điều kiện kinh tế
Việt Nam.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Tận dụng nguồn nguyên liệu rơm rạ sau mỗi vụ thu hoạch, tuyển chọn
được tổ hợp vi sinh vật hữu hiệu để ủ phân hữu cơ góp phần làm giảm lượng
rác thải nông nghiệp tránh ô nhiễm môi trường, nâng cao hiệu quả canh tác
nông nghiệp.
5. Điểm mới của đề tài
Đây là những kết quả nghiên cứu đầu tiên khảo sát sự có mặt của một
số chủng VSV có khả năng sinh enzyme lignocellulase trong đất tại 3 địa
điểm: Khu vực đất nông nghiệp huyện Mê Linh (Hà Nội), VQG Ba Vì (Hà
Nội), VQG Tam Đảo (Vĩnh Phúc).



4
vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau về vị trí phân loại cũng như hoạt
tính sinh lý, sinh hóa.
Các nhóm vi sinh vật chính trong đất là: Vi khuẩn, vi nấm, vi tảo, động
vật nguyên sinh trong đó vi khuẩn là nhóm chiếm nhiều nhất về số lượng.
Trung bình trong đất vi khuẩn chiếm khoảng 90% tổng số, xạ khuẩn 8%, vi
nấm 1% còn lại 1% là tảo và động vật nguyên sinh. Tỉ lệ này thay đổi tùy theo
loại đất khác nhau cũng như khu vực địa lý khác nhau, tầng đất, thời vụ, chế
độ canh tác… Ở những nơi có đầy đủ chất dinh dưỡng, độ thoáng khí tốt,
nhiệt độ, độ ẩm và pH thích hợp thì vi sinh vật phát triển nhiều về số lượng
và thành phần sự phát triển của vi sinh vật lại chính là nhân tố làm cho đất
thêm phì nhiêu [3].
1.1.2. Vi sinh vật có khả năng phân hủy lignocellulose
1.1.2.1. Vi sinh vt phân hy cellulose
Trong tự nhiên, khu hệ vi sinh vật có khả năng phân giải cellulose vô
cùng phong phú bao gồm vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn.
a) Nấm sợi
Trong rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase thì nấm
sợi thuộc nhóm có khả năng tổng hợp cellulase mạnh nhất. Chúng là những vi
sinh vật thuộc nhóm hạ đẳng, không có diệp lục, chúng chủ yếu sống hoại
sinh ở trong đất và tiết ra môi trường một lượng lớn enzyme chuyển hoá các
tàn dư của thực vật thành những chất dinh dưỡng cung cấp cho cây và làm
cho đất trở nên màu mỡ hơn [9].
Trong thực tế không có một loại nấm hay vi sinh vật nào có khả năng
sinh tổng hợp đầy đủ cả một phức hệ enzyme cần cho quá trình chuyển hoá
cellulose đến sản phẩm cuối cùng mà mỗi loài chỉ có thể sinh tổng hợp một
vài loại enzyme. Các loại nấm đáng chú ý nhất là: Alternaria tenuis,
Trong dạ cỏ của các động vật ăn cỏ có một hệ vi sinh vật đặc biệt.
Chúng có khả năng phân giải cellulose thành các sản phẩm. Các vi sinh vật đó
thường là: Ruminococcus albus, Ruminococcus flavofaciens, Butyrivibrio
fibrisolvens, Cillobacterium cellulosolvens, Bacteroides amylophillus,
Bacteroides ruminicola, Clostridium perfringens, Clostridium butycium [9].
6
c) Xạ khuẩn
Xạ khuẩn là một nhóm vi khuẩn đặc biệt, tế bào đặc trưng bởi sự phân
nhánh, đa số sống trong đất gram dương và hiếu khí. Dựa vào đặc điểm về
nhiệt độ sinh trưởng, người ta chia xạ khuẩn thành hai dạng:
Xạ khuẩn ưa ấm : phát triển tốt ở nhiệt độ 25 – 30
0
C
Xạ khuẩn ưa nhiệt : phát triển tốt ở nhiệt độ 50 – 70
0
C
Xạ khuẩn có mặt ở khắp mọi nơi đặc biệt trong đất. Cellulase của xạ
khuẩn là enzyme ngoại bào [7].
Hungater phân lập được loài Micromonospora có khả năng thuỷ phân
cellulose. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng.
Nhiều nhóm đòi hỏi nguồn dinh dưỡng cao. Các môi trường có dịch chiết
nấm men, pepton, dịch thuỷ phân cazêin thường thuận lợi cho sinh trưởng. Xạ
khuẩn thường sinh sản bằng cách đứt đoạn hay phân chia tế bào bình thường.
Bào tử của xạ khuẩn thường có hình cầu hay hình bầu dục chứa
axitdipicolinic, canxi và một số ít magiê là chất quyết định tính kháng nhiệt
của chúng. Các xạ khuẩn khác nhau có nhu cầu khác nhau về dinh dưỡng.
Việc hình thành cuống bào tử diễn ra mạnh hơn khi thêm các nguyên tố vi

Ở nước ta sản xuất lúa hàng năm đã tạo ra hàng chục triệu tấn rơm rạ.
Riêng tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long mỗi năm cũng có tới 15 triệu
tấn rơm. Tuy nhiên, loại phế thải nông nghiệp này thường được nông dân đốt
gây lãng phí và làm ô nhiễm môi trường. Hiện nay, cùng với việc ứng dụng
các tiến bộ khoa học vào sản xuất, nhiều loại máy móc được đưa vào gặt và
tuốt lúa. Sau khi gặt xong nông dân đã tuốt lúa ngay tại đồng ruộng nên giảm
được nhiều công sức trong việc vận chuyển lúa chưa tuốt về nhà tuốt. Vì thế,
rơm rạ phần lớn để lại ngoài đồng ruộng chỉ một phần nhỏ được nông dân đưa
về nhà để làm thức ăn cho gia súc về mùa đông. Phần rơm rạ ngoài đồng lại
được người dân đốt thành tro. Đây là một việc làm gây hại cho môi trường và
ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ của người dân. Theo các chuyên gia y tế, mù
bụi ro đốt rơm rạ (đã từng xảy ra vào tháng 6/2009 tại Hà Nội) gây ô nhiễm 8
không khí rất có hại đối với sức khỏe con người, nhất là đối với trẻ em, người
già và người mắc bệnh đường hô hấp.
Việc đốt rơm rạ là điều nên tránh và đã có khuyến nghị bà con sử dụng
rơm rạ cho việc trồng nấm rơm, dự trữ làm thức ăn gia súc, ủ gốc trồng
màu… Trong trường hợp khó vận chuyển và cất giữ có thể vận động tập thể
mua máy đóng bánh rơm của một số xí nghiệp đã khuyến cáo rất có hiệu quả
trong việc ép rơm rạ thành bánh giúp cho việc vận chuyển và bảo quản rơm rạ
được dễ dàng. Từ đó có thể sử dụng rơm rạ cho nhiều mục đích khác. Máy ép
rơm đã được sản xuất và đưa vào sử dụng ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp,
Thành phố Hồ Chí Minh Việc dùng rơm rạ cho mục đích làm giấy, sản xuất
ethanol được áp dụng rất ít ở nước ta.
1.2.1. Sử dụng rơm để trồng nấm rơm
Nấm rơm là thực phẩm rất được người dân các nước châu Á ưa chuộng
và được trồng phổ biến ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam,
nấm rơm được trồng trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau như lục bình, bã

các sản phẩm nông nghiệp và gốm sứ… trong quá trình vận chuyển. Tại xã
Mỹ Yên, Long Hiệp (huyện Bến Lức, Long An), rơm đang được các chủ vựa
thu mua từ những cánh đồng lúa mùa ở các xã Long Khê, Long Định, Phước
Lý, Phước Toàn, Phước Vân… (thuộc các huyện Bến Lức, Cần Đước, Cần
Giuộc) để cung cấp cho các vựa dưa, trái cây, xí nghiệp thuỷ tinh, các trang
trại nuôi bò, xuất khẩu…
1.3. Sự phân bố và cấu trúc của cellulose trong tự nhiên
1.3.1. Sự phân bố của cellulose trong tự nhiên
Sinh khối thực vật của trái đất ước tính khoảng 1,8.10
12
tấn. Trong đó
cellulose chiếm khoảng 4.10
10
tấn. Sản lượng cellulose được tổng hợp hàng
năm trong tự nhiên lớn hơn bất kỳ chất hữu cơ nào khác. 10
Dưới dạng phế thải, cellulose có trong các phế liệu nông nghiệp chăn
nuôi, công nghiệp, đồ hộp, công nghiệp chế biến gỗ, trong chất thải sinh hoạt
từ nhà bếp, đường phố Sự phân bố đa dạng với khối lượng lớn ở khắp nơi
của cellulose có trong rác thải là một khó khăn và trở ngại cho việc bảo vệ
môi trường, do đó để thu gom và xử lý triệt để lượng chất thải hữu cơ này đòi
hỏi phải có những biện pháp và công nghệ phù hợp với từng khu vực, từng
vùng [6], [7], [9], [11].
1.3.2. Cellulose
Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật. Thông thường,
cellulose của tế bào thực vật chiếm 50% tổng số hydratcacbon có trên trái đất
của chúng ta. Người ta nhận thấy rằng trong thiên nhiên hầu như không gặp
cellulose ở dạng tinh khiết mà nó thường tồn tại ở dạng kết hợp với những

ngăn cản sự trương này. Ở vùng kết tinh, enzyme chỉ tác dụng lên bề mặt các
sợi [7].
Cellulose là một hợp chất cao phân tử có cấu trúc rất bền vững. Nó
không tan trong nước, không được tiêu hoá trong đường tiêu hoá của người và
động vật có dạ dày một túi. Tuy nhiên, trong dạ dày của động vật nhai lại và
trong đất có tồn tại rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh cellulase, là
enzyme thuỷ phân cellulose [9].
1.3.3. Hemicellulose
Trong tế bào thực vật, hemicellulose đứng thứ hai về khối lượng.
Hemicellulose là nhóm polisacarit có phân tử lượng nhỏ hơn rất nhiều so với
H
O
O
H
HO
O
CH
2
OH
H
OH
O
H
H
CH
2
OH
H
OH
H

dung môi hữu cơ đậm đặc kể cả axit. Chỉ có tác dụng với kiềm bisunfit natri
và axit sunfurơ, lignin mới mới lại bị phân giải từng phần. Lignin rất bền đối
với tác dụng của các enzyme. Do đó trong cây lignin chỉ được tạo ra mà
không tham gia vào sự trao đổi chất. 13
Ba cấu tử cellulose, hemicellulose, lignin tạo nên lignocellulose. Thành
phần lignin, cellulose, hemicellulose trong các loại thực vật có sự khác biệt
lớn. Điều này quyết định sự khác nhau giữa các loại thực vật về tính chất vật
lý và thành phần hoá học. Chính vì thế đòi hỏi phải có biện pháp, tác nhân xử
lý khác nhau đối với các loại thực vật khác nhau [7], [11].
1.3.5. Cơ chế chuyển hóa lignocellulose
Lignocellulose là một tập hợp thành phần phức tạp, có mức độ polime
cao, khó tan trong nước, do đó rất khó bị thuỷ phân bởi enzyme. Các cấu phần
hợp thành nên lignocellulose được liên kết chặt chẽ với nhau và liên kết với
các thành phần khác tạo ra một cấu trúc hết sức chặt chẽ.
Do thành phần cấu tạo của lignocellulose rất đa dạng và phức tạp nên
để có thể thuỷ phân được chúng một cách triệt để cần phải có một phức hệ
enzyme tương ứng. Một loại vi sinh vật riêng rẽ không đủ khả năng để có thể
sinh tổng hợp một phức hệ enzyme phong phú và đa dạng như vậy. Muốn
chuyển hoá được lignocellulose cần phải có sự phối hợp của các loại vi sinh
vật khác nhau.
1.3.5.1. Enzyme và  thy phân lignocellulose
a) Enzyme thuỷ phân cellulose: Cellulase
Cellulase ở vi sinh vật và cơ chế tác dụng của chúng gần đây đã được
một số tác giả tổng kết khá chi tiết. Đây là phức hệ enzyme thuỷ phân
cellulose tạo ra các đường đủ nhỏ để đi qua vách tế bào thực vât. Nhiều tác
giả cho rằng phức hệ enzyme cellulase bao gồm ba enzyme chủ yếu sau:
Exo-(1,4)-glucanase hay xenlobiohydrolase: Enzyme này phân cắt

liên kết β-1,4 glucozit và tạo ra các đầu mạch tự do. Sau đó exoglucanose sẽ
cắt ra tạo thành những đoạn xenlobiose. Kết quả tạo thành xenlo-oligosacarit 15
mạch ngắn, xelobiose, glucose. Cuối cùng enzyme xenlobiase thuỷ phân tiếp
theo tạo thành glucose.
Dựa trên kết quả trên mà Reese đã hiệu chỉnh quan niệm của mình về
enzyme C1 và Cx. Theo ông thì C1 có tác dụng làm trương nở cellulose kết
tinh, phá vỡ liên kết đồng hoá trị tạo ra cellulose biến tính. Sau đó enzyme
endoglucanase tác động lên chuỗi và tạo ra xenlobiose. Ông cho rằng sự thuỷ
phân cellulose là kết quả của sự tác động cùng một lúc của cả endoglucanase,
enxoglucanase và xenlobiase.
Mặc dù có rất nhiều kết quả nghiên cứu về quá trình thuỷ phân
cellulose nhưng cho đến này thì cơ chế thuỷ phân cellulose vẫn chưa hoàn
toàn thống nhất.
1.3.5.2. Enzyme  thy phân hemicellulose
Khi nghiên cứu hemicellulose, người ta nhận thấy có nhiều điểm giống
nhau giữa hai thành phần này. Chính vì vậy mà nhiều tác giả cho rằng enzyme
hemicellulase cũng có nhiều điểm tương đồng với cellulase ví dụ như cơ chế
tác động Tuy nhiên, giữa hemicellulase và cellulase vẫn còn nhiều điểm
khác biệt:
Hemicellulose có phân tử nhỏ hơn, cấu trúc phân tử đơn giản và kém
bền hơn so với cellulose. Hemicellulose là cơ chất dễ đồng hoá hơn cellulose
do đó hemicellulase thường được tạo thành sớm hơn trong quá trình nuôi cấy
vi sinh vật.
Mặc dù vậy thì quá trình phân giải hemicellulose thường diễn ra song
song với quá trình phân giải cellulose [7].
1.3.5.3. Enzyme và  thy phân lignin
Có nhiều quan điểm trái ngược nhau về cơ chế phân giải lignin. Một số

Bước 3: Thử nghiệm khả năng kết hợp giữa các chủng VSV.
Bước 4: Chế tạo chế phẩm VSV phân hủy rác thải hữu cơ.
Bước 5: Thử nghiệm sử dụng chế phẩm [4]. 17
1.5. Lịch sử phát triển phân bón vi sinh
1.5.1. Trên thế giới
Phân bón vi sinh vật (tên thường gọi: phân hữu cơ vi sinh) là sản phẩm
được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu hữu cơ khác nhau, nhằm cung cấp chất
dinh dưỡng cho cây trồng, cải tạo đất, chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật
sống được tuyển chọ với mật độ đạt tiêu chuẩn quy định, góp phần nâng cao
năng xuất, chất lượng nông sản. Phân hữu cơ vi sinh vật không gây ảnh hưởng
xấu đến con người, động vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản.
Phân bón vi sinh do Noble Hiltner sản xuất đầu tiên tại Đức năm 1896 và
được đặt tên là Nitragin. Sau đó phát triển sản xuất tại một số nước khác như ở
Mỹ ( 1896), Canada (1905), Nga (1907), Anh (1910) và Thụy Điển (1914).
Nitragin là một loại phân được chế tạo bởi vi khuẩn Rhizibium do
Beijerink phân lập năm 1888 và được Ferd đặt tên vào năm 1889 dùng để bón
cho các loại cây thích hợp họ Đậu. Từ đó cho đến nay đã có rất nhiều công
trình nghiên cứu nhằm ứng dụng và mở rộng việc sản xuất các loại phân bón
vi sinh cố đinh nitơ mà thành phần còn được phối hợp thêm một số vi sinh vật
có ích khác như một số xạ khuẩn cố đinh nitơ sống tự do Frankia spp. ,
Azotobacter spp. , các vi khuẩn cố định nitơ sống tự do Clostridium,
Pasterium, Beijerinkia indica, các xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose,
hoặc một số chủng vi sinh vật có khả năng chuyển hóa các nguồn dự trữ
photpho, kali ở dạng khó hòa tan với một số lượng lớn có trong đất mùn, than
bùn, trong các quặng apatit, photpho,… chuyển chúng thành dạng dễ hòa tan,
cây trồng có thể hấp thụ được.
1.5.2. Ở Việt Nam