TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

ĐỖ HỒNG DUNG
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẠO MÀNG BC
TỪ CHỦNG GLUCONACETOBACTER BẰNG
PHƢƠNG PHÁP GÂY ĐỘT BIẾN TIA UV KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
HÀ NỘI - 2014


HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Đinh Thị
Kim Nhung và các thầy cô trong phòng Vi sinh, khoa Sinh - KTNN đã tận
tình giúp đỡ em trong thời gian qua.
Em xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh -
KTNN đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.Cảm ơn tất cả các bạn
sinh viên đã giúp đỡ tôi để hoàn thành khóa luận một cách tốt đẹp.
Xin cảm ơn gia đình, bạn bè và người thân đã giúp đỡ, động viên để em
vững tin hoàn thành khóa luận này.
Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2014
Sinh viên Đỗ Hồng Dung

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1PFK : Fructose - 1phosphate kinase
BC : Bacterial cellulose
CFU : Clony Forming Unit
CS : Cellulose synthate
cs : Cộng sự
ĐB : Đột biến
Nxb : Nhà xuất bản
PMG : Phosphoglucomutase
Pru-6-P : Fructose - 6 - phosphate
PTS : Hệ thống Phosphotransferase
UDPGlc : Uridine diphospho glucose
UGP : Glucose - 1 - phosphate uridylytransferase
UV : Ultra Violet
VSV : Vi sinh vật DANH MỤC BẢNG

Hình 3.2.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên thạch nghiêng 21
Hình 3.3.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trong môi trường hoạt hóa 22
Hình 3.4. Màng BC từ chủng Gulconacetobacter BHN2 23
Hình 3.5. Xử lý đột biến 7 phút vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 24
Hình 3.6. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xứ lỷ đột biến 5
phút sau 3 ngày. 25
Hình 3.7. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến
ở 7 phút sau 3 ngày 26
Hình 3.8. Xử lý đột biến 3 phút vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 27
Hình 3.9. Khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 xử lý đột biến
3 phút sau 3 ngày. 28
Hình 3.10. Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 (A)
vàGluconacetobacter BHN2 ĐĐ (B) 30
Hình 3.11. Hình thái vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 (A)
vàGluconacetobac BHN2 ĐB (B)
Hình 3.12.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 trên thạch nghiêng 33
Hình 3.13.Vi khuẩn Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường
hoạt hóa 34
Hình 3.14. Lên men tạo màng BC từ các mẫu ĐB2, ĐB5, ĐB7 35
Hình 3.15. Màng BC từ mẫu ĐB3, ĐB5 36
Hình 3.16. Mẫu ĐB7 không tạo màng 36

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lý do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu của đề tài 1
3. Nội dung nghiên cứu 1
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2
5. Điểm mới của đề tài 2
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

3.2.2. Thí nghiệm lần 2 25
3.2.3. Thí nghiệm lần 3 27
3.3. Lựa chọn khoảng thời gian xử lý đột biến tia UV phù hợp 29
3.4. So sánh hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào của chủng
Gluconacetobacter BHN2 và Gluconacetobacter BHN2 ĐB 29
3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 29
3.4.2. Hình thái tế bào 30
3.5.3. Điểm sai khác giữa chủng Gluconacetobacter BHN2
vàGluconacetobacter BHN2 ĐB 31
3.5. Lên men tạo màng BC từ chủng Gluconacetobacter BHN2 sau đột biến 33
3.5.1. Nhân giống Gluconacetobacter BHN2 ĐB trên môi trường
thạch nghiêng 33
3.5.1. Nuôi chủng Gluconacetobacter BHN2 ĐB trong môi trường
hoạt hóa thu sinh khối 34
3.5.3. Tạo màng BC từ 3 mẫu ĐB3, ĐB5, ĐB7 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 1
MỞ ĐẦU
1.Lý do chọn đề tài
Như chúng ta đã biết thế kỉ XX là thế kỉ của ngành công nghệ thông tin
thì thế kỉ XXI là thế kỉ của ngành công nghệ sinh học. Ngày nay công nghệ
sinh học đang dần trở thành một ngành kĩ thuật chủ đạo của nhiều quốc gia
trên thế giới. Gắn liền với nó là công nghệ vi sinh đã có những thành tựu to
lớn và ý nghĩa trong đời sống, trong các ngành công nghiệp, y học… Nó đã và
đang tập trung sự chú ý của các nhà khoa học trên toàn thế giới.
Màng BC do vi khuẩn Gluconacetobacter tạo ra có cấu trúc hóa học và
đặc tính cơ học giống với cellulose của thực vật nhưng có thêm một số tính

Đã xử lý đột biến chủng Gluconacetobacter BHN2 dưới tác dụng của
tia UV trong khoảng thời gian 3, 5, 7 phút; tiếp tục nghiên cứu khả năng tạo
màng BC từ chủng ĐB, từ đó làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo.

3
CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vị trí và đặc điểm phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
1.1.1. Vị trí phân loại của Gluconacetobacter trong sinh giới
Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì
Gluconacetobacter thuộc giống Acetobacter, họ Pseudomonadeceae, bộ
Pseudomonadales, lớp Schizommycetes. Việc phân loại vi khuẩn này còn
nhiều tranh cãi, có một số tác giả coi Gluconacetobacter như một loài phụ của
A. aceti.
1.1.2. Đặc điểm phân loại
1.12.1. Đặc điểm hình thái, tế bào học.
Gluconacetobacter có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước
khoảng 2µm, tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, không có khả
năng di động, không sinh bào tử.Các tế bào được bao bọc bởi chất nhày tạo
váng nhăn và dày. Váng có chứa hemicelluloses nên khi gặp H
2
SO
4

5
Đặc điểm sinh hóa:Năm 1950, Frateur đã chính thức đưa ra một khóa
phân loại mới căn cứ vào các tiêu chuẩn: Khả năng oxy hóa acid acetic thành
CO
2
và H
2
O; hoạt tính catalase; khả năng sinh trưởng trên môi trường
Hoyer… Theo quan điểm này Gluconacetobacter là chủng thuộc chi
Acetobacter, họPseudomonadaceae, bộ Pseudomonadales, lớp
Schizomycetes. Đặc điểm phân biệt với các chủng khác trong cùng một chi
được trình bày ở bảng 1.1 dưới đây:
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh hóa của chủng vi khuẩn Gluconacetobacter
theo Frateur (1950)
STT
Đặc điểm
Hiện tƣợng
Kết quả
1
Oxy hóa ethanol thành
acid acetic
Chuyển hóa môi trường chứa
Bromphenol Blue 0,04% từ
màu xanh sang màu vàng
+
2
Hoạt tính catalase
Hiện tượng sủi bọt khí
+
3
6
1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn Gluconacetobacter
1.1.3.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon
Để vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn cần cung cấp nguồn
cacbon phù hợp. Tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp là vô
cơ hay hữu cơ. Giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ cacbon phụ thuộc vào
hai yếu tố: Thành phần hóa học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn, đặc
điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật.
Người ta sử dụng đường làm thức ăn nuôi cấy phần lớn các vi sinh vật
dị dưỡng. Đường đơn ở nhiệt độ cao có thể bị chuyển hóa thành lọai hợp chất
có màu tối khó hấp thụ. Trong môi trường kiềm sau khử trùng, đường còn dễ
bị chuyển hóa làm biến đổi pH môi trường. Để tránh hiện tượng này khi khử
trùng môi trường có chứa đường người ta thường chỉ hấp ở áp lực 0,5atm ở
110
0
C trong 30 phút. Từ các loại đường đơn tốt nhất nên sử dụng phương
pháp hấp gián đoạn (phương pháp Tyndal). Để nuôi cấy các loại vi sinh vật
khác người ta sử dụng các nồng độ đường không giống nhau, với vi khuẩn
thường dùng 0,5 - 0,2% đường. Hầu hết các vi sinh vật chỉ đồng hóa được các
loại đường dạng đồng phân D [1].
Các hợp chất hữu cơ chứa cả cacbon cả nitơ (pepton, nước thịt, nước
chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch…) có thể vừa sử dụng
làm nguồn cacbon, vừa sử dụng làm nguồn nitơ đối với vi sinh vật [1].
1.1.3.2. Nhu cầu nitơ của vi sinh vật
Nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thu nhất đối với vi sinh vật là NH
3
và NH
4

Hong Joo Son lại công bố hàm lượng ethanol có thể thay đổi từ 0,2-1% tốt
nhất ở 0,6%. Theo Nodes, lượng ethanol duy trì trong môi trường luôn giữ ở
3-3,5%. Các tác giả Ebner và Heirich, cho lượng ethanol dùng từ 7-10%V. Để
tránh hiện tượng oxy hóa hoàn toàn acid acetic cần có một lượng ethanol sót
trong sản phẩm từ 0,2-0,5% để ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid
acetic và muối acetate [1].
Ngoài việc oxy hóa ethanol, vi khuẩn acetic còn có khả năng oxy hóa
các rượu khác thành các acid tương ứng.
1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Gluconacetobacter trên thế giới và ở
Việt Nam
Giấm là sản phẩm rất quen thuộc đối với mỗi chúng ta, nó xuất hiện
khoảng từ những năm 1000 trước công nguyên, người xưa dùng nó làm nước
uống jessus, và được biết đến nhờ hiện tượng lên men hỏng của rượu vang.
Chính vì vậy giấm có tên là “Vinegar”, bắt nguồn từ tiếng Pháp: “Vine” là
rượu vang và “aigre” là chua. Khi đó, người ta chưa biết vi khuẩn
Gluconacetobacter chính là tác nhân của quá trình lên men này.
8
Giấm mới chỉ bắt đầu được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỉ
XIX. Person là người đầu tiên nghiên cứu về giấm và vi khuẩn
Gluconacetobacter. 1822, ông đã quan sát lớp màng mỏng phát triển trên bề
mặt giấm và chứng minh sự có mặt của một loại vi sinh vật, ông gọi chúng là
Mycoderma aceti.
Năm 1837, Kiittzing từ những thí nghiệm của mình đã đưa ra kết luận:
quá trình lên men giấm được thực hiện khi có sự tham gia của vi khuẩn. Cùng
năm đó, nhà bác học nổi tiếng người Đan Mạch là Hansen đã tách được từ
màng giấm 2 loại vi khuẩn thuần khiết, ông gọi đó là: Mycoderma aceti và
Mycoderma pasteurianum.
Nhờ có sự xuất hiện của kính hiển vi, 1862 đến 1868, Pasteur nhờ sự
trợ giúp của kính hiển vi đã chứng minh nhận định của Kiittzing và Pasteur là
hoàn toàn đúng đắn. Ông nghiên cứu lớp màng xuất hiện trên bia và rượu

qua vết thương, hạn chế nhiễm khuẩn vết bỏng, kích thích biểu mô hóa ở
bỏng nông hay kích thích tạo mô hạt ở bỏng sâu người ta thường sử dụng các
loại vật liệu che phủ vết thương phần mềm, thay thế da vết bỏng đã được sử
dụng từ rất lâu. Tuy nhiên, việc sử dụng những loại da này cũng mới chỉ dừng
lại ở cách sử dụng đơn giản, đó là da tươi.Mặc dù da dị loại tươi có những ưu
điểm, đặc biệt là khả năng bám dính tốt, nhưng nó cũng có những nhược điểm
nhất định. Hơn nữa, việc sử dụng lại ở thế bị động, bảo quản và xử lý phức
tạp, khó có thể sử dụng rộng rãi trên lâm sàng. Vật liệu từ da đồng loại là lý
tưởng nhất cho việc che phủ vết thương, vết bỏng nhưng trong nhiều trường
hợp rất khan hiếm, không đủ đáp ứng được.Chính vì vậy vật liệu che phủ tạm
thời từ các loại màng sinh học là lựa chọn số một, có vai trò rất quan trọng
10
trong điều trị bỏng. Một trong các loại màng sinh học đã và đang được quan
tâm ngày nay là màng cellulose vi khuẩn.
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng BC từ vi khuẩn
Gluconacetobacter ngày càng được quan tâm. Có một số các nghiên cứu,
công bố liên quan đến Gluconacetobacter sự hình thành màng BC và ứng
dụng màng BC.Các công trình mới chỉ bước đầu nghiên cứu quá trình tạo
màng, đặc tính cấu trúc màng làm cơ sở chế tạo màng trị bỏng, sản xuất thạch
dừa. Gần đây nhất là nghiên cứu ứng dụng màng BC làm chất nền và giá đỡ
để cố định tế bào vi khuẩn của Nguyễn Thúy Hương và Phạm Thạch Hổ.
Theo tác giả Nguyễn Văn Thanh, Trưởng bộ Vi sinh - Ký sinh, Đại học
Y Dược, Thành phố Hồ Chí Minh cho biết nhóm nghiên cứu của ông chế tạo
thành công màng trị bỏng sinh học có tẩm dầu mù u bằng phương pháp lên
men. Nó có khả năng thấm nước cao, kết dính chặt và trơ về mặt hóa học nên
nó có vai trò như màng sinh học có thể thay thế da tạm thời.
Nghiên cứu về màng trị bỏng của tác giả như Huỳnh Thị Ngọc Lan,
nghiên cứu chế tạo màng trị bỏng từ Bacterial cellulose của
Gluconacetobacter và hoạt chất tái sinh mô của dầu mù u. Ngoài ra, có
nghiên cứu về hiệu ứng làm lành vết thương của hỗn hợp Chistosan tan trong

1.3.2. Cơ chế tổng hợp màng BC
Quá trình sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được
điều hòa một cách chuyên biệt và chính xác bằng một hệ thống chứa nhiều
loại enzyme, phức hợp xúc tác và các protein điều hòa.
Theo tác giả Alina Krystynowics và cộng sự có 4 enzyme tham gia xúc tác
tổng hợp cellulose ở vi khuẩn Gluconacetobacter:
Phosphoglucomutase (PGM): Xúc tác quá trình chuyển hóa Glucose - 6
phosphat thành glucose - 1 phosphat.
Glucose - 1 phosphate uridylytransferase (UDPG pyrophosphorylase
hay UGP): Xúc tác tổng hợp UDP - Glucose.
Cellulose synthase (CS): Xúc tác tổng hợp cellulose từ UDP - glucose.
Con đường sinh tổng hợp cellulose được thể hiện rõ ở hình dưới đây.
Hình 1.3. Con đường sinh tổng hợp cellulose ở chủng Gluconacetobacter
13
1.4. Gây đột biến ở vi sinh vật
Đột biến (Mutation) bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là biến đổi, được nhiều
nhà nghiên cứu khai thác ở các khía cạnh khác nhau.Theo quan điểm hiện đại,
đột biến là những biến đổi trong vật chất di truyền xảy ra đột ngột.

0
có
tác dụng biến đổi mạnh nhất tới bộ máy di truyền VSV. Đây cũng là bước
sóng mà các nhà nghiên cứu hay dùng.
14
Cơ chế gây đột biến của tia UV đối với VSV còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên
nhiều nghiên cứu đưa ra một giả thuyết chung như sau: Ở bước sóng 26000A
0

AND của vi khuẩn hấp thụ mạnh nhất. Dưới tác động của tia UV, bazơ
cystein gắn thêm phân tử H
2
O vào liên kết C=C của mạch vòng và thymin bị
đứt liên kết C=C mạch vòng nối hai phân tử dime thymin. Do đó các nhánh
thymin gần nhau trong chuỗi ADN xuất hiện các liên kết cộng hóa trị, ức chế
sự nhân đôi của ADN [3], [8].
Từ nhu cầu sản xuất trên quy mô công nghiệp, các nhà nghiên cứu đã và đang
tiến hành những phương pháp tác động đến bộ máy di truyền của các chủng
dại, nhằm chọn ra giống có khả năng “siêu tổng hợp” đáp ứng những nhu cầu
cấp thiết hiện nay. Thành tựu nổi bật nhất nhờ sử dụng phương pháp đột biến
này mang lại là việc tuyển chọn thành công “siêu chủng”
Penicilliumchrysogenum Wis 49-133 dùng để sản xuất Penicillin. Nhờ
phương pháp này từ chủng gốc ban đầu (1941) hoạt tính chỉ đạt 30 UI/ml đến
năm 1967 đạt 5000 UI/ml. Với công đoạn gây đột biến sau đó chọn lọc các
chủng có hoạt tính mạnh. Các nhà nghiên cứu đã tạo được ra “siêu chủng” có
năng suất gấp 700 lần so với chủng dại. Thành công này đã góp phần không
nhỏ trong công nghiệp sản xuất kháng sinh phục vụ nhu cầu cấp thiết cho con
người.
Ngày nay, với những kỹ thuật hiện đại gây biến đổi bộ máy di truyền của
VSV theo những hướng xác định như lai ghép tế bào trần và chuyển gen. Đã

2.1.3. Hoá chất
Nguồn đường: Glucose (sản xuất tạiHà Nội, Việt Nam).
Nguồn Nitơ:
Nguồn nitơ vô cơ: (NH
4
)
2
SO
4
(sản xuất tại Trung Quốc)
Nguồn nitơ hữu cơ: pepton (sản xuất tại Trung Quốc)
16
Một số hóa chất vô cơ: KH
2
PO
4
, MgSO
4
.7H
2
O, NaOH (sản xuất tại
Trung Quốc).
Một số loại thuốc nhuộm: tím gentinan, dung dịch fushsin, dung dịch
lugol
Agar (sản xuất tại Hải Phòng, Hà Nội, Việt Nam)
Acid acetic (sản xuất tại Hà Nội, Việt Nam)
(được cung cấp bởi phòng Vi sinh vật, Khoa Sinh - KTNN, trường Đại
học Sư phạm Hà Nội 2)
2.1.4. Môi trường
2.1.4.1. Môi trường giữ giống (MT1)

: 2g MgSO
4
.7H
2
O: 2g
pH: 5,0 - 6,0 Acid acetic : 2%
Nước dừa: 1000 ml
2.1.4.3. Môi trường lên men (MT3)
Glucose: 20g (NH
4
)
2
SO
4
: 3g
KH
2
PO
4
: 2g MgSO
4
.7H
2
O: 2g
pH: 5,0 - 6,0 Acid acetic: 2%
Nước dừa: 1000 ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh
2.2.1.1. Phương pháp đếm khuẩn lạc
Lấy 1ml dịch huyền phù có chứa vi khuẩn 24h giờ nuôi cấy, pha loãng