1
I HC THI NGUYấN
TRNG I HC NễNG LM B TH I Tờn ti:
Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp enzyme nattokinase từ boza KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC
H o to : Chớnh quy
Chuyờn ngnh : Cụng ngh sinh hc
Lp : K42 - CNSH
Khoa : CNSH-CNTP
Khoỏ hc : 2010-2014
Ging viờn hng dn: TS. Dng Vn Cng
Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn
ThS. Lng Hựng Tin
Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn
Thỏi Nguyờn, nm 2014

Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính phân giải máu đông từ Boza 26
Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 27
Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 28 4
DANH MỤC CÁC HÌNH
trang
Hình 2.1: Natto và enzyme Nattokinase 7
Hình 2.2: Các cơ chế tác động lên fibrin của Nattokinase 9
Hình 2.3. Hình ảnh sản phẩm Boza 16
Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 27
Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới hoạt tính Nattokinase của vi
khuẩn BL4 29
Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới hoạt tính sinh Nattokinase của vi khuẩn
BL4 30
Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp Nattokinase của vi
khuẩn BL4 31 5
DANH MỤC VIẾT TẮT

pI Điểm đẳng điện
Da Dalton
MW Khối lượng phân tử
B. subtilis Bacillus subtilis
TS Tiến sĩ
t-PA Tissue plasminogen activator
Bệnh viện TƯ Bệnh viện trung ương

3.3.3. Các môi trường sử dụng (Sambrook và Russel, 2006) 21
3.4. Nội dung nghiên cứu 22
3.5. Phương pháp nghiên cứu 22
3.5.1.Phương pháp phân lập 22
3.5.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn 22
3.5.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 23

7
3.5.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh
tổng hợp nattokinase của vi khuẩn 23
3.5.5. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 25
3.5.6. Phương pháp nhân giống vi khuẩn 25
3.6. Phương pháp sử lý số liệu 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên
men Boza 26
4.2. Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh Nattokinase từ mẫu đồ uống lên
men Boza 26
4.2.1. Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 26
4.2.2. Kết quả nghiên cứu đặc tinh sinh hóa của vi khuẩn BL4 28
4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp
Nattokinase của vi khuẩn BL4 29
4.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng
hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 29
3.3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp
Nattokinase của vi khuẩn BL4 30
3.3.3. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp Nattokinase của vi khuẩn BL4 31
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33
4.1. Kết luận 33
4.2. Kiến nghị 33

Thổ Nhĩ Kỳ. Trong Boza có hệ vi sinh đa dạng, bao gồm nhiều loại lợi khuẩn như là
vi khuẩn lactic như: Lactobacillus brevis, Lb. platarum, Lb. graminis, Lb.
paraplantarum, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis [18]. Các chủng vi khuẩn trong
Boza không chỉ lên men tạo sản phẩm giàu dinh dưỡng từ lúa mạch mà có thể tổng

2
hợp sinh Nattokinase trong sản phẩm. Để đánh giá được điều này, chúng tôi lựa chọn
đề tài “Phân lập và nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
enzyme nattokinase từ boza” là đề tài nghiên cứu.
1.2. Mục đích nghiên cứu
Phân lập và nghiên cứu được khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase
của các chủng vi khuẩn từ Boza.
1.3. Yêu cầu
- Phân lập được các chủng có khả năng sinh enzyme phân hủy máu đông
Nattokinase từ sản phẩm lên men Boza.
- Nghiên cứu đặc điểm hình thái của các chủng đã phân lập được.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh
Nattokinase của các chủng đã phân lập.
1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
- Phân lập được các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme phân hùy máu
đông từ Boza, làm cơ sở để nghiên cứu tiếp theo trong thực tiễn.
- Giúp sinh viên tiếp cận với thực tế nghiên cứu khoa học, thành thạo các
thao tác phòng thí nghiệm vi sinh.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Phân lập được chủng vi khuẩn từ Boza có khả năng ứng dụng trong sản
xuất chế phẩm phân hủy huyết khối trong phòng, chữa các bệnh tim mạch.

3
PHẦN 2

các mảng xơ vữa, cải thiện tính đàn hồi của động mạch. Do đó, ở Mỹ, cơ quan quản
lý thực phẩm và thuốc (FDA) từ năm 1999 đã cho phép dùng đậu nành để làm giảm
nguy cơ động mạch vành.
- Cung cấp đủ dưỡng chất
Các chuyên gia dinh dưỡng Mỹ khẳng định chế phẩm từ đậu nành rất giàu dinh
dưỡng và ăn một khẩu phần đậu nành mỗi ngày giúp bổ sung đầy đủ dưỡng chất.
“Đậu nành cung cấp nhiều chất quan trọng như kali, ma-giê, chất xơ, chất chống ô-xy
hóa”, hãng tin New Kerala dẫn lời chuyên gia Katherine Tucker cho biết.
- Điều trị chứng mãn kinh
Gần đây, người ta phát hiện thấy trong hạt đậu nành có isoflarm còn gọi là
estrogen thực vật (phytoestrogen); hoạt chất này góp phần làm cân bằng hormon ở
phụ nữ mãn kinh, cải thiện rõ rệt các triệu chứng khác của tuổi mãn kinh như: Bốc
hỏa, đổ mồ hôi đêm, trầm cảm, khô âm đạo…
[33]

- Tác dụng chuyển hoá xương
Thống kê dịch tễ học cho thấy: Tỷ lệ gãy xương ở phụ nữ châu Á thấp hơn rõ
rệt so với phụ nữ ở các nước phương Tây. Kết quả này có liên quan tới sử dụng
nhiều thức ăn chế biến từ đậu nành. SI (isoflarm của đậu nành) làm tăng mật độ
khoáng tại các đốt sống 1,2 đến 1,4 lần (so sánh với phụ nữ dùng thức ăn ít có đậu
nành). Ở chuột thực nghiệm, SI làm giảm nguy cơ loãng xương do ức chế hoạt tính
của hủy cốt bào, nên có tác dụng hiệp đồng chống tiêu xương.
- Tác dụng trên các khối u phụ thuộc và hormon
Thống kê dịch tễ học cũng cho thấy một số loại khối u phụ thuộc vào
hormon (ở màng trong tử cung, ở vú, buồng trứng…) có tỷ lệ rất thấp ở phụ nữ
châu Á. Nhận xét này có liên quan tới chế độ ăn giàu đậu nành ở công dân châu Á.
Kết quả nghiên cứu về thực nghiệm và lâm sàng cho thấy SI (isoflarm ở đậu nành)
có tác dụng làm giảm nguy cơ ung thư ở tử cung, vú và buồng trứng.
tế về dinh dưỡng tổ chức tại New Zealand (30/4-3/5/2006) GS Masafumi Kitakaze
đã khẳng định Natto có tác dụng làm giảm rõ rệt các chứng Mỡ (Triglyceride và

6
Cholesterols) trong máu cao qua nghiên cứu chung của 4 cơ quan y tế Nhật Bản,
kêu gọi cộng đồng thế giới cải thiện nếp sinh hoạt (Lifestyle) và tiêu thụ Natto
thiên nhiên trước nguy cơ béo phì do “thừa” dinh dưỡng và các chứng bệnh hiểm
nghèo, nan y (tiểu đường, ung thư) ngày càng tăng khắp nơi trên thế giới.[3]
2.1.2. Natto và Nattokinase
Natto còn được gọi là pho mai thực vật là những hạt đậu nành đã luộc chín
được ủ với men (Bacillus natto) ở một môi trường 40
o
C trong vòng 14-18 giờ để
lên men thành những hạt đậu có màu nâu, độ nhờn nhớt cao, có mùi nồng nặc rất
khó chịu với người không quen. Theo kinh nghiệm của nhà sản xuất cho biết khi độ
nhớt càng cao thì chất lượng Natto càng tốt và vị càng ngọt. Là một món ăn dân dã
rất phổ biến ở nông thôn Nhật bản, họ thường ăn cơm sáng với Natto, nước tương
với rong biển phơi khô (Nori) và trứng gà sống. Natto có chứa nhiều chất bổ dưỡng
cho sức khỏe trong đó enzym Nattokinase là một hoạt chất sản sinh trong quá trình
lên men Natto được xem là hoạt chất có hiệu quả trong việc ngăn ngừa các chứng
bệnh tim mạch-một phát hiện vô cùng lý thú bởi nhà nghiên cứu sinh lý học Nhật
bản nổi tiếng, giáo sư Sumi Hiroyuki vào năm 1980.
Nattokinase còn được gọi là: Subtilisin NAT, Subtilisin BSP. Nattokinase là
một enzym có hoạt động fibrinolytic rất mạnh mẽ, được chiết xuất và tinh chế từ
natto. Do đó Nattokinase có nghĩa là “enzym trong natto”. 7

Hình 2.1: Natto và enzyme Nattokinase

Năm 1987, Sumi Hiroyuki công bố toàn bộ kết quả nghiên cứu về tác dụng
của Nattokinase sau khi thử nghiệm gần 200 loại thực phẩm khác nhau để so
sánh, xác định Nattokinase là một loại enzyme mang khả năng phân hủy huyết khối
một cách hữu hiệu và mạnh nhất trong các loại enzym, gấp 4 lần plasmin,enzym
nội sinh làm tan máu đông, đồng thời tuyệt đối an toàn cho cơ thể khi hấp thụ qua
đường ăn uống [27].

9
2.1.2.2. Cơ chế tác động của Nattokinase [27]
Hình 2.2: Các cơ chế tác động lên fibrin của Nattokinase
(Nattokinase thủy phân fibrin trực tiếp (A), Thay đổi chuyển hóa prourokinase
thành Urokinase (B), Tăng chất hoạt hóa plasminogen mô (tPA))

Nattokinase, hoạt chất chính chiết xuất từ Natto,là một enzyme tìm thấy
trong tự nhiên có trọng lượng phân tử 20,000 ± 5000. Nó bền với nhiệt đến 60ºC
với pH 6–12. Mặc dù cơ thể con người có vài loại enzyme tạo ra cục máu đông
nhưng chỉ có một enzyme duy nhất là “plasmin” để phá hủy và hòa tan nó. Đặc tính
của Nattokinase gần giống với plasmin. Nattokinase chiết xuất từ Natto, là một
enzyme thủy phân hiệu quả các mảng bám và huyết khối khi các sợi fibrin này kết
hợp lại với nhau. Nattokinase có cấu trúc của một protein, được tạo ra bởi chuỗi
đơn polypeptide có 275 phân tử, có Ala ở N-cuối cùng. Nó thủy phân sợi huyết
mạnh mẽ. Nattokinase là một enzyme thủy phân fibrin mạnh nhất trong gần 200
loại thực phẩm bổ xung qua đường ăn uống được nghiên cứu [25].
10
Nattokinase hoạt động mạnh gấp 4 lần plasmin nội sinh, một loại enzyme
làm tan fibrin trong cơ thể. Do sức khỏe và tuổi tác, cơ thể giảm sản sinh plasmin
càng làm tăng nguy cơ hình thành cục máu đông. Nattokinase cũng giúp tăng
cường plasmin của cơ thể và các thành phần chống đông máu khác như urokinase
tăng cường lưu thông máu, ngăn chặn xơ vữa mạch. Không giống như aspirin và
hầu hết các thuốc chống đông máu khác sẽ ức chế sản xuất fibrin, Nattokinase trực

hành nghiên cứu tại Đại học Chicago. Tiến sĩ thử nghiệm với gần 200 loại thực
phẩm và phát hiện ra tiềm năng của đậu natto khi cho nó vào cục máu nhân tạo và
giữ ở nhiệt độ cơ thể. Ông nhận thấy huyết khối bị tan dần và hoàn toàn biến mất
sau 18 tiếng.
TS Sumi kế tiếp thử nghiệm lâm sàng với con người và động vật. Trong
nghiên cứu đầu tiên, 12 tình nguyện viên được cho sử dụng 200g Natto hàng ngày.
Các hoạt động Fibrinolytic máu của họ được đo theo 2 cách. Lấy mẫu máu và kích
thích tạo một cục máu đông trong mẫu sau đó đo thời gian cục máu đông tan hoàn
toàn. Nhóm sử dụng Nattokinase mất một nửa thời gian so với nhóm đối chứng.
Bài kiểm tra thứ hai dùng máu cho vào đĩa với một loại polyme fibrinogen
đặc biệt. Mức độ tan được đo 4 tiếng 1 lần. Nhóm đối chứng cho thấy không tan
trong khi nhóm Nattokinase có tốc độ tan là 14mm/h.
Một thử nghiệm thứ ba sau đó được thực hiện để đo các mô hoạt hóa
plasminogen (t-PA) trong máu. Nhóm dùng Nattokinase cho thấy có sự tăng tPA.
tPA làm tăng plasmin, do đó các nghiện chỉ ra rằng ngoài khả năng trực tiếp tiêu sợi
Fibrin, nó còn tăng cường hoạt động chống hình thành cục máu đông của cơ thể.
TS Sumi cũng tiến hành một thử nghiệm lâm sàng liên quan đến chó. Một
cục máu đông được tạo ra trong tĩnh mạch chân của chó gây tắc nghẽn hoàn toàn.
Sau 5h nhóm được cho ăn đậu Natto tĩnh mạch đã hoàn toàn lưu thông. Trong khi
đó nhóm dùng giả dược vẫn còn những cục máu đông gây tắc nghẽn 18 giờ sau đó
[27].
12
Năm 1995, nhà nghiên cứu ở phòng thí nghiệm Nghiên cứu Công nghệ sinh
học và JCR Pharmaceuticalscủa Kobe, Nhật Bản đã thử nghiệm hiệu quả của
Nattokinase trong việc giảm huyết khối động mạch cảnh trên chuột. Một số chuột
được tiêm huyết khối ở động mạch cảnh, nguồn cung cấp dinh dưỡng cho não. Ba
enzym là Nattokinase, plasmin và elastase được dùng để thử nghiệm trên chuột.
Elastase cho thấy không mở lại các động mạch bị chặn. Nhóm ăn Plasmin cho thấy
lưu thông phục hồi 16% sau một giờ. Còn nhóm ăn Nattokinase cho thấy phục hồi
62% lưu thông trong cùng khoảng thời gian. Kết quả này giúp nhà nghiên cứu kết

MW= 27728 Da, pI= 8,6+0,3, có tính chất tương đồng cao với cơ chất và
không có cầu disulfide.
Nattokinase thuộc họ subtilisin của protease serin, cũng có trung tâm hoạt
động bao gồm nhóm hydroxyl của Ser-221, imidazol của His-64 và nhóm
carboxyl của Asp-32.[1]
2.1.2.4. Cơ chế tiêu fibrin của nattokinase
Nattokinase phân hủy fibrin trực tiếp hay gián tiếp thông qua 3 con
đường khác nhau [32]:
Nattokinase trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông, làm biến đổi fibrin
từ dạng polymer không tan thành các sản phẩm giáng hóa có trọng lượng phân tử thấp,
hòa tan. Như vậy, Nattokinase có cơ chế tiêu fibrin giống với plasmin.
Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa pro-
urokinase thành urokinase. Kết quả là thúc đẩy quá trình biến đổi plasminog
en thành plasmin, làm tăng plasmin nội sinh.
Nattokinase giáng hóa fibrin gián tiếp bằng cách hoạt hóa quá trình tổng hợp
t- PA trong huyết tương. Kết quả là tăng cường tạo thành plasmin.
14
Đặc biệt, Nattokinase không ảnh hưởng đến quá trình hình thành
fibrin từ fibrinogen, do đó không làm suy giảm cơ chế đông máu bình thường của
cơ thể. Vì vậy, Nattokinase không gây ra biến chứng chảy máu như các thuốc
chống đông máu bình thường.
2.1.2.5. Tính an toàn của Nattokinase
Những thành quả của TS Sumi Hiroyuki cũng đã được hai vị chuyên gia ở
hai khu vực khác nhau phối hợp nghiên cứu, đó là bác sĩ Martin Milner ở Trung
tâm Y khoa tự nhiên Portland, bang Oregon (Hoa Kỳ) và TS Kouhei Makise thuộc
bệnh viện Makise ở Kyoto, cùng công bố kết quả qua bài viết trên tạp chí chuyên
môn kết luận rằng “là chuyên gia lâu năm về tim mạch và hô hấp chúng tôi nhất trí
khẳng định rằng Nattokinase là một phát hiện đầy phấn chấn trong việc ngăn ngừa
và điều trị các chứng bệnh liên quan đến tim mạch”, và “chúng tôi xác định
Nattokinase là một hoạt chất thiên nhiên có thể làm tan các huyết khối hữu hiệu,

-
Streptomyces

+ S. megaspores SD5

+ S. spheroids M8-2

+ Streptomyces sp. Y405

-
Nấm

+ Aspergillus ochraceus 513

+ Cochliobolus lunatus

+ Fusarium oxysporum

+ Fusariumpallidoroseum

+ Penicillin chrysogenum H9

+ Pleurotus ostreatus

+ Rhizopus chinensis 12

-
Tảo

+ C. intricatum


El-Aassar et al. 1990

Choi and Shin 1998

Xiao-Lan et al. 2005Matsubara et al. 1998

Matsubara et al. 1999

Matsubara et al. 2000

Streptomycesmegaspores SD5 được phân lập từ suối nước nóng có khả năng
tạo ra enzyme phân hủy fibrin chịu nhiệt . Một số loại nấm cũng có thể tạo ra
protease có hoạt tính thủy phân fibrin cao như Aspergillus ochraceus 513,
16
Fusarium oxysporum, Penicillium chrysogenum H9,… Trong đó các chủng thuộc
chi Bacillus là nguồn vi sinh vật quan trọng để sản xuất enzyme thủy phân fibrin.
Vào năm 1987, Bacillus subtilis natto sinh tổng hợp Nattokinase lần đầu tiên
được khảo sát từ thực phẩm lên men đậu tương truyền thống của Nhật là natto .
2.2. Boza
Hình 2.3. Hình ảnh sản phẩm Boza
Boza là một loại đồ uống lên men rất phổ biến ở các nước Đông Âu như
Bulgaria, Rumania, Albania và Thổ Nhĩ Kỳ. Nó là một sản phẩm làm từ lúa mì
hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp (thường là khoảng 0,5%), và có một
hương vị ngọt hơi chua. Nó chứa carbohydrate và nhiều vitamine.Boza được sản
xuất tại khu vực Balkan và hầu hết các khu vực gốc Thổ Nhĩ Kỳ, nó được sản xuất
từ kê và nhiều loại ngũ cốc khác. Các hương vị khác nhau tùy theo từng loại ngũ

quả tốt đối với bệnh nhân đột quỵ não. Rất nhiều thuốc chóng bệnh tim mạch và
đột quỵ não hiện nay có thành phàn chính là enzyme Nattokinase.
18
2.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Việc nghiên cứu enzyme Nattokinase ở nước ngoài rất được chú trọng được
nghiên cứu từ rất sớm và ngày càng được quan tâm vì những lợi ích mà nó mang lại.
Trong suốt những năm 1990, các nhà nghiên cứu báo cáo kết quả về các phương
pháp khác nhau để của tách và tinh chế Nattokinase và các tài liệu công bố về hoạt tính
tiêu sợi huyết của Nattokinase trong In-vitro. Năm 1990, Sumi và công sự, báo cáo hiệu
quả của viên nang Nattokinase trong thử nghiệm phân giải huyết khối ở chó [25]. Đã có ít
nhất ba nghiên cứu chứng minh hoạt tính của Nattokinase ở chuột [11][12][13].
Một trong những thử nghiệm hấp dẫn trên người tiến hành với 12 tình
nguyện viên khỏe mạnh người Nhật Bản [26]. Mỗi người tham gia sử dụng 200 g
Natto một lần mỗi ngày trước bữa ăn sáng, tiếp theo là kiểm tra định kỳ plasma
trong máu. Sau một khoảng thời gian 2 tuần, mỗi người lại ăn 200 g đậu nành luộc
vào trước bữa ăn sáng. Và lại kiểm tra định kỳ plasma trong máu. Chỉ có một biến
đổi nhỏ trong kết quả của nhóm kiểm chứng là những người ăn đậu nành luộc.
Ngược lại, nhóm ăn natto cho thấy thời gian thủy phân fibrin (euglobulin lysis
time-ELT) giảm đáng kể và hoạt độ cao enzyme tiêu sợi huyết tăng sau khi sử dụng
natto. Sự cải thiện hoạt tính của plasma tiêu sợi huyết được duy trì với giá trị p
<0.005 từ 2 đến 8 giờ sau khi sử dụng.
Đối với các thử nghiệm tương tự,sử dụng hai viên nang chứa 650 mg
Nattokinase , ba lần mỗi ngày trong 8 ngày liên tiếp . Máu được lấy mỗi buổi sáng
và các thông số tiêu sợi huyết được đo trong huyết thanh và plasma của các đối
tượng. Hoạt tính tiêu sợi huyết euglobin trong các đối tượng này tăng dần từ đầu
đến ngày thứ tám. Sản phẩm fibrin thủy phân của các đối tượng vào ngày đầu tiên
sử dụng cao hơn đáng kể so với mức trước khi dùng .
Trong một thử nghiệm khác trên người, Okamoto và cộng sự đã báo cáo sự
hiện diện của chất chống huyết áp cao của natto [21].Nhận định này được lặp lại
thành công bởi Murayama và Sumi (1998) [19]. Trong nghiên cứu này nhỏ, Natto