Tp chớ Khoa hc v Phỏt trin 2011: Tp 9, s 3: 452 - 463 TRNG I HC NễNG NGHIP H NI
Phân lập v nghiên cứu vi khuẩn a muối, a kiềm sinh enzyme protease
v bớc đầu thử nghiệm để sản xuất nớc mắm ngắn ngy
Isolation and Characterization of Halophilic Alkaliphilic Bacteria Producing
Protease and their Use to Accelerate Fish Sauce Fermentation
Nguyn Vn Lõm
1
, Nguyn Phng Nhu
2
, Trnh Th Ngc
1,3
1
Khoa Cụng ngh Thc phm, Trng i hc Nụng nghip H Ni
2
Vin Cụng ngh Sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam
3
Cụng ty TNHH ANT (HN), Khu Cụng nghip Tõn Trng, Cm Ging, Hi Dng
a ch email tỏc gi liờn lc:[email protected]; [email protected]
Ngy gi ng: 27.04.2011; Ngy chp nhn: 20.06.2011
TểM TT
Vi khun a mui v a kim sinh enzyme protease cú vai trũ quan trng trong cụng nghip
thc phm nh s dng sn xut nc mm ngn ngy. Trong thớ nghim ny, 449 chng vi
khun a kim ó c phõn lp t 56 mu nc v mu bựn t cỏc vựng ven bin, trong ú cú 190
chng sinh protease. Ba chng 2.2, 2.20 v 18.2 cú kh nng sinh tng hp protease cao, c bit l
chng 2.2 cú kh nng sinh trng tt nng mui 3-4% v kh nng sinh tng hp protease cao
nht. Kt qu nghiờn cu c im ca enzyme protease ca chng 2.2 cho thy protease ca chng
ny cú nhit ti thớch 45
o
C, pH ti thớch l 8 v enzyme ny vn cú kh nng xỳc tỏc nhit v
pH cao hn. c im ny phự hp s dng trong sn xut nc mm ngn ngy. Ba chng 2.2,
2.20, 18.2 c s dng ỏnh giỏ kh nng thu phõn cỏ. Kt qu cho thy sau 15 ngy lờn men,

cha bão ho cao nên rất có ích đối với sức
khỏe con ngời (Dincer & cs., 2010). Ngoi
ra, nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng nớc
mắm còn có hoạt tính chống oxy hoá
(Aoshima v Ooshima, 2009). ở Việt Nam,
nớc mắm l sản phẩm truyền thống, đợc
sản xuất từ lâu đời. Ngy nay, nớc mắm
không chỉ đợc sản xuất để đáp ứng nhu cầu
tiêu dùng ở trong nớc m còn đợc xuất
khẩu sang nhiều nớc trên thế giới.
Nớc mắm sản xuất theo phơng pháp
lên men truyền thống thờng mất nhiều thời
gian nên rất khó đáp ứng nhu cầu sử dụng
ngy cng lớn trên thị trờng. Vì vậy, để đáp
ứng nhu cầu sử dụng nớc mắm ngy cng
tăng cần rút ngắn quá trình lên men cá. Quá
trình ny có thể rút ngắn bằng cách điều
chỉnh pH, nồng độ muối v nhiệt độ. Sự điều
chỉnh ny với mục đích tối u hoá sự sinh
enzyme protease của vi khuẩn trong ruột cá
(Yongsawatdigul & cs., 2007). Một cách khác
để rút ngắn quá trình sản xuất nớc mắm l
bổ sung vi khuẩn để lm tăng tốc độ lên
men. Siringan & cs. (2006) đã bổ sung chính
vi sinh vật lên men ở cá để rút ngắn quá
trình lên men. Tuy nhiên, hoạt tính của
enzyme protease của những vi khuẩn ny bị
giảm dần trong quá trình lên men do hm
lợng muối cao. Do vậy, sử dụng vi sinh vật
chịu mặn sinh protease có thể khắc phục

C
nếu cha nghiên cứu ngay.
2.2. Phân lập v phân loại vi sinh vật dựa
vo hình thái
Ho tan 1 g mẫu bùn hoặc 1 ml nớc bằng
9 ml nớc muối sinh lý 0,85%. Dùng máy
voltex lắc đều mẫu trong thời gian 10 phút.
Sau đó hút 0,5 ml dịch pha loãng trên cho
vo 4,5 ml nớc muối sinh lý 0,85% đợc độ
pha loãng 10
-2
. Tiếp tục pha loãng dần nh
trên đến nồng độ cần thiết.
Lấy 0,1 ml dịch pha loãng ở nồng độ cần
thiết nhỏ vo chính giữa các đĩa môi trờng
vi sinh vật tổng số, môi trờng vi sinh vật a
kiềm, môi trờng nấm mốc v môi trờng
nấm men. Dùng que trang gạt cho đến khi
khô mặt thạch. Các đĩa đã gạt đặt trong tủ
ấm 37
o
C. Sau 24 giờ lấy các đĩa ra v đếm số
lợng khuẩn lạc.
Các chủng vi sinh vật đợc phân loại
dựa trên hình thái khuẩn lạc v hình thái tế
453
Nguyn Vn Lõm, Nguyn Phng Nhu, Trnh Th Ngc
bo. Các chủng vi sinh vật đợc phân lập
trên môi trờng rắn v hình thái khuẩn lạc
đợc quan sát dựa trên các chỉ số: khả năng

với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở
4
o
C để loại bỏ sinh khối. Nhỏ 100 l dịch
enzyme thô vo lỗ thạch có đờng kính 5 mm
trên đĩa môi trờng có chứa casein để xác
định vòng phân giải protein. Các đĩa thạch
ny đợc để lạnh trong 2 giờ, giúp enzyme có
khả năng khuyếch tán. Sau đó ủ ở 30
o
C
trong vòng 24 giờ, cho thêm trichloroacetic
acid (TCA), rồi quan sát v đo đờng kính
vòng phân giải (Egorov, 1976).
2.3.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase v cellulase
Vi khuẩn đợc nuôi cấy trong môi
trờng lỏng trên máy lắc 200 vòng/phút ở
30
o
C trong thời gian 48 giờ. Dịch môi trờng
đợc thu lại bằng cách ly tâm với tốc độ
13.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
o
C để loại
bỏ sinh khối. Nhỏ 100 l dịch enzym thô vo
lỗ thạch có đờng kính 5 mm trên đĩa môi
trờng có chứa CMC (cacboxyl methyl
cellulose) hoặc tinh bột tan. Các đĩa thạch
ny đợc để ở 4

200 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi cấy ly tâm
dịch nuôi, loại bỏ sinh khối v xác định hoạt
tính protease theo phơng pháp khuyếch tán
trên thạch.
2.4.2. ảnh hởng của pH
Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nhân
giống trên môi trờng nớc biển, đợc cấy
chuyển vo môi trờng có nồng độ NaCl 3%
v pH thay đổi từ 3 đến 12, nhiệt độ nuôi cấy
l 30
o
C, lắc ở 200 vòng/phút. Sau 24 giờ nuôi
cấy ly tâm dịch nuôi, loại bỏ sinh khối v xác
định hoạt tính protease theo phơng pháp
khuyếch tán trên thạch.
454
Phõn lp v nghiờn cu vi khun a mui, a kim sinh enzyme protease v bc u th nghim
2.4.3. ảnh hởng của nhiệt độ
Các chủng vi khuẩn sau 24 giờ nhân
giống trên môi trờng nớc biển, đợc cấy
chuyển vo môi trờng có nồng độ NaCl 3%
với pH 7, lắc ở 200 vòng/phút tại các nhiệt độ
25, 30, 37, 45 v 50
o
C. Sau 24 giờ nuôi cấy
xác định khả năng sinh trởng v sinh tổng
hợp protease của các chủng phơng pháp
khuyếch tán trên thạch.
2.5. Xác định một số tính chất của
protease từ chủng vi sinh vật tuyển


0,5 M v dung dịch 1 ml Folin Ciocalteau.
Trộn đều sau đó ủ ở 30
o
C trong 20 phút. Đo
độ hấp thụ quang ở bớc sóng 670 nm. ống
đối chứng đợc lm song song bằng cách cho
4 ml TCA 0,3 M vo ống nghiệm trớc khi
thêm casein v enzyme vo.
Tính kết quả
Hoạt độ protease (Hđp) tính bằng (đv/ml)

(a b)*8*P
Hdp
181*10*1

=

(a - b): Số microgam tyrosine tơng ứng
với hiệu số đọc trên máy giữa ống thí
nghiệm v ống đối chứng
8: Tổng thể tích của phản ứng enzyme
P: Độ pha loãng của dung dịch enzyme
181: Khối lợng phân tử của tyrosine
10: Thời gian phản ứng enzyme
1: Thể tích enzyme sử dụng trong phản
ứng mu.
Hoạt độ protease đặc trng cho khả
năng xúc tác phân giải protein tới peptit v
axit amin của các enzyme v đợc biểu thị

2.8.1. Xác định hm lợng nitơ tổng số
Hm lợng nitơ tổng đợc xác định theo
phơng pháp Kjeldhal mô tả bởi Vũ Thị Th
& cs. (2001). 3 ml dịch cá đã pha loãng 20 lần
455
Nguyn Vn Lõm, Nguyn Phng Nhu, Trnh Th Ngc

đợc vô cơ hoá bằng 5 ml dung dịch H
2
SO
4
đậm đặc ở điều kiện nhiệt độ cao. Nitơ
amonia tạo thnh dới dạng (NH
4
)
2
SO
4
đợc
chng cất v thu lại bằng 20 ml dung dịch
acid boric 2,5%. Nitơ amonia trong đợc hấp
thu trong dung dịch acid boric đợc chuẩn độ
bằng H
2
SO
4
0,1N.
V
2
: Lợng H

4
0,1N đợc dùng để
chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml)
Trong tổng số 56 mẫu đợc phân lập để
xác định thnh phần v các nhóm vi sinh
vật, nghiên cứu đã phân lập đợc 892 chủng
vi khuẩn, trong đó có 449 chủng a kiềm,
chiếm trên 50%. Xác định khả năng sinh
tổng hợp enzyme protease, kitinase,
cellulase v amylase của các chủng vi khuẩn
a kiềm ny đã cho thấy số vi khuẩn có khả
năng sinh protease chiếm trên 42% tổng số
vi khuẩn (Bảng 1). Ngoi ra, khả năng sinh
các enzyme khác nh kitinase, cellulase v
amylase cũng thấy ở nhiều chủng vi khuẩn.
Trong đó có tới 67 chủng có khả năng sinh cả
4 loại enzyme ny, điều đó có thể giúp dễ
dng lựa chọn môi trờng nuôi cấy sau ny.
V
2
: Lợng H
2
SO
4
0,1N đợc dùng để
chuẩn độ mẫu đối chứng (ml)
0,0014: Số gam nitơ tơng ứng với 1 ml
H
2
SO

Hm lợng nitơ amonia đợc tính theo
công thức:
NNH
3
=
12(V V ).0,0014.10.1000
v


V
1
: Lợng H
2
SO
4
0,1N đợc dùng để
chuẩn độ mẫu thí nghiệm (ml)
Bảng 1. Khả năng sinh một số enzyme của các vi khuẩn a kiềm
Hot tớnh enzyme Tng s chng Protease Kitinase Cellulase Amylase
S lng 449 190 290 268 150
T l (%) 100 42,3 64,6 59,7 33,4

456
Phõn lp v nghiờn cu vi khun a mui, a kim sinh enzyme protease v bc u th nghim
Bảng 2. Khả năng sinh một số enzyme của 23 chủng vi khuẩn tuyển chọn
S TT Chng Protease Kitinase Cellulase Amylase
1 2.17 + + + + + -
2 2.19 + + + + + + +
3 2.2 + + + + + + + + + + + + + +
4 2.20 + + + + + + + + + + + + +

sc t
Gram
Hỡnh dng
t bo
1 9.2 Trng c Mộp phng, trn, li 2-3 - (+) Hỡnh cu
2 18.2 Trng c Mộp rng ca, nhn nheo 4-5 - (+) Hỡnh que
3 18.6 Vng nht Mộp phng, trn, trũn 5-6 - (+) Hỡnh ovan
4 2.2 Vng nht Mộp phng, hi nhn 4-5 - (+) Hỡnh que
5 2.20 Vng nht Mộp phng, trn, hi li 3-7 - (+) Hỡnh cu
Ghi chỳ: -: Khụng tit sc t; (+): Gram +
3.2. Một số đặc điểm hình thái của 5 chủng
vi khuẩn đợc tuyển chọn
Các chủng vi khuẩn tuyển chọn đợc cấy
lên môi trờng nớc biển ở 30
o
C trong 24 giờ,
sau đó đem ra quan sát mu sắc, hình dạng
v kích thớc khuẩn lạc. Khuẩn lạc của các
chủng vi khuẩn ny có mu trắng đục hoặc
vng nhạt v hầu hết có mép phẳng, trơn
(Bảng 3). Quan sát hình thái vi khuẩn cho
thấy cả 5 chủng vi khuẩn đều l Gram (+)
nhng hình dạng rất khác nhau.
3.3. ảnh hởng của một số yếu tố đến
khả năng sinh trởng, sinh tổng
hợp protease của 5 chủng vi khuẩn
tuyển chọn
3.3.1. ảnh hởng của nồng độ muối
Kết quả cho thấy, nồng độ NaCl ảnh
hởng tới tốc độ sinh trởng v khả năng


hơn 5%. Ba chủng 2.2, 2.20 v 18.2 có khả
năng sinh tổng hợp protease cao hơn 2 chủng
còn lại. Khả năng sinh tổng hợp protease của
các chủng tỉ lệ với khả năng sinh trởng của
chúng ngoại trừ chủng 2.20 có khả năng sinh
trởng tốt ở nồng độ muối 0,5% nhng lại
sinh tổng hợp protease mạnh trong môi
trờng có nồng độ muối 3%. Trong số 5
chủng ny, chủng 2.2 thể hiện khả năng
chịu mặn v sinh tổng hợp protease cao hơn
các chủng khác. Đặc tính ny rất có lợi để sử
0
0.5
1
1.5
2
2.5
0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
N

0
5
10
15
20
25
30
0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A B

g
đ
ộ
NaCl
(
%
)

Nồn
g
đ
ộ
NaCl
(
%
)

0
0.5
1
1.5
2
2.5
3456789101112
pH
OD620
2.2
2.20
18.2
9.2

OD620
2.2
2.20
18.2
9.2
18.6
0
5
10
15
20
25
30
25 30 37 45 50
Nh i t (oC)
ng kớnh vũng phõn gii (mm)
2.2
2.20
18.2
9.2
18.2

A B
Hình 3. ảnh hởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trởng (A)
v sinh tổng hợp protease (B) của 5 chủng tuyển chọn
3.3.3. ảnh hởng của nhiệt độ
Kết quả hình 3 cho thấy cả 5 chủng đều
phát triển tốt ở nhiệt độ từ 30 đến 45
o
C.

đầu cho sự phân loại v ứng dụng enzyme
trong thực tế. Nhìn chung, cả ba yếu tố nồng
độ muối, pH v nhiệt độ đều ảnh hởng đến
hoạt tính xúc tác của enzyme protease của
chủng 2.2 (Hình 4A, 4B v 4C).
Enzyme protease có hoạt tính cao nhất ở
nồng độ muối 3% (Hình 4A). Nh vậy, nồng độ
muối môi trờng cho chủng 2.2 phát triển tốt
nhất cũng chính l nồng độ muối phản ứng tối
u cho hoạt động của protease. ở nồng độ
muối từ 6 đến 9%, khả năng xúc tác của
enzyme giảm xuống nhng hoạt tính vẫn khá
cao. Hoạt tính xúc tác của enzyme protease
giảm mạnh hơn ở nồng độ muối từ 10 đến 12%.
Enzyme protease của chủng 2.2 có khả
năng xúc tác trong dải pH rộng (pH 5 - 10)
v pH 8 l pH tối thích cho enzyme ny
(Hình 4B). Tuy nhiên, kết quả ny cho thấy
giá trị pH 6 thích hợp nhất cho chủng 2.2
phát triển (Hình 2A) v pH 8 l tối u cho
hoạt động của enzyme protease. Điều ny có
thể do pH 6 thích hợp cho giai đoạn đầu của
quá trình phát triển của vi khuẩn, ở giai
đoạn sau, sự phát triển của chủng 2.2 đã lm
kiềm hoá môi trờng nuôi cấy. Cũng có thể,
trong môi trờng pH 6 sự phát triển của
chủng 2.2 đạt cực đại, khả năng tổng hợp
protease v tiết chúng ra ngoi môi trờng l
tốt nhất nhng hoạt tính của protease đó lại
459

chủng 2.2 có khả năng xúc tác trong ở điều
kiện nhiệt độ từ 25 đến 50
o
C, trong đó 45
o
C
l nhiệt độ tối thích của enzyme (Hình 4C).
ở 50
o
C, hoạt tính xúc tác của enzyme vẫn
còn cao, chỉ giảm 12% so với hoạt tính
enzyme ở nhiệt độ tối thích 45
o
C. Enzyme
protease hầu nh không thể hiện hoạt tính ở
nhiệt độ 60
o
C.
3.5. Động thái sinh trởng v sinh tổng
hợp protease của chủng 2.2
Từ các kết quả trên, nghiên cứu đã lựa
chọn đợc các điều kiện, thông số tối u cho
sự lên men của chủng 2.2 l nồng độ muối
3%, pH 7, nhiệt độ 45
o
C. Chủng vi khuẩn
ny đợc tiến hnh lên men trong môi
trờng MPA (pepton 10; cao thịt 5 g/l) với các
điều kiện tối thích ny để nghiên cứu động
thái sinh truởng v sinh tổng hợp protease.

0
5
15
20
25
30
0.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
)
?ng h vũng phõn gi?i
10
kớn
N?ng ? NaCl (%
(mm)
Đờng kính vòng phân giải (mm)
Đờng kính vòng phân giải (mm)
Nồn
g
đ
ộ
NaCl
(
%
)

Đờng kính vòng phân giải (mm)
Nhiệt đ
ộ

(
o

0.3
0.35
0.4
0.45
0.5
Hdp (UI/ml
pH
OD (=670 nm)
Hdp (UI/ml)

Hình 5. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp protease của chủng 2.2
3.6. Bớc đầu đánh giá khả năng thuỷ
phân cá của chủng vi khuẩn 2.2,
2.20 v 18.2
Nghiên cứu khả năng thuỷ phân của 3
chủng vi khuẩn 2.2, 2.20 v 18.2 trên hai loại
cá phổ biến l cá biển v cá nớc ngọt đợc
thực hiện nh quy trình đã nêu trên với sự bổ
sung dịch nuôi cấy 24 giờ của 3 vi khuẩn lựa
chọn theo tỷ lệ 1 ml dịch nuôi cấy/100 g cá.
Sau 15 ngy, lấy dịch cá lần đầu để tiến hnh
đo một số chỉ tiêu cơ bản v đánh giá cảm
quan sơ bộ bớc đầu (Bảng 4).
Kết quả cho thấy, sau 15 ngy lên men
cá đã có sự khác nhau cơ bản giữa mẫu đối
chứng với các mẫu có sử dụng dịch nuôi cấy
sau 24 giờ của các chủng vi khuẩn đã chọn.
Nhìn chung lợng nitơ tổng số của mẫu bổ
sung dịch nuôi cấy đều cao hơn so với mẫu
đối chứng tuy nhiên lợng nitơ amonia tăng

461
Nguyn Vn Lõm, Nguyn Phng Nhu, Trnh Th Ngc
tạo ra nhiều hơn. Hơn nữa, do thời gian thuỷ
phân ngắn nên các chất tạo nên hơng thơm
đặc trng cho nớc mắm cha đợc tổng hợp
nhiều lm giảm độ hấp dẫn cho nớc mắm
ngắn ngy. Do vậy, để thuỷ phân cá trong
sản xuất nớc mắm ngắn ngy tốt v tạo ra
nớc mắm có độ hấp dẫn hơn, nên kết hợp
chủng 2.2 với các chủng khác có khả năng
chuyển hoá nitơ v sinh hơng thì hiệu quả
thuỷ phân sẽ cao hơn.
Bảng 4. Chỉ tiêu chất lợng dịch cá lên men sau 15 ngy
Lờn men t nhiờn B sung chng nghiờn cu
Cỏ bin
Cỏ nc
ngt
Cỏ bin Cỏ nc ngt
Ch tiờu
2.2 2.20 18.2 2.2 2.20 18.2
Mu sc sm
Vng
nht
ti
Hng
thm
Hng
ti
Vng
hi ỏnh

Hi
trong
c
Nit tng s (g/l) 9,8 8,4 15,82 13,3 12,32 14,84 11,9 10,92
Nit NH
3
(g/l) 1,61 1,47 2,45 1,47 1,61 1,61 1,61 1,75

4. KếT LUậN
Từ 56 mẫu bùn ven biển, nớc biển v
nớc chợp cá lấy tại Đ Nẵng v Thanh
Hoá phân lập đợc 449 chủng vi khuẩn a
kiềm trong đó có 190 chủng có khả năng
phân giải protein.
Đã tuyển chọn đợc 5 chủng vi khuẩn
a kiềm, a mặn có hoạt tính protease cao l
chủng 2.2, 2.20, 18.2, 18.6 v 9.2, trong đó
chủng 2.2 có khả năng sinh trởng v sinh
tổng hợp protease mạnh nhất.
Động thái sinh trởng v sinh tổng hợp
protease cho thấy, hoạt tính protease của
chủng 2.2 đạt cao nhất sau 24 giờ. Enzyme
ny hoạt động tối thích ở các điều kiện nồng
độ NaCl 3%; pH v nhiệt độ 45
o
C.
Bớc đầu nghiên cứu cho thấy sau 15
ngy thuỷ phân dịch cá có bổ sung các chủng
lựa chọn (2.2, 2.20 v 18.2), cá đợc thuỷ
phân nhanh hơn so với thuỷ phân tự nhiên.

Park, J N., Y. Fukumoto, E. Fujita, T.
Tanaka, T. Washio, S. Otsuka, T.
Shimizu, K. Watanabe, and H. Abe (2001).
Chemical Composition of Fish Sauces
Produced in Southeast and East Asian
Countries. Journal of Food Composition
and Analysis 14(2): 113-125.
Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền v
Phùng Gia Tờng (1997). Thực hnh Sinh
hóa. NXB. Giáo dục.
Phrommao, E., S .Rodtong, and
J.Yongsawatdigul (2011). Identification of
novel halotolerant bacillopeptidase F-like
proteinases from a moderately halophilic
bacterium, Virgibacillus sp. SK37.
Journal of Applied Microbiology 110(1):
191-201.
Sinsuwan, S., S. Nawong, S. Rodtong, N.
Raksakulthai and J. Yongsawatdigul (2008).
Characterization of Virgibacillus sp. SK33
cell-bound proteinases and its application as
a starter culture for fish sauce fermentation.
Journal of Biotechnology 136 (Supplement
1): S720-S721.
Siringan, P., N. Raksakulthai and J.
Yongsawatdigul (2006). Source and
changes of proteinase activities of
Indian anchovy (Stolephorus spp.)
during fish sauce fermentation. Journal
of the Science of Food and Agriculture