PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG NẤM Colletotrichum
GÂY BỆNH THÁN THƯ CÀ PHÊ Ở VIỆT NAM
DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI HỌC VÀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TỬ
Nguyn Thanh Hà, Hoàng Th Ngát, Nguyn Thu
Hà,
Lê Th Ánh Hng và Phm Xuân Hi
Summary
Isolation and identification of Colletotrichum caused anthracnose disease on coffee
in Vietnam based on morphological and molecular characters
The genus Colletotrichum consists of 900 species and is responsible for anthracnose on number of
crops. To determine which species of Colletotrichum are present in Vietnamese coffee plantation, a
total of 55 Colletotrichum isolates were isolated from 111 anthracnose disease samples on leaves,
twigs and berries at coffee plantation of Ba Vi and Buon Me Thuot. Twenty eight isolates from coffee
berry diseases were selected for identification based on morphological characters and PCR
amplification of a region in the mitochondrial small subunit (mtSSU) using NMS1/NMS2 primers.
Basing on morphological and physiological studies, we classified these isolates into three groups
named group 1, group 2 and group 3 corresponding to C. gloeosporioides, C. acutatum and possible
C. capsici respectively. In combining with molecular analysis, we reconfirmed with group 1 and group
2 but not with group 3. The group 3 with falcate conidia was found on coffee plantation of Ba Vi.
However, it was unable to identify by NMS1/NMS2 primers. Since, different techniques supposed to
be address to identify these isolates.
Keywords: Anthracnose, Colletotrichum, Coffee berry, PCR, Identification.

I. T VN 
Chi Colletotrichum bao gm hơn 900
loài, có ph ký ch rng, là nguyên nhân
gây bnh thán thư trên nhiu loài cây trng
khác nhau. Tuy nhiên, hin nay trên th
gii ch phân lp ưc 3 loài:
Colletotrichum kahawae, C. gloeosporioides
và C. acutatum t các mu bnh cà phê. Loài

NGHIÊN CU
1. Vật liệu nghiên cứu
- Mu bnh: 111 mu bnh thán thư
trên thân, lá và qu ưc thu thp t năm
2006 n năm 2007. Trong s mu thu
thp, 90 mu bnh thu t 8 tiu vùng
trng cà phê ti hai xã Sơn à và Tn
Lĩnh thuc Trung tâm Nghiên cu Cà phê
chè Ba Vì và 21 mu bnh còn li thu ti
Tri Cà phê thuc Vin KHKT Nông Lâm
Tây Nguyên.
- Mu i chng: Isolate C. gloeosporioides
PR220 phân lp t Olea Europaea (M) và
isolate C. acutatum 397 phân lp t
Fragaria x Ananssa (M).
2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Phân lập các mẫu nấm
Colletotrichum
Mu bnh ưc ra dưi vòi nưc
chy cho trôi ht t và cht bNn. Sau ó
mu ưc kh trùng bng NaOCl 1% trong
5 phút, tráng bng cn 70%, ra bng nưc
ct 3 ln và thm khô bng giy thm. Ct
mu cy vi kích thưc 0,5 - 0,7 mm ti
mép vùng b bnh (bao gm c vùng bnh
và vùng không bnh) và t mu cy lên
ĩa môi trưng PDA có cha kháng sinh
Streptomycin (100 g/ml) (10 mu
cy/ĩa).   nhit  22
0

C  trong 3 ngày. Chúng tôi
thu sinh khi và tin hành tách chit ADN
ca nm da trên phương pháp ca J.L.
Cenis (1992) [5].
2.5. Phản ứng PCR đặc hiệu
S dng cp mi NMS1 (CAGCAGT
GAGGAATATTGGTCAATG)/NMS2 (GC
GGATCATCGAATTAAATAACAT)  nhân
on ADN c hiu vùng tiu ti th (mtSSU)
cho mi loài nm Colletotrichum [2,10].
Các chng nm Colletotrichum ưc
nhn dng bng phn ng PCR vi vic
s dng cp mi NMS1/NMS2 và si
khuôn là ADN tng s ca các chng
nm. Phn ng PCR ưc thc hin trong
hn hp phn ng th tích 25 l cha 1 l
ADN ca nm (20 - 30 ng), 2,5 l dung
môi phn ng 10X, 0,2 mM dNTP, 2 mM
MgCl
2
, 1 mM ca mi primer, 1U Taq
polymerase (Promeaga). Chương trình
chy phn ng PCR: ưc bt u  95
0
C
trong 3 phút; 35 chu kỳ, mi chu kỳ ưc
thit lp như sau: 95
0
C trong 1’, 50
0

Quả Cành Lá Tổng số
Ba Vì 90 35 5 10 50
Buôn Mê Thuột 21 2 0 3 5

Thit hi do bnh thán thư gây ra ch
yu t các mu bnh trên qu. Vì vy chúng
tôi chn các isolate phân lp t qu  phc
v cho các nghiên cu tip theo.
2. hận dạng nấm
2.1. hận dạng nấm dựa vào đặc điểm
hình thái học
Các isolate Colletotrichum nghiên
cu có c im hình thái và sinh lý rt
a dng. im d phân bit nht là c
im bào t ca các isolate ưc chia
thành 3 nhóm vi hình thái khác nhau.
Nhóm 1 bao gm 26 isolate có bào t
hình tr thng, hai u tròn, hoc nhn
mt u; nhóm 2 gm 01 isolate có bào
t hình thuôn mnh, nhn hai u
(isolate BMTQ18) và nhóm 3 là isolate
vi bào t có hình lưi lim (isolate
BV8.80b) (hình 2).

Hình 2. Hình thái bào tử nấm Colletotrichum: (a) hóm 1; (b) hóm 2; (c) hóm 3
Kích thưc bào t cũng là mt ch tiêu
quan trng  phân loi các chng nm
Colletotrichum. Kích thưc bào t rt a dng
dao ng t 12,38 - 25,26 x 3,53 - 7,46 (m),
a b c

bông, trng bNn, trng xám, xám, ), n
dng si nm (bông xp, chc mn ) và
mép khuNn lc phát trin u hoc không
u (hình 4).
 nhit  25
0
C, các isolate
Colletotrichum phân lp ưc có tc 
phát trin dao ng t 4,45 mm/ngày n
7,13 mm/ngày. Trong khi hu ht các
isolate bào t dng 1 có tc  phát trin
khuNn lc ln hơn 5,5 mm/ngày thì isolate
có bào t thuc dng 2 và dng 3
(BV8.80b) có tc  phát trin < 5
mm/ngày, tương ng là 4,45 ± 0,52
mm/ngày và 4,72 ± 0,00 mm/ngày (hình
5). Theo nghiên cu ca Olga [11] và
Kenny [7] thì loài C. acutatum có tc 
phát trin ca khuNn lc < 5 mm/ngày,
còn C. gloeosporioides có tc  phát
trin khuNn lc > 5 mm/ngày.

Nhóm tỷ lệ chiều dài/chiều rộng
Nhóm
1
Nhóm
2
Nhóm
3
Nhóm

n
lạc của nấm Colletotrichum:
(a) BMTQ18; (b) BV6.49; (c) BV6.50;
(d) BV4.24 (4); (e) BV1.6; (f) BV3.20 (1)

Hình 5.
So sánh t
ốc độ phát triển của khun lạc
tại nhiệt độ 25
0
C

2.2. hận dạng nấm dựa vào phản
ứng PCR
Kt qu chy PCR cho thy tt c các
phn ng PCR s dng si khuôn là các ADN
tng s isolate Colletotrichum u cho sn
phNm PCR là các băng ADN c hiu có chiu
dài trùng vi chiu dài ca C. gloeosporioides
i chng (750 bpp), tr isolate BMTQ18 có
sn phNm PCR là các băng ADN c hiu có
chiu dài trùng vi chiu dài ca isolate
C. acutatum i chng (650 bp) (hình 6).
Kt hp kt qu nghiên cu nhn dng
nm Colletotrichum qua các ch tiêu hình
thái và phương pháp phân t thông qua
phn ng PCR s dng cp mi
N MS1/N MS2 cho phép chúng tôi kt lun
các isolate có bào t thuc nhóm 1 là loài
C. gloeosporioides và isolate có bào t

Kim Loang ã phân lp ưc loài này trên cà phê ti Tây Nguyên năm 1998 [3]. Có th
gii thích mt nguyên nhân ca iu này là cà phê ưc trng xen cnh nhng cây ch
ca nm C. capsici. ây ang là vn  s ưc quan tâm trong các nghiên cu tip theo
ca chúng tôi.
IV. KT LUN
T 111 mu cà phê b bnh thán thư thu thp ưc ti Ba Vì và Buôn Mê Thut,
chúng tôi ã phân lp ưc 55 isolate Colletotrichum, trong ó chim phn ln t qu cà
phê (37 isolate). Các isolate phân lp t qu cà phê bnh ưc chúng tôi s dng cho các
nghiên cu nhn dng n cp  loài. Bng s kt hp các c im hình thái hc, sinh lý
hc cùng vi kt qu ca phương pháp PCR chúng tôi ã phân loi ưc 26 isolate thuc v
loài C. gloeosporioides, mt isolate t Buôn Mê Thut là loài
C. acutatum, mt isolate thuc vùng Ba Vì ưc gi thit là loài C. capsici. Trong tương
lai, chúng tôi s tip tc nghiên cu sâu hơn v isolate này. Thêm na, chúng tôi còn phi
tin hành ánh giá c tính ca các isolate nm phân lp ưc qua vic lây nhim trên
cây con.

TÀI LIU THAM KHO
1 guyễn Thị Hằng Phương, Lê Thị Ánh Hồng, Jamshid Fatehi và Olga Vinnere, 2003.
Phân loi mt s loài thuc chi Colletotrichum thu thp t Vit Nam và Thái Lan.
Hi ngh công ngh sinh hc toàn quc 2003. 358 - 363.
2 Trần Kim Loang và cộng sự, 1998. Kt qu nghiên cu bnh khô cành, khô qu trên
cà phê chè catimor. Tp chí Khoa hc, Công ngh và Qun lý kinh t s 6, 253 - 255.
3 Gina M. Sander và Korsten. L., 2003). A comparative morphological study of South
African avocado and mango isolates of Colletotrichum gloeosporioides. Can. J. Bot. 81,
877 - 885.
4 Kenny, M. K., Galea, V.J., Scott, P.T. và Price, T.V, 2006. A comparison of
Colletotrichum species associated with berry diseases of Coffea arabica L. Pest and
disease incursions: Risks, threats and management in Papua New Guinea. Canberra,
ACIAR Technical Reports No.62, 192 - 199.
5 Sreenivasaprasad, S.; Averil E. Brown và Mills, P.R., 1993. Coffee berry disease