BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

TRẦN THỊ NGỌC HÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT
TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM LINH CHI (GANODERMA
MASTOPORUM (LEV.)PAT.)
Ở NGHỆ AN
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC VINH, 2014
LỜI CẢM ƠN

Luận văn được thực hiện tại phòng thí nghiệm chuyên đề Hoá hữu cơ - khoa
Hoá, Trung tâm Kiểm định An toàn Thực phẩm và Môi trường, Trường Đại học
Vinh, Viện Hàn Lâm - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS. TS Trần
Đình Thắng – Phó trưởng khoa Hoá học, Trường Đại học Vinh đã giao đề tài, tận
tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện trong suốt quá trình thực hiện luận văn.

Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Chi Ganoderma (Linh chi) 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm Linh chi 3
1.1.2. Các hợp chất có hoạt tính sinh học đuợc phân lập từ Ganoderma lucidum 4
1.1.2.1. Những dẫn xuất tritecpenoit từ lanosterol 5
1.1.2.2. Các polisaccarit trong Gannoderma lucidum 17
1.1.2.3. Peptit và protein 22
1.1.3. Các chất có hoạt tính sinh học được phân lập từ các loài khác của chi
Ganoderma 24
1.2. Ganoderma mastoporum 29
1.2.1. Đặc điểm hình thái 29
1.2.2. Thành phần hóa học của Ganoderma mastoporum 30
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 31
2.1. Phương pháp nghiên cứu 31
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu 31
2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất
31
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 31

4
2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 32
2.2.1. Hóa chất 32
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị 32
2.3. Nghiên cứu các hợp chất 32
2.3.1. Thu mẫu 32
2.3.2. Phân lập các hợp chất 32
2.3.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm 35
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36
3.1. Phân lâp các hợp chất 36
3.2. Xác định hợp chất A 36
6

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

Bảng 3.1: Số liệu phổ
13
C – NMR của chất A 38
Bảng 3.2: Số liệu phổ
13
C – NMR của chất B 55
Bảng 3.3: Số liệu phổ của hợp chất C 66
Bảng 3.4: Số liệu phổ của hợp chất D 72
Bảng 3.5: Tác dụng ức chế của các hợp chất được tách từ G. mastoporum sản sinh

Hình 3.21: Phổ COSY của hợp chất A 54
Hình 3.22 : Phổ khối lượng (EI-MS) chất B 57
Hình 3.23 : Phổ
1
H-NMR của hơp chất B 58
Hình 3.24 : Phổ
1
H-NMR của hơp chất B (phổ dãn) 58
Hình 3.25 Phổ
13
C-NMR của hơp chất B 59
Hình 3.26 : Phổ
13
C-NMR của hơp chất B (phổ dãn) 59
Hình 3.27 : Phổ DEPT của hơp chất B 60

8
Hình 3.28 : Phổ DEPT của hơp chất B (phổ dãn) 60
Hình 3.29 : Phổ HMBC của hợp chất B 61
Hình 3.29 : Phổ HMBC của hợp chất B 62
Hình 3.31 : Phổ HMBC của hơp chất B (phổ dãn) 63
Hình 3.32 : Phổ HSQC của hợp chất B 64
Hình 3.33 : Phổ HSQC của hợp chất B (phổ dãn) 65
Hình 3.34 : Phổ
1
H-NMR của hợp chất C 68
Hình 3.35 : Phổ
1
H-NMR của hợp chất C (phổ dãn) 69
Hình 3.36 : Phổ

Hình 3.51: Phổ HMBC của hợp chất D (phổ dãn) 81

9
Hình 3.52: Phổ HMBC của hợp chất D (phổ dãn) 82
Hình 3.53: Phổ HMBC của hợp chất D (phổ dãn) 83
Hình 3.54: Phổ HSQC của hợp chất D 84
Hình 3.55: Phổ HSQC của hợp chất D (phổ dãn) 85
Hình 3.56: Phổ HSQC của hợp chất D (phổ dãn) 86
Hình 3.57: Phổ COSY của hợp chất D 87
Hình 3.58: Phổ COSY của hợp chất D (phổ dãn) 88
Hình 3.59: Phổ COSY của hợp chất D (phổ dãn) 89
Sơ đồ 2.1: Chiết cao metanol của quả thể nấm Ganoderma matoporum 33
Sơ đồ 2.2: Phân lập các hợp chất trong cao etylaxetat 34

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
CC: Column Chromatography (Sắc kí cột)
FC: Flash Chromatography (Sắc ký cột nhanh)
TLC: Thin Layer Chromatography (Sắc kí lớp mỏng)
IR: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)
MS: Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)
EI-MS: Electron Impact-Mass Spectroscopy (Phổ khối va chạm electron)
1
H-NMR: Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt
nhân proton)

10
13

ho, tăng huyết áp, làm thuốc an thần, bổ gan, dưỡng tim, tăng cường trí nhớ, trị đau
nhức xương khớp, làm da tươi trẻ, kéo dài tuổi thọ,…[5].
Ngày nay, các sản phẩm có nguồn gốc từ Linh chi cũng rất được mọi người
quan tâm và sử dụng như các sản phẩm chức năng: tăng cường chức năng giải độc
gan, chống chất oxy hóa, chống ung thư,… các sản phẩm này mỗi năm thu về
khoảng 5 đến 6 tỉ đô la mỗi năm [10].
Hiện nay các nhà khoa học đã phát hiện thêm nhiều loài Linh chi có những
đặc tính quý, rất tốt cho phòng và chữa bệnh. Các sản phẩm từ nấm Linh chi
(Ganoderma) được dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan, bệnh về
đường tiết niệu, tim mạch, ung thư, AIDS [1, 2, 4, 6]. Trong dịch chiết metanol,
hexan, etyl axetat của quả thể Ganoderma lucidum có các hợp chất như có hoạt tính
kháng vi rút. Chúng có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi rút
HIV [6]. Các hoạt chất từ Ganoderma applanatum có tác dụng chống khối u cao
[2], chúng được sử dụng trong điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung thư
dạ dày [1]. Các dẫn xuất adenosine có trong G.capense và G. amboinense có tác
dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu [3].
Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần và các chất có hoạt tính sinh học của
các loài nấm Linh chi thuộc chi Ganoderma. Tuy nhiên còn rất ít nghiên cứu về
thành phần và hoạt tính sinh học của loài Ganoderma mastoporum. Chính vì vậy,
chúng tôi chọn đề tài : "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của nấm linh chi (Ganoderma mastoporum (Lev.) Pat.) ở Nghệ An"
2. Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Ganoderma mastoporum

12
- Tách được chất có hoạt tính sinh học
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp
chất từ Ganoderma mastoporum.
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ quả thể của Ganoderma

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Chi Ganoderma (Linh chi)
1.1.1. Đặc điểm hình thái cơ bản và phân loại nấm Linh chi
Các loại nấm thuộc chi Ganoderma (đặc biệt là G. lucidum), đã được biết
đến và sử dụng từ thời cổ đại trong y học cổ truyền phương Đông cho đến ngày
nay trong việc điều trị và phòng ngừa một số bệnh như ung thư, cao huyết áp,
viêm phế quản mãn tính và bệnh hen suyễn, nó còn là một thành phần quan trọng
trong công thức của các thuốc bổ và thuốc an thần [42]. Gần đây, các chế phẩm
khác được làm từ sợi nấm, quả thể và bào tử của G. lucidum đã có trên thị trường
như thực phẩm chức năng, bổ sung vào chế độ ăn uống để kháng khối u, điều hòa
hệ miễn dịch và khả năng thu gom các gốc tự do [56, 84, 89]. Thị trường thực
phẩm chức năng làm từ G. lucidum được ước tính thu được khoảng 5 đến 6 tỷ
USD mỗi năm, trong đó mức tiêu thụ tại Hoa Kỳ là 1,6 tỷ USD [99]. Ngoài G.
lucidum, một số loài khác thuộc chi này đã được tìm ra và chứng minh là có tác
dụng hữu ích đối với sức khỏe con người, như: G. tsugae, G. applanatum, G.
colossum, G. concinna, G. pfeifferi và G. taan -japonicum [11, 42, 99, 24, 27, 39,
60].
Điểm đặc biệt chỉ có ở nhóm nấm này là màng bào tử đảm 2 lớp - một dấu
hiệu di truyền nổi bật, cho nên nhiều nhà khoa học đã đề nghị xếp chúng thành một
họ độc lập là họ Linh chi (Ganodermataceae Donk). Theo Donk (1993) họ
Ganodermataceae thuộc bộ nấm lỗ (Alphyllophoral), ngành nấm đảm
(Basimydiomycet), giới nấm (Mycetalia).
Nấm Linh chi (thường là thuộc bộ Fabale) có thể mọc trên cây gỗ sống hay
đã chết. Quả thể gặp rộ vào mùa mưa (từ tháng 5 -11), có thể mọc trên thân cây,
quanh gốc cây hoặc từ các rễ cây, nơi sống thích hợp của nấm là nơi bóng râm, ánh
sáng khuếch tán nhẹ với nhiệt độ ôn hoà. Nên chúng hay sống ở các vùng núi đồi

14
cao trên 1000m so với mực nước biển, thích hợp nhiệt độ thấp từ 21- 26

15
bạch cầu, xơ vữa động mạch, bệnh trĩ, mệt mỏi mãn tính, mất ngủ và chóng mặt do
suy nhược thần kinh, ngoài ra còn bệnh viêm phế quản và tăng huyết áp [12, 23,
26, 31, 54, 73, 96].
Tính đa dạng đáng ngạc nhiên này là do số lượng lớn các hợp chất có hoạt
tính sinh học được phân lập từ loại nấm này. Nhìn chung, hầu hết các chất chuyển
hóa có hoạt tính sinh học trong G. lucidum đã báo cáo rơi vào hai nhóm chính:
những chất có nguồn gốc từ lanosterol (chủ yếu là axit ganoderic và các hợp chất
có liên quan) và các polisaccarit [19, 66]. Tuy nhiên, cũng có những báo cáo về
các peptit phân tử khối thấp và các protein [76, 79, 81]. Các báo cáo này đã chỉ ra
rằng dịch chiết của G. lucidum đặc biệt có hiệu quả trong việc ức chế sự phát triển
của sarcoma, trong khi trong dịch chiết không phân cực không có, mặc dù sau này
hoạt tính nổi trội đó là chống sự peoxi hóa lipit cũng như thu gom các gốc tự do
hydroxyl và supeoxit [35, 54].
1.1.2.1. Những dẫn xuất tritecpenoit từ lanosterol: Tritecpenoit bắt nguồn từ
lanosterol (axit ganoderic và các hợp chất liên quan)
Từ các phân đoạn không phân cực của dịch chiết G. lucidum, có hơn 130
tritecpenoit khác nhau đã được phân lập. Tất cả đều là dẫn xuất lanosterol chống
oxy hoá cao có hoạt tính dược lý như có khả năng ức chế sự phát triển ung thư và
sự di căn bằng cách điều khiển hệ miễn dịch, gây bắt giữ chu kỳ tế bào, và kích
hoạt apoptosis được gọi là axit ganoderic, ganoderiol, axit ganolucidic, lucidon và
axit lucidenic [19].
Hình 1.1: Một số chất chuyển hóa được phân lập từ G.lucidum

R5
R3
R4
R7
R8
R6

2524
-Me
-COOH
8
α-OH
α-OAc
-H
-H
2524
-Me
-COOH
9
β-OH
-H
-H
-H
2524
-Me
-COOH
11
β-OAc

-COOH
14
α-Oac
α-OH
-H
=O
2524
-Me
-COOH
15
α-Oac
α-OH
β-Oac
-H
2524
-Me
-COOH
19
β-OH
-H
-H
-H
α-OH
-OH

-
CH
2
OH
-CH
2
OH
22
=O
-H
-H
-H
α-OH

-
CH
2
OH
-Me
31
β-OH
-H
-H
-H
2524
-Me
-CH

-H
α-OH
-OH
-Me
-Me
52
β-OH
-H
-H
-H
2524
-
CH
2
OH
-CH
2
OH
60
=O
-H
-H
-H
2524

-H
2524
-CHO
-COOH

17
71
=O
α-OH
-H
-H
2524
-Me
-Me
72
-OH
-H
-H
-OH
2524
COOH

-H
-COOMe
53
=O
β-OH
-H
=O
2120


-COOH
54
=O
β-OH
-H
=O
2120


-COOMe
55
=O
=O
β-OAc
=O
-OH
-COOH
56
=O
=O

-H
-COOH
78
β-OH
β-OH
-H
=O
-H
-COOBu
79
=O
β-OH
-H
=O
-H
-COOBu R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R318



-H
-H
2322


26
β-OH
-H
α-OH
β-OMe
47


-H
-H
2322


27
=O
-H
-H
-H
47


-H
-H
2322


54


54


76


76


76


148


-H
2322


74
=O
148


α-OH
2322

El-Mekkawy và các cộng sự (1998) đã báo cáo về sự phân lập 13 chất
chuyển hóa từ G. lucidum, đã xác định được là axit ganoderic α (16), A (3), B (4),
C1 (17) và H (18); ganoderiol A (19 ), B (20) và F (21); ganodermanontriol (22),
ergosterol (23), ergosterol peoxit (24), cerevisterol (25) và 3β-5α-dihydroxi-6β-
metoxyergosta-7,22-dien (26). Nhóm nghiên cứu này cũng đã tìm thấy ganoderiol
F, ganodermanontriol và các chất thấp hơn axit ganoderic B, C,α và H, ganoderiol
A và B, cũng như 3

-5α -dihydroxi-6b-metoxyergosta-7, 22-dien, cho thấy hoạt
tính kháng vi rút chống lại vi rút HIV-1[22].
Một năm sau González và các cộng sự (1999), báo cáo về sự cô lập được
ergosta-7, 22-dien-3-on (27); ergosta-5, 7-dien-3β-ol, (28) fungisterol (29);
ergosterol (23), ergosterol peoxit (24), ergosta-4, 6, 8 (14), 22-tetraen-3-on (30),
ganodermadiol (31), ganodermenonol (32); axit ganoderic DM (33), lucidadiol (34)
và lucidal (35) từ G. lucidum[29].
Một báo cáo khác đã được thực hiện bởi Min và các cộng sự (2000), về quá
trình phân lập axit ganoderic γ (36), δ (37), ε (38), ζ (39), η (40) và θ (41), ngoài
ganolucidic axit D (42) và C2 (43) từ các bào tử của G. lucidum, cũng như hoạt
tính gây độc tế bào của chúng chống lại các dòng tế bào khối u Meth-A và
LLC[58].
Wu và các cộng sự (2001) đã phân lập được axit lucidenic A, C, N (51),
lucidolacton, metyl lucidenat F (52) và axit ganoderic E (53) từ quả thể khô của G.
lucidum[91]. Axit lucidenic A và N, và axit ganoderic E cho thấy hoạt tính gây độc
tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư gan G2, viêm gan G2.2.15 và P-388. Gao
và cộng sự (2002) đã cô lập được 3 dẫn xuất lanosterol từ quả thể của G. lucidum,
được gọi là luciandehit A (54), B (55) và C [26], trước đây nó được González và
cộng sự (1999) [29] gọi là lucidal (35). Nhóm nghiên cứu này cũng báo cáo tìm
thấy ganodermanonol (32), ganodermadiol (31), ganodermanondiol (49),
ganodermanontriol (22), axit ganoderic A (3), axit ganoderic B8 (50) và axit
ganoderic C1 (17). Luciandehit B và C (hoặc lucidal), cũng như ganodermanonol

R9
R10
R11
3
=O
β-OH
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
=O
-H
COOH
-Me
4
β-OH
β-OH
=O
-H
=O
α-Me
-H
=O
-H
COOH
-Me
5
α-OH
α-OH

-H
Α-
OAc
α-Me
-H
-H
2526


-Me
-COOH
10
β-OH
-H
-H
-H
-H
α-Me
-H
-H
2526


-Me
-COOH
16
β-OH
=O
=O
β-OAc

-H
=O
2526


COOH
-Me
33
=O
=O
-H
-H
-H
α-Me
-H
-H
2526


-Me
-COOH
34
β-OH
=O
-H
-H
-H
α-Me
-H
-H


-Me
-COOH

21
37
=O
α-OH
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
β-OH
2526


-Me
-COOH
38
β-OH
β-OH
=O
-H
=O
α-Me
-H
β-OH
2526


-COOH
41
β-OH
=O
=O
β-OH
=O
α-Me
-H
β-OH
2526


-Me
-COOH
42
=O
-H
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
β-OH
2526


-Me
-COOH
43

-H
=O
-H
COOH
-Me
49
=O
α-OH
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
-H
2526


-H
-CHO
50
=O
α-OH
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
=O
-H
-Me

=O
α-OH
-H
=O
-H
-Me
-COOH
65
=O
=O
=O
-H
=O
α-Me
-H
=O
2526


-Me
-COOH
66
β-OH
=O
=O
β-OAc
=O
α-Me
2220


β-OH
β-OH
=O
-H
=O
α-Me
-H
=O
-H
-Me
COOBu
81
β-OH
β-OH
=O
β-Oac
=O
α-Me
-H
=O
-H
COOH
COOBu
82
=O
=O
=O
β-Oac
=O
α-Me

β-OH
=O
=O
-H
α-OH
α-Me
-H
=O
-H
COOH
-Me
86
β-OAc
β-OH
=O
-H
α-OH
α-Me
-OH
=O
-H
COOH
-Me
87
α-OAc
α-OAc
-H
-H
α-OH
α-Me

COONa
80Akisha và các cộng sự (2005) báo cáo sự xuất hiện của 7 tritecpenoit trong
quả thể của G. lucidum, chúng được xác định là: axit 20 (21)-dehydrolucidenic A
(53), metyl-20 (21)-dehydrolucidenat A (54), axit 20-hydroxilucidenic D2 (55),
axit 20-hydroxilucidenic F (56), axit 20-hydroxilucidenic E2 (57), axit 20-
hydroxilucidenic N (58) và axit 20-hydroxilucidenic P (59) [9].
Trong cùng năm Hajjaj và các cộng sự đã phân lập được ganoderol A (32) và
ganoderol B (31), còn được gọi là ganodermanonol và ganodermadiol tương ứng
(González và các cộng sự 1999), ganoderal A (60) và axit ganoderic Y (9), từ dịch
chiết metanol của G. lucidum[31].
Liu và đồng nghiệp (2006a, 2006b) đã mô tả tác dụng ức chế các enzym 5α-
reductase, gây ra bởi các dẫn xuất lanosterol như axit ganoderic TR (61), DM (33),
A (3), B (4), C2 (62), D (63), I (64) và 5

-lanosta-7, 9 (11), 24-trien-15

,26-
dihydroxi-3-on (120). Các nhà nghiên cứu phát hiện thấy các hợp chất với một
nhóm cacbonyl ở C-3 và một nhóm cacbonyl α, β không bão hòa ở C-26, thể hiện

O
OH
O
24O

23-tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oat (81). Cả hai hợp chất này đều thể hiện hoạt tính
chống axetylcolinesterase [43-45].
Ngoài ra, Cole và Schweikert (2003) đã báo cáo một số chất chuyển hóa
khác được phân lập từ quả thể, bào tử và sợi nấm của G. lucidum, như axit

24
ganoderic E (46), F (82), G (83), J (84), K (85), L (86), Ma (87) và U (88), trong số
nhiều chất khác (Hình 1.1 và 1.2) [19].
Hình 1.3: Các chất chuyển hóa đã được phân lập từ các loài khác của chi
Ganoderma CH
2
OH
CH
2
OH
HOH
HOH
OHH
OHH
OH
O
O
89
90

R1
R2
R3
R4
R5
93
-Me
-OH
-H
-H
-OH
94
-OH
-OH
-H
-H
-OH
95
-H
-H
-OH
-OH
-H
25

R1
R2

O
OH
O
O
OH
O
OH
O OH
97OH
O
O
R3
O
O
O
R1
R2