BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH
TRƢƠNG MINH VŨ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN
TRONG MÁU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ
KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH SINH HÓA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nghệ An, 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH


giảng viên đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nơi tôi đang công tác
và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện hoàn thành luận văn này. MỤC LỤC
Lời cảm ơn Trang
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục hình vẽ, đồ thị, phổ đồ, phiếu xét nghiệm
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Giới thiệu về cồn (ethanol) 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện 3
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4
1.1.2.1. Cấu tạo: 4
1.1.2.2. Tính chất vật lý: 4
1.1.2.3. Tính chất hóa học: 4
1.2. Giới thiệu về máu 6
1.2.1. Sơ lược về máu 6
1.2.2. Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu 6
1.3. Một số phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ethanol trong máu 7
1.3.1. Phương pháp xét nghiệm sinh hóa: 7
1.3.1.1. Nguyên lý: 7
1.3.1.2. Thu mẫu: 7
1.3.1.3. Tiến hành xét nghiệm: 7
1.3.1.4. Xuất kết quả: 7
1.3.2. Phương pháp sắc ký khí 8

1.5.2.2. Phương pháp nội chuẩn: 21
1.6. Phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn và Phƣơng pháp một điểm
chuẩn 22
1.6.1. Phương pháp xây dựng đường chuẩn: 22
1.6.1.1. Khoảng tuyến tính và cách xác định: 22
1.6.1.2. Các phương pháp xây dựng đường chuẩn: 23
1.6.1.3. Các lưu ý: 25
1.6.2. Phương pháp một điểm chuẩn: 27
1.7. Phƣơng pháp khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn
định lƣợng (LOQ) 27
1.7.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 27
1.7.1.1. Định nghĩa: 27
1.7.1.2. Cách xác định: 27
1.7.2. Giới hạn định lượng: 28
1.7.2.1. Định nghĩa: 28
1.7.2.2. Cách xác định: 29
1.8. Phƣơng pháp khảo sát độ lập lại 29
1.9. Phƣơng pháp khảo sát hiệu suất thu hồi 30
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 32
2.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32
2.1.1. Dụng cụ: 32
2.1.2. Thiết bị: 32
2.2. Hóa chất 32
2.3. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu, khảo sát bằng máy sắc ký khí 33
2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu: 33
2.3.1.1. Dung dịch natri tungstat: 120g/l: 33
2.3.1.2. Dung dịch axit sulfuric 5%: 33
2.3.1.3. Dung dịch propanol 0,25g/l: 33
2.3.1.4. Các dung dịch ethanol: 33
2.3.1.5. Dung dịch máu có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu 33

PHỤ LỤC 54-87
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
- ĐC : Đường chuẩn
- C : Nồng độ
- C
PP
: Nồng độ theo phương pháp
- FID : Đầu dò ion hóa ngọn lửa
- GC : Sắc ký khí
- H : Hiệu suất thu hồi
- LOD : Giới hạn phát hiện
- LOQ : Giới hạn định lượng
- MS : Đầu dò khối phổ
- PP : Phương pháp
- RSD : Độ lệch chuẩn tương đối
- SD : Độ lệch chuẩn
- S/N : Tỷ lệ chiều cao tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu đường nền
- S
c
/S
nc
: Tỷ lệ diện tích chất chuẩn chia cho nội chuẩn
- S
m
/S
nc
: Tỷ lệ diện tích chất phân tích chia cho nội chuẩn
-

,

và độ sai lệch giữa phương
pháp đường chuẩn (PP 1) và phương pháp một điểm chuẩn
- Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi (H%)
- Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của thiết bị
- Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp
- Bảng 3.9: Xác định chiều cao của nhiễu đường nền (N) ở nồng độ
4mg/100ml
- Bảng 3.10: Xác định độ lặp lại của chiều cao mẫu chuẩn (S) ở nồng độ
4mg/100ml
- Bảng 3.11: Kết quả phương pháp GC và phương pháp xét nghiệm sinh hóa
- Bảng 3.12: Kết quả các phương pháp bảo quản mẫu ảnh hưởng đến nồng
độ.

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, PHỔ ĐỒ, PHIẾU XÉT NGHIỆM
- Hình 1.1: Thời gian lưu (t
R
) của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ
- Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết
- Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí
- Hình 1.4: Mô tả khoảng tuyến tính và khoảng làm việc
- Hình 1.5: Mô tả cách xác định LOD bằng cách tính S/N
- Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính
- Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1
- Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP 2
- Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3
- Hình 3.4: Đồ thị nồng độ cồn trong máu mẫu M
9
giảm dần theo thời gian và
phương pháp bảo quản
- Phổ đồ 1-93: Các phổ đồ sắc ký khí ở phần phu lục


2
- Nghiên cứu một số phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu.
- Nghiên cứu, khảo sát phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu
bằng sắc ký khí (GC-FID), cụ thể là:
+ Khảo sát một số phương pháp xây dựng đường chuẩn và so sánh
với phương pháp một điểm chuẩn.
+ Khảo sát giới hạn phát hiệnvà giới hạn định lượng.
+ Khảo sát độ ổn định của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp.
+ Khảo sát hiệu suất thu hồi.
- So sánh kết quả xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp
sắc ký khí với phương pháp phân tích sinh hóa.
- Khảo sát một số phương pháp bảo quản mẫu (không bảo quản, bảo
quản lạnh và bảo quản đông đá) và thời gian bảo quản mẫu ảnh hưởng đến
nồng độ cồn trong máu, từ đó rút ra phương pháp bảo quản mẫu hợp lý nhất.

ethanol công nghiệp hiện nay.
1.1.2. Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học
1.1.2.1. Cấu tạo:
Ethanol thường được viết tắt là EtOH, là một ancol mạch thẳng, công
thức hóa học của nó là C
2
H
6
O hay C
2
H
5
OH hay CH
3
-CH
2
-OH. Nhóm metyl
(CH
3
-) liên kết với carbon ở nhóm metylen (-CH
2
-), nhóm này lại liên kết với
oxy của nhóm hydroxyl (-OH), nó là đồng phân hoá học của dimetyl ete.
1.1.2.2. Tính chất vật lý:
Ethanol là một chất lỏng, không màu, trong suốt, có mùi thơm dễ chịu
và đặc trưng, vị cay, nhẹ và dễ bay hơi hơn nước, tan vô hạn trong nước, tan
trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa
có màu xanh da trời.
Sở dĩ ethanol tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so
với este hay aldehyde (2 chất có khối lượng phân tửgần nhau) là do sự tạo

sulfuric đặc nóng tạo ra este.
C
2
H
5
OH + CH
3
COOH  CH
3
COOC
2
H
5
+ H
2
O

5
- Phản ứng loại nước, tách nước trong một phân tử để tạo thành olefin,
trong môi trường acid sulfuric đặc ở 170
0
C.
C
2
H
5
OH  C
2
H
4

+ Mức 1, trong môi trường nhiệt độ cao:
CH
3
-CH
2
-OH + CuO  CH
3
-CHO + Cu + H
2
O
+ Mức 2, có xúc tác:
CH
3
-CH
2
-OH + O
2
 CH
3
-COOH + H
2
O
+ Mức 3, oxi hóa hoàn toàn:
C
2
H
5
OH + 3O
2
 2CO

2
-OH + O
2
 CH
3
-COOH + H
2
O
6
1.2. Giới thiệu về máu
1.2.1. Sơ lƣợc về máu [5]
* Máu chiếm khoảng 7 - 9% khối lượng cơ thể, một người trung bình
có 4 - 5 lít máu (khoảng 75 - 80ml/kg).
- Tỷ trọng toàn phần của máu là 1,050 - 1,060 g/ml.
- Tỷ trọng trung bình của huyết tương là: 1,028 g/ml.
* Máu có 2 thành phần chính là huyết cầu (chiếm khoảng 40%) và
huyết tương (chiếm khoảng 60%).
- Huyết cầu gồm: Hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu
+ Hồng cầu chiếm khoảng 96%, hồng cầu chứa hemoglobin và
có nhiệm vụ chính là vận chuyển và phân phối oxy.
+ Bạch cầu chiếm khoảng 3%, bạch cầu là một phần quan trọng
của hệ miễn dịch có nhiệm vụ tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm trùng và phát
động đáp ứng miễn dịch của cơ thể.
+ Tiểu cầu chiếm khoảng 1%, tiểu cầu chịu trách nhiệm trong

1.3.1.2.Thu mẫu:
- Thu khoảng 3ml máu ở tĩnh mạch.
- Cho vào ống nghiệm có nắp đậy kín.
1.3.1.3. Tiến hành xét nghiệm:
- Ly tâm mẫu máu chứa trong ống nghiệm có nắp đậy kín với tốc độ
1000 vòng/phút.
- Lấy dịch chiết trong (huyết tương) ở lớp trên.
- Tiến hành phân tích dịch chiết và dãy chất chuẩn trên máy xét nghiệm
sinh hóa.
- Máy sẽ tự động tính toán kết quả.
1.3.1.4.Xuất kết quả:

8
- Đơn vị: …….mg/l hoặc ……. mmol/l.
- Hệ số chuyển đổi:
mmol/L x 4,608 = …… mg/100ml.
hoặc mmol/l x 0,04608 = …… g/l.
1.3.2. Phƣơng pháp sắc ký khí [11], [12]
1.3.2.1. Hóa chất, thuốc thử và thiết bị:
- Chuẩn ethanol, nồng độ 50 mg/100ml.
- Nội chuẩn isobutanol, nồng độ: 50mg/100ml (isobutanol hay 2-
methyl-1-propanol, có công thức cấu tạo: (CH
3
)
2
-CH-CH
2
-OH; nhiệt độ sôi t
s


peak ethanol/isobutanol bằng phương pháp tam xuất, theo phương trình (1.1).
X (mg ethanol/100ml máu)
=
C
s

h
x
*
R
s

(1.1)
h
s

R
x

Trong đó:
+ X: là nồng độ ethanol trong mẫu máu (mẫu thử).
+ C
s
: là nồng độ nội chuẩn isobutanol (50mg/100ml).
+ h
x
; R
x
: là chiều cao của peak ethanol trong mẫu máu và mẫu
chuẩn.

- Cột HPB ALC 7mm x 0,320mm.
- Khí mang nitơ, tốc độ dòng 1,5ml/phút.
- Nhiệt độ đầu cột: 250
0
C.
- Detector FID, nhiệt độ: 270
0
C.
- Chương trình nhiệt độ: Bắt đầu 120
0
C giữ 1 phút, tăng nhiệt
5
0
C/phút đến 130
0
C giữ 8 phút.
* Điều kiện Headspace:
- Nhiệt độ nung: 60
0
C, lắc nhẹ.
- Thời gian nung 15 phút.
* Kết quả:
- So sánh thời gian lưu peak của mẫu với chất chuẩn.
- Lập đường chuẩn và tính hàm lượng ethanol trong máu dựa vào
đường chuẩn.
1.3.3.4. Kết quả:
Hàm lượng ethanol trong máu được tính bằng phần trăm (%).

hay vật lý với chất cần phân tích. Trong phương pháp sắc ký khí, dựa vào đầu

12
dò (detector) có thể phân loại thành các kỹ thuật sau:
+ Sắc ký khí đầu dò dẫn nhiệt (GC-TCD).
+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID).
+ Sắc ký khí đầu dò bắt điện tử (GC- ECD).
+ Sắc ký khí đầu dò quang hoá ngọn lửa (GC- FPD).
+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá phát xạ (GC- TID hoặc GC- NPD).
+ Sắc ký khí ghép khối phổ (GC- MS).
1.4.2. Các đại lƣợng cơ bản trong phƣơng pháp sắc ký:
1.4.2.1. Hệ số phân bố:
- Cân bằng của cấu tử trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình
sau:
X
pha động


X
pha tĩnh

- Hằng số cân bằng cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ
số phân
bố (partition coefficient), được tính như sau:
K = C
S
/ C
M
Với C
S

0Hình 1.1: Thời gian lưu (t
R
) của cấu tử phân tích trên sắc ký đồ.
1.4.2.3. Hệ số dung lượng:
Được định nghĩa theo công thức sau:
K’ =
C
S

V
S
C
M
V
M

Với V
S
, C
S
: thể tích và nồng độ pha tĩnh; V
M
, C
M
: thể tích và nồng độ
pha động; K’ là đại lượng quan trọng nhất trong sắc ký và được đo bằng thực
nghiệm, có thể tính theo công thức:


Với W
b
: bề rộng đáy của mũi sắc ký; W
1/2
: bề rộng đáy của mũi sắc ký
ở phân nữa chiều cao.

Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết.
Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng W
b
càng nhỏ thì mũi sắc ký càng
nhọn.
Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng
tách của cột càng cao.
1.4.2.5. Độ chọn lọc:
Độ chọn lọc α là đại lượng biễu diễn sự khác nhau của các mũi kề nhau
trong 1 hệ sắc ký đã chọn. Khi α càng khác 1 thì sự tách của hai chất càng rõ.
Độ chọn lọc α thay đổi theo sự thay đổi của thành phần pha động và
pha tĩnh.

15

1.4.2.6. Độ phân giải:
Độ phân giải (R
S
) được dùng để đánh giá khả năng tách hai mũi sắc ký
gầnnhau.

Với: t