ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
VŨ HẢI SƠN Tên đề tài:
SÀNG LỌC VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME NGOẠI BÀO ĐƯỢC PHÂN LẬP
TỪ RỪNG QUỐC GIA BA VÌ VÀ VƯỜN QUỐC GIA BIDOUP
NÚI BÀ CỦA VIỆT NAM
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy
Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Khoa : Công nghệ Sinh học - Công nghệ Thực phẩm
Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
VŨ HẢI SƠN

các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đã ân
cần dạy dỗ, truyền đạt kiến thức chuyên môn cũng như kinh nghiệm trong
cuộc sống.
Từ đáy lòng mình, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, người thân và
bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ để tôi có được nền tảng đạo đức và kiến
thức vô giá.

Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2014
Sinh viên VŨ HẢI SƠN
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1. Đặt vấn đề 1

1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3. Mục đích nghiên cứu 2

1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1. Enzyme ngoại bào 3

2.1.1. Laccase 3



3.2.2. Sàng lọc vi khuẩn sinh laccase ngoại bào 19

3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện môi trường đến khả
năng sinh trưởng và sinh laccase của chủng BBV11 20

3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy 20

3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ CuSO
4
20

3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 20

3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường ban đầu 21

3.4. Nghiên cứu khả năng loại màu thuốc nhuộmcủa chủng BBV11 21

3.4.1. Phân loại theo phương pháp truyền thống 21

3.4.2. Phân loại bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã
hóa 16S rRNA 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

4.1. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng sinh một hoặc một số
enzyme ngoại bào 24

4.1.1. Khả năng sinh protease, chitinase, cellulase 24


Trang
Hình 2.1 Cấu trúc không gian của phân tử laccase 5

Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng BBV11 trên môi trường PDA-M
không bổ sung (A) và có bổ sung guaiacol (B) 26

Hình 4.2 Hoạt tính laccase của 3 chủng vi khuẩn BBV11, BBD9 và
BBD38 27

Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc (A) và hình thái tế bào được quan sát dưới
kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 13000 lần (B) 28

Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO
4
đến khả năng sinh laccase của
chủng BBV11 30

Hình 4.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh laccase của chủng BBV11 32

Hình 4.6 Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh laccase 33

Hình 4.7 Hiệu quả loại màu và khả năng sinh laccase của chủng BBV11
sau 6 ngày nuôi 34

Hình 4.8 Màu Dimaren Black CLS tại thời điểm ban đầu (A) và sau 6
ngày nuôi (B) 34

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase 4

PHẦN 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong thế kỷ XXI, Các lĩnh vực sản xuất công nghiệp vẫn là xương sống
của hầu hết quốc gia trên Thế giới. Hiện nay ở Việt Nam, sự gia tăng dân số
vượt ngưỡng 90 triệu người là cơ hội và cũng là thách thức không nhỏ. Được
thiên nhiên ưu đãi với nguồn tài nguyên, thiên nhiên phong phú, sự phát triển
nhanh chóng của công nghiệp đang đem lại lợi ích không thể phủ nhận. Tuy
nhiên, cùng với sự phát triển đó thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm nghiêm
trọng do những chất thải công nghiệp gây ra. Môi trường đất và nước ở nhiều
đô thị, khu công nghiệp và làng nghề bị ô nhiễm do thiếu các công trình, thiết
bị và biện pháp xử lý chất thải hiệu quả. Mỗi ngành công nghiệp khác nhau
lại tạo ra nguồn ô nhiễm và gây ô nhiễm môi trường đất, nước, không khí ở
những mức độ khác nhau. Tùy vào loại và mức độ ô nhiễm mà có những biện
pháp xử lý riêng biệt. Tuy nhiên, có một số phương pháp xử lý ô nhiễm chính
là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và sự kết
hợp của các phương pháp này. So với phương pháp vật lý và phương pháp
hóa học thì phương pháp xứ lý ô nhiễm môi trường bằng sinh học sử dụng vi
sinh vật đã và đang được đặc biệt quan tâm do lợi ích về mặt kinh tế và thân
thiện với môi trường mà phương pháp này đem lại.
Vi sinh vật được sử dụng trong xử lý bao gồm nấm, xạ khuẩn và vi
khuẩn sinh enzyme ngoại bào có khả năng chuyển hóa và phân hủy các hợp
chất hữu cơ khó phân hủy. Trong số các enzyme ngoại bào laccase, chitinase,
cellulase, protease đã và đang được quan tâm nghiên cứu trên thế giới cũng
như ở Việt Nam do khả năng những ứng dụng của chúng trong nhiều lĩnh
vực. Đặc biệt, laccase có phổ cơ chất rộng và được ứng dụng trong công nghệ
sinh học môi trường (phân hủy các chất vòng thơm, loại màu thuốc nhuộm
v.v.), công nghệ thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Vi khuẩn Bacillus được tìm thấy nhiều trong tự nhiên, được nghiên cứu
và ứng dụng rộng rãi do chúng có khả năng sinh bào tử, sinh trưởng trong
những điều kiện khắc nghiệt và khả năng sinh một số enzyme ngoại bào đề
3
PHẦN 2:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme ngoại bào
2.1.1. Laccase
 Giới thiệu về laccase
Laccase (p-benzenediol: oxygen oxyreductase, E.C.1.10.3.2) là một
polyphenol enzyme thuộc nhóm enzyme oxy hóa. Trong phân tử có 4 nguyên
tử đồng có khả năng oxy hóa các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm và sử dụng
phân tử oxy làm chất nhận điện tử. Khác với phần lớn các enzyme, laccase có
phổ cơ chất khá đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫn xuất phenol,
diamine, amine thơm, benzenthiol, polychlorinated biphenyl (PBC), dioxin và
cả hợp chất vô cơ như iot. Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên,
chúng được tìm thấy ở thực vật, nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn và côn trùng.
Laccase lần đầu tiên được phát hiện ở cây Rhus vernicifera. Các loại laccase
tách chiết từ các nguồn khác nhau thì khác nhau về khối lượng phân tử, tính
chất glycosyl hóa và các tính chất động học [46].
 Nguồn laccase từ vi sinh vật
Laccase được phân bố rộng rãi ở nấm, thực vật bậc cao, vi khuẩn, xạ
khuẩn và côn trùng. Hơn 60 chủng nấm thuộc nhiều lớp khác nhau như:
Ascomycete, Basidiomycetes và Deuteromycetes, được chứng minh là có
khả năng sinh laccase [22]. Martins và cộng sự, cùng các tác giả khác đã
đưa ra 1 số loài vi khuẩn và nấm quan trọng sinh laccase với hoạt tính cao
được trình bày ở bảng 1.1 4
Bảng 2.1 Các vi sinh vật sinh laccase

Pleurotus
ostreatus
Abo-State et al.
(2011)
Lentinus
tigrinus
Ferraroni et al
(2007)
Trametes sp. Li et al. (2008),
Guo et al.
(2012)
Pestalotigis
sp.
Verma et al.
(2010)
F. troggi Ciullini et al.
(2008)

 Vi khuẩn Bacillus sinh laccasse:
Nghiên cứu về vi khuẩn sinh laccase đã được công bố lần đầu vào năm
1993 và tiếp tục đẩy mạnh nghiên cứu trong những năm sau đó [24].
Theo Hullo và cộng sự (2001), protein CotA từ áo bào tử của Bacillus
subtilis biểu hiện tương đồng với khả năng của các enzyme oxy hóa đa nhân
đồng, tuy nhiên không phải CotA từ các protein thuộc bào tử khác cũng có
khả năng này. Từ đó chứng minh được CotA là 1 loại laccase [33]. Một
nghiên cứu khác của Meyer và cộng sự cho thấy khả năng sinh CotA-type
laccase từ chủng Bacillus pumilis [44].
Theo Kaushik và Thakur (2014), chủng Bacillussp. được phân lập từ nhà
máy sản xuất rượu có khả năng sinh tổng hợp laccase ngoại bào với hoạt tính
cao nhất là 107,32 U/ml [20].

xúc tác của laccase. Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và vùng
C, trung tâm một nguyên tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử
đồng nằm ở bề mặt chung của vùng A và vùng C [32].
 Ứng dụng của laccase
Loại màu: công nghiệp dệt sử dụng một lượng lớn nước và hóa chất để
phục vụ cho xử lý ướt. Những hóa chất này bao gồm các thành phần vô cơ và
các thành phần hữu cơ. Laccase có khả năng phân hủy và loại màu thuốc
nhuộm và các màu tổng hợp, điều đó giải thích vì sao những nghiên cứu về
enzyme này được phát triển và sử dụng hiệu quả trong nhiều ngành công
nghiệp [16]. Cũng theo Blanquez và cộng sự (2004), nấm Trametes
versicolour loại được hoàn toàn màu Reactive Blue 15, Congo Red và
Reactive Black 5, trong khi chỉ loại được một phần màu Brilliant Red 3G-P,
Brilliant Yellow 3B-A và RBBR
Trong công nghiệp giấy: các chất oxy hóa dựa vào clo và oxy được sử
dụng để phân tách và phân hủy lignin – yêu cầu cần thiết để chuẩn bị cho giấy
thành phẩm ở mức độ công nghiệp. Khả năng phân hủy lignin bằng vi sinh
vật đã được nghiên cứu sâu ở nấm, nhưng chưa được thực hiện nhiều ở vi
khuẩn. Bugg và cộng sự (2011) đã đưa ra gợi ý về một số vi khuẩn đất,
thường là vi khuẩn có khả năng phân hủy các hợp chất thơm để phân giải
lignin [9].
Hiện tại, Bacillus sinh laccase kiềm tính,chịu nhiệt đã được nghiên cứu
trong xử lý bột gỗ [51]. Một vài ứng dụng của laccase từ nhiều nguồn vi sinh
vật khác nhau được trình bày ở bảng 1.2. 7
Bảng 2.1 Một số vi sinh vật sinh laccase và ứng dụng
Ứng dụng Nguồn laccase Tài liệu tham khảo
Loại màu thuốc
nhuộm


Gliocladium virens Murugesan (2003)
Lentinula edodes D'Annibale et al. (1999)
Pleurotus spp. Tsioulpas et al. (2002)
Pycnoporus coccineus Jaouani et al. (2005)
Trametes sp. strain AH28-2 Xiao et al. (2003)

Đối với công nghiệp thực phẩm, laccase được sử dụng để loại bỏ những
thành chứa phenolic khi làm bánh [14]. Laccase cũng được dùng vào các quá
trình tăng cường hoặc thay đổi màu sắc xuất hiện trong thực phẩm và đồ
uống. Trong ngành công nghiệp bia, laccase không chỉ đem lại sự ổn định mà
còn giúp tăng thời hạn sử dụng sản phẩm [34], [45].
Trong lĩnh vực xử lý sinh học và phân hủy sinh học, y tế, dược phẩm,
mỹ phẩm và công nghệ nano: hiện tại, các nghiên cứu hữu ích được tập trung 8
vào ứng dụng của laccase như những chất xúc tác sinh học mới trong tổng
hợp các hợp chất hữu cơ [7]. Laccase được ứng dụng trong tổng hợp chất hữu
cơ oxy hóa của các nhóm chức, cặp chất phenol và steroid, tác nhân y sinh
(gây mê, chống viêm, kháng sinh, an thần), cấu trúc của các liên kết nitrogen
– carbon và trong tổng hợp các sản phẩm tự nhiên phức tạp [36].
Trong lĩnh vực xử lý đất ô nhiễm: PAHs kết hợp với các xenobiotics gây
độc cho đất, tuy nhiên với khả năng phân hủy triệt để các hợp chất đó, laccase
có vai trò vô cùng quan trọng với môi trường nhờ tính chất xúc tác tuyệt vời
của chúng [14].
2.1.2. Protease
Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO – NH-) của phân tử protein và peptid thành các acid
amin tự do, một vài peptid ngắn, pepton. Protease là một trong những nhóm

khả năng thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự
thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid trong chitin [4]. Chitinase có trong nhiều
loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật không
xương sống và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme có
khả năng xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên không phải cây
trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của
chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh. Chitinase còn được tìm thấy trong vi
khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio,
Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để
phân giải chitin trong môi trường nhằm sử dụng làm nguồn cacbon cho sinh
trưởng và phát triển của chúng [39]. Vì vậy, việc tìm ra chủng vi sinh vật có
khả năng sản xuất enzyme này với hoạt tính cao có ý nghĩa rất quan trọng.
Ứng dụng của chitinase:
Trong phòng trừ nấm gây bệnh ở thực vật: theo Hiroshi [26], chitinase luôn
có mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây không chứa chitin. Chitinase và β-
1,3-glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây
bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển
của nấm bệnh. Sự kích thích hoạt tính chitinase là dấu hiệu trả lời của tế bào đối
với tác động của tác nhân gây bệnh, đi kèm với sự kích thích hoạt tính phân giải
amoniac, phenylalanin làm tiền đề cho sự tổng hợp lignin và phytoalexin ở thực
vật [3]. Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng đã chứng minh quá trình chống lại 10
các mầm bệnh thực vật có liên quan đến việc sản xuất chitinase. Vi khuẩn có khả
năng chống lại nấm bệnh bằng cách sản xuất ra chitinase (Fridlender và cộng sự,
1993; Gay và cộng sự, 1992). Chitinase của Streptomyces có khả năng kì hãm sự
phát triển của nấm [18], [28].
Toyoda đã bổ sung vào đất một lượng thích hợp chitin nhằm kích thích
sự phát triển của các chủng vi khuẩn sinh chititnase (những vi sinh vật này

khoảng 1.5x10
12
tấn sinh khối được sản xuất thông qua quá trình quang hợp,
đặc biệt là ở các vùng nhiệt đới và nó cũng được xem như một nguồn vật liệu
thô vô tận để tạo ra các sản phẩm khác nhau [43].
Cellulase là enzyme thủy phân cellulose tạo thành các sản phẩm sơ cấp
như glucose, cellobiose và cello-oligosaccharides. Có 3 dạng cellulase chính
là: cellobiohydrolase (CBH hoặc 1,4-β-D-glucan cellobiose, EC 3.2.1.91),
Endo-β-1,4-glucanase (EG hoặc endo-1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolase,
EC 3.2.14) và β-glucosidase (BG-EC 3.2.1.21).
Cellulase từ nấm có cấu trúc đơn giản hơn khi so sánh với cấu trúc hệ
enzyme từ vi khuẩn. [54]. Cellulase điển hình từ nấm có 2 vùng riêng biệt:
vùng xúc tác và phần còn lại là điểm bám của phân tử cellulose (cellulose
binding molecular - CBM). CBM bao gồm khoảng 35 amino acids, vùng nối
giữa 2 vùng riêng biệt chứa nhiều serine và threonine. Điểm khác biệt chủ yếu
giữa cellulosomes (là một phức hợp đa enzyme lớn) và các cellulase tự do là
ở trong thành phần của cellulosomes-cohesin chứa scaffolding và dockerine.
Cellulases tự do chứa CBMs, là điểm được thay thế bởi một phân tử
dockerine trong phức hợp cellulosomal và một scaffolding được tạo ra trực
tiếp từ cellulosomes [17].
Cellulase được tổng hợp từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau như vi
khuẩn, nấm và xạ khuẩn, một số nguồn vi sinh vật sinh cellulase được trình
bày ở Bảng 1.3 [43], [11], [31]. 12
Bảng 2.2 Nguồn vi sinh vật sinh cellulase
Chi Loài
Nấm


được ứng dụng trong chuyển hóa sinh khối, đưa ra một phương hướng nghiên
cứu mới ứng dụng vào các ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt,
sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và trong chăn nuôi [43].
2.2. Thuốc nhuộm
Thuốc nhuộm có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc được tổng hợp,là những
chất có màu, hấp thụ mạnh một phần nhất định của quang phổ ánh sáng nhìn
thấy và có khả năng gắn kết vào các vật liệu dệt. Hiện nay, hầu hết thuốc
nhuộm được sử dụng là thuốc nhuộm tổng hợp. Thuốc nhuộm được sử dụng 13
là những loại có độ bền màu cao, tuy nhiên đây cũng là vấn đề trong việc xử
lý nước thải chứa màu. Màu sắc của thuốc nhuộm có được là do cấu trúc hóa
học của chúng. Thành phần của thuốc nhuộm bao gồm các nhóm mang màu
và nhóm trợ màu. Nhóm mang màu là những nhóm có các liên kết đôi liên
hợp với hệ điện tử π linh động như >C=C<, >C=N-, -COOH, -OH, -N=N- ,
nhóm trợ màu là nhóm thế cho hoặc nhận điện tử như –SOH, -COOH, -OH, -
NH
2
đóng vai trò tăng cường màu của nhóm mang màu bằng cách dịch
chuyển năng lượng của hệ điện tử.
Thuốc nhuộm tổng hợp rất đa dạng về thành phần hóa học, màu sắc,
phạm vi sử dụng. Tùy thuộc cấu tạo, tính chất và phạm vi sử dụng, thuốc
nhộm được phân chia thành các họ, các loại khác nhau. Có hai cách phân loại
thuốc nhuộm phổ biến nhất:
Phân loại theo cấu trúc hóa học (dựa vào nhóm mang màu –
chromogen).
Phân loại theo lĩnh vực và phương pháp sử dụng.
Phân loại theo cấu trúc hóa học.
Cách phân loại này dựa trên bản chất của nhóm mang màu (chromogen),

tạo hóa học, đặc điểm về màu sắc và phạm vi sử dụng. Theo đặc tính áp dụng,
thuốc nhuộm sử dụng cho xơ sợi cellulose (bông, visco…) đựơc tâm nhiều,
đó là các thuốc nhuộm hoàn nguyên, lưu hóa, hoạt tính và trực tiếp. Sau đó là
các thuốc nhuộm cho xơ sợi tổng hợp, len, tơ tằm như: thuốc nhuộm phân tán,
thuốc nhuộm bazo (cation), thuốc nhuộm acid.
Thuốc nhuộm được sử dụng rộng rãi trong các ngành như: công nghiệp
dệt nhuộm, thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, in ấn và công nghiệp thuộc da.
Các ngành công nghiệp này đã tạo ra nước thải có độ màu cao, chứa các chất
độc tố, khó phân hủy. Ở Việt Nam, ngành công nghiệp dệt nhuộm đang phát 15
triển ở những quy mô khác nhau. Nước thải dệt nhuộm thường có nhiệt độ,
pH và độ màu cao, chứa nhiều loại hóa chất khó phân hủy. Nếu không được
xử lý, nước thải dệt nhuộm sẽ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Do đó,
việc xử lý nước thải dệt nhuộm trước khi xả thải ra môi trường là rất cần thiết,
đò hỏi phải có biện pháp xử lý triệt để.
2.3. Một số phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm
Nhìn chung, các phương pháp xử lý nước thải dệt nhuộm được áp dụng
phổ biến ở các cơ sở dệt nhuộm ở nước ta hiện nay chủ yếu theo 3 phương
pháp và thường được ứng dụng riêng rẽ hoặc kết hợp để xử lý nước thải dệt
nhuộm là: phương pháp hóa lý, phương pháp oxy hóa bậc cao và phương
pháp sinh học.
2.3.1. Phương pháp hóa lý
Các phương pháp hóa lý như keo tụ tạo bông, tuyển nổi và hấp phụ chỉ
chuyển chất màu từ pha này sang pha khác mà không làm biến đổi bản chất,
cấu trúc chất màu. Do đó, trong xử lý nước thải màu thì các phương pháp trên
có nhược điểm là không xử lý triệt để chất màu và các chất gây ô nhiễm, chất
ô nhiễm này sẽ tích lũy ở bùn hay chất hấp phụ và phải mất chi phí để xử lý
bùn và chất hấp phụ này. Riêng đối với thuốc nhuộm hoạt tính, keo tụ - tạo

enzyme reductase nội bào và ngoại bào. Các enzyme reductase nội bào xúc
tác cho phản ứng phân hủy thuốc nhuộm khi có sự hiện diện của các chất
tương đương như FADA, NADH, NADPH [12]. Hầu hết các loại thuốc
nhuộm azo có nhóm thế sulfonate và trọng lượng phân tử cao không có khả
năng đi qua màng tế bào. Do đó, các hoạt động khử thuốc nhuộm azo không
phụ thuộc nhiều vào sự hấp thu nội bào. Sự oxy hóa thuốc nhuộm được xúc
tác bởi các enzyme ngoại bào là peroxidases và phenoloxidases như laccase
(Lac), manganese peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP), tyrosinase
(Tyr), N-demethylase và cellobiose dehydrogenase. Những enzyme ngoại bào
này được tìm thấy trong nấm sợi, nấm men và vi khuẩn [48].
Trong đó laccase có tiềm năng trong phân hủy sinh học do khả năng oxy
hóa không đặc hiệu của chúng, không đòi hỏi co-factor và sử dụng oxy có sẵn
như một chất nhận điện tử [30].
17
PHẦN 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
3.1.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn:
Năm mươi tư chủng vi khuẩn được phân lập từ rừng Quốc Gia Ba Vì và
vườn Quốc Gia Bidoup Núi Bà của Việt Nam, nằm trong bộ sưu tập giống
của phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường, Viện Công nghệ sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Cặp mồi: 27F và 1492R được sử dụng để nhân đoạn gene mã hóa 16S
rRNA có trình tự như sau:
Mồi xuôi (27F): 5’ – GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’
Mồi ngược (1492R): 5’ – GGY TAC CTT GTT ACG ACTT – 3’