ĐẶT VẤN ĐỀ
Amylase là hệ các enzyme thủy phân tinh bột và các polysaccharid đơn
chất tương tự như: dextrin, glicogen Hệ enzyme amylase là một trong số các
hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh
vực kinh tế quốc dân khác. Trong Công Nghệ Thực Phẩm amylase được ứng
dụng: trong sản xuất bánh mì có tác dụng tăng độ ngọt và mùi vị của sản
phẩm, trong sản xuất cồn để đường hóa tinh bột, chế biến dextrin với dịch
đường để sản xuất thức ăn cho người già và trẻ con, dùng trong sản xuất mật
ngô Amylase chiếm khoảng 25% thị trường enzyme, đã thay thế hầu như
hoàn toàn việc thủy phân tinh bột bằng hóa chất trong các ngành công nghiệp.
Amylase được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật
(nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) đến thực vật (đại mạch, khoai lang ) và động
vật (gan, ruột, tụy ). Trong đó amylase thu nhận từ vi sinh vật có nhiều tính
ưu việt do chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, thành phần môi trường
nuôi cấy dễ kiếm và rẻ tiền. Đồng thời, chúng ta có thể dễ dàng điều khiển các
điều kiện tối ưu của quá trình nuôi cấy. Điều đó cho phép thu được các
enzyme theo mong muốn với hoạt tính cao.
Rượu là sản phẩm đã được sản xuất từ rất lâu trong các hộ gia đình với
nguyên liệu để nấu rượu thường là gạo, nếp Mỗi loại nguyên liệu tạo thành
một hương vị đặc trưng của rượu. Để sản xuất rượu thì người ta thường sử
dụng hỗn hợp vi sinh vật làm nhiệm vụ chuyển hoá tinh bột thành đường (nấm mốc) nhờ hệ enzyme amylase, sau đó
chuyển đường thành rượu (nấm men) và còn có một số vi khuẩn tạo hương cho sản phẩm.
Dựa trên cơ sở này chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào
của chủng nấm mốc phân lập từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống”
Nội dung của đề tài này là:
+ Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao từ quy trình sản xuất rượu gạo truyền thống.
1
+ Khảo sát một số yếu tố nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng
hợp amylase ngoại bào.
+ Có qua chưng cất (rượu trắng): nguyên liệu thường là gạo tẻ.
+ Không qua chưng cất (rượu vang gạo): nguyên liệu thường là gạo nếp.
• Nguyên liệu
Nguyên liệu gạo
Thường sử dụng các loại gạo có hàm lượng tinh bột cao thông dụng
như gạo tẻ, gạo nếp
+ Thành phần dinh dưỡng của hạt gạo [6]:
Gạo nếp: Nước 14%, Glucid 79.4%, Lipid 1.5% và protein 8.2% trong
đó Protein của gạo nếp chủ yếu là glutein (oryzaine) và glubuline ngoài ra
còn một ít lẫn Cozine và Prolamin. Glucid của gạo nếp chủ yếu là tinh bột,
4
Nấu chín
Để nguội
Trộn bánh men
Lên men
Chưng cất
Rượu trắng
Lọc
Bánh men
Rượu vang
gạo
Nguyên liệu gạo
đường, cellulose và hemicellulose.Trong tinh bột chủ yếu là amylopectin.
Ngoài ra còn chứa một số vitamin như B
1
, B
2
, B
6
, PP và E.
•Nấu chín: Gạo nguyên liệu được ngâm nhằm rửa sạch chất bẩn bám bên
ngoài hạt, đồng thời làm cho hạt gạo mềm, trương nở giúp dễ dàng cho quá
5
trình nấu. Sau khi để ráo, gạo được cho vào nồi, thêm nước và nấu chín. Tỉ lệ
gạo: nước khoảng 1: 1 theo thể tích.
• Làm nguội: Cơm sau khi nấu chín được trải đều trên một bề mặt
phẳng để làm nguội xuống nhiệt độ thích hợp cho việc trộn bánh men rượu.
Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp cơm
với tỷ lệ thích hợp tùy theo hướng dẫn trên từng loại men. Sau đó cho tất cả
vào khạp lớn, đậy nắp để bắt đầu quá trình lên men rượu.
• Lên men: Quá trình lên men diễn ra ở nhiệt độ thường (khoảng 28 -
32
o
C). Sau 2 ngày đầu lên men, có thể bổ sung nước vào khối lên men với tỷ
lệ nước: cơm khoảng 3: 1, sau đó đậy nắp và tiếp tục lên men thêm khoảng 1
ngày nữa.
•Chưng cất: Khi quá trình lên men kết thúc, ta tiến hành chưng cất để
thu được rượu thành phẩm. Tùy theo yêu cầu của khách hàng mà ta có thể
tiến hành pha trộn các loại rượu thu được ở các khoảng thời gian chưng cất
khác nhau để tạo ra rượu có nồng độ cao thấp khác nhau.
1.2.Tổng quan về amylase
1.2.1. Giới thiệu về amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân. Amylase thủy phân các phân tử
tinh bột để cho ra nhiều sản phẩm khác nhau bao gồm những dextrin và các
polyme kích thước nhỏ hơn được tạo thành từ các đơn vị glucose [30].
1.2.2. Phân loại amylase
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chia
amylase làm 3 loại: α-amylase, β-amylase và γ-amylase (hay còn gọi
glucoamylase).
của vi khuẩn có tính bền nhiệt cao, có thể giữ được hoạt tính ở 70 - 90
0
C.
Tính bền nhiệt của α-amylase là do sự có mặt của canxi trong phân tử enzym,
ở đây canxi giữ vai trò ổn định cấu trúc bậc ba của phân tử enzym.
α-amylase thường thể hiện hoạt tính trong vùng axit yếu, α-amylase của
nấm mốc hoạt động mạnh ở pH 4.5 - 4.9; của vi khuẩn ở pH 5.9 - 6.1. Nếu
pH< 3, đa số α-amylase bị vô hoạt hoàn toàn, trừ α-amylase của Asperillus
niger có thể chịu được pH 2.5 - 3.8.
Những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp α-amylase có ý nghĩa
công nghiệp: Bacillus subtilis, Bacillus lichenifomis, Asperillus oryzae [1].
7
1.2.2.2. β-amylase
β-amylase (α-1,4-glucan maltosehydrolase, EC 3.2.1.2) là một enzyme
xúc tác sự thủy phân liên kết α–1,4 glucoside của phân tử tinh bột và các
polisaccarit tương tự.
β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên thể, chỉ tác dụng lên tinh
bột đã hồ hóa. Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi
không có canxi.
β-amylase kém bền dưới tác dụng của nhiệt độ cao, β-amylase bị vô
hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 70
0
C, song trong dịch nấu nhiệt độ tối thích lại là 60
- 65
0
C.
β-amylase khá bền trong môi trường axit, ngay ở pH 3 - 4. Đa số β-
amylase hoạt động mạnh hơn trong môi trường có pH 4.5 - 5 [1].
1.2.2.3. Glucoamylase
Glucoamylase (α-1,4-glucan glucohydrolase, E.C.3.2.1.3) là enzym
tuyến tụy. Amylase cũng có trong các tụy tạng như gan, ruột. Ngoài ra,
amylase còn có trong huyết thanh.
1.2.3.3. Nguồn vi sinh vật
Enzym vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzym từ các nguồn
khác. Amylase thu nhận từ vi sinh vật chủ yếu là từ nấm mốc, giá nấm men và
vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn.
Amylase từ nấm mốc
Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc Aspergillus,
Rhizopus. Nhiều loại thuộc các giống này (Asp. Oryzae, Asp.niger, Asp.
usamii, Asp. awamori, Asp. batalae, Rhizopus delemar, Rh. tonnesis, Rh.
neveus, Rh. japonicum, Rh. fonkinensis, Rh. topninensis) và một số loài của
Neurospora và Mucor sinh tổng hợp rất mạnh mẽ không những chỉ α-
amylase mà cả glucoamylase [9].
Amylase từ nấm men và giả nấm men
Amylase cũng được thu nhận từ nấm men và giả nấm men thuộc các
giống Saccharomyces, Endomycopsis, Endomyces (Ikuo Matsui và cộng sự
(1990) [19], Helena Ebertová (1964) [18], Dr. Y. Hattori (1961) [14]).
9
Amylase từ vi khuẩn
Amylase có thể được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn khác nhau.
Collins BS, Kelly CT cùng cộng sự (1993) [12] phân lập chủng
Thermomonospora curvata NCIB 10081, Chung Yc và Kobayashi T (1995)
[13] cũng tìm được chủng T. profundus DT 5432 đều có khả năng sinh α-
amylase ngoại bào cao.
1.2.4. Sản xuất chế phẩm amylase từ vi sinh vật [1]
1.2.4.1. Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống
Chọn chủng thích hợp là bước đầu tiên khi muốn sản xuất enzym từ vi
sinh vật. Sau khi sàng lọc từ hàng trăm chủng và loài vi sinh vật khác nhau,
chủng có hiệu suất sinh enzym cao, không lây bệnh, không sinh độc tố, thể
hiện khả năng ổn định sinh học cao sẽ được lựa chọn.
Nguồn nitơ có thể là các hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ. Nguồn nitơ hữu
cơ cũng có thể là các nguyên liệu giàu protein như cao ngô, bột đậu tương,
khô đậu, khô lạc Ngoài ra một số acid amin, các bazơ nitơ cũng được bổ
sung vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Ngoài nguồn cacbon và nitơ, các nguyên tố khoáng cũng ảnh hưởng rõ
rệt đến đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Các nguyên tố này bao gồm
nguyên tố vi lượng (Fe, Cu, Zn, Co ) và nguyên tố đa lượng. Chúng thường
có trong nước hoặc trong thành phần hữu cơ khác của môi trường nên không
cần bổ sung hoặc chỉ bổ sung ở dạng vết.
1.2.4.3. Phương pháp nuôi cấy thu nhận enzym từ vinh vật
Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác
nhau về nguyên tắc. Phương pháp bề mặt và phương pháp nuôi bề sâu hay
còn gọi là phương pháp chìm, trong môi trường chìm có thể có phương pháp
nuôi chìm hai bước:
+ Nuôi cấy trên bề mặt ( môi trường cám gạo)
+ Nuôi cấy chìm (môi trường dung dịch lỏng )
+ Nuôi cấy chìm hai bước
11
Phương pháp nuôi bề mặt
Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi
trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Các chất dinh
dưỡng này thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, các chất thải bỏ của
công nghệ thực phẩm hoặc hỗn hợp của nhiều chất. Trong môi trường dinh
dưỡng người ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự sinh tổng
hợp enzyme nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ,
photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch tự phân nấm men Để đảm bảo
độ xốp của môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10 - 20%.
Trước khi gieo cấy vi sinh vật, môi trường cần được thanh trùng để đảm bảo
không bị nhiễm vi sinh vật lạ trong khi nuôi.
Phương pháp nuôi bề mặt thường thích hợp để nuôi các loại nấm mốc
có pH thích hợp.
Không có quy trình chung nào để chiết xuất và tinh chế nhiều loại
enzyme khác nhau. Tuy nhiên, quá trình tách và tinh chế enzyme thường tuân
theo các bước sau:
- Phá vỡ tế bào và chiết enzyme bằng các dung môi thích hợp đối với
enzyme nội bào hoặc ly tâm tách sinh khối đối với enzym ngoại bào.
- Dịch enzyme thu được có thể chứa nhiều loại enzyme, protein không
hoạt động và các tạp chất. Vì vậy, để thu được một loại enzyme nào đó ở
dạng tinh khiết có thể tiến hành theo nhiều phương pháp như sau:
+ Tách enzym nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, rượu
etylic hoặc các dung dịch muối trung tính như (NH
4
)
2
SO
4
, NaCl.
+ Sắc ký lọc gel hoặc trao đổi ion: kết quả của phương pháp này là các
protein khác nhau sẽ được tách ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau,
trong đó phần chiết chứa enzyme cần thu có nồng độ cao nhất.
Sau khi làm sạch cần sấy khô enzyme để bảo quản lâu dài. Phương
pháp sấy thường được dùng để sấy enzyme là sấy thăng hoa hoặc sấy chân
không. Các chế phẩm thương mại có thể ở dạng dung dịch bổ sung thêm chất
bảo quản, chất này thường là NaCl.
13
1.2.5. Ứng dụng của amylase
1.2.5.1.Trong sản xuất rượu
Đối với công nghiệp rượu cồn, các enzyme đường hóa có một vai trò
quan trọng. Chế phẩm enzyme dùng trong sản xuất rượu thường ở dạng thô,
không cần thiết phải tinh chế.
Việc sử dụng các chế phẩm amylase vi sinh vật thay cho malt trong sản
xuất bia có nhiều ưu điểm như:
+ Tiết kiệm nguyên liệu hạt cao cấp để sản xuất malt, rút ngắn thời gian
sản xuất, giảm diện tích sản xuất.
+ Giảm chi phí về năng lượng và lao động.
+ Tăng hiệu suất do mức độ thủy phân tinh bột sâu sắc hơn.
1.2.5.3. Trong công nghiệp sản xuất glucose và mật tinh bột
Chúng ta đều biết từ tinh bột có thể thu được các phẩm vật đường khác nhau.
Khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng enzyme của malt sẽ
thu được mật glucose hay mật maltose. Mật thu được bằng phương pháp
enzyme (mật maltose) thường chứa nhiều dextrin. Mật maltose thường được
dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất sản phẩm ăn kiêng cho trẻ con
và người bệnh.
Trong sản xuất glucose và mật tinh bột, amylase được ứng dụng rộng
rãi và chiếm vị trí quan trọng. Với chế phẩm amylase từ vi sinh vật, ngoài mật
maltose, người ta còn có thể thu được glucose tinh khiết.
Việc sử dụng amylase để thủy phân tinh bột trong sản xuất các loại mật
và đường glucose có những ưu điểm cao hơn hẳn phương pháp thủy phân bằng
acid vì enzyme có tính đặc hiệu cao có thể cho sản phẩm thuần khiết. Hơn nữa,
quá trình sản xuất lại đơn giản, dễ điều khiển và cho hiệu suất cao hơn.
Hiện nay, ở nhiều nước (Nhật, Mỹ, Canda) người ta đã sử dụng các chế
phẩm glucoamylase để sản xuất đường glucose và đã giải quyết được hàng
chục vạn tấn glucose hàng năm.
Các chế phẩm enzyme glucoamylase dùng để sản xuất glucose không
cần chứa enzyme glucosiltransferase (là enzyme thường có mặt với
glucoamylase trong canh trường) vì các enzyme này sẽ gây nên sự tạo thành
15
các oligosaccharid có liên kết 4 - 6 làm giảm hiệu suất đường glucose và làm
cho sản phẩm có vị đắng, do đó cần chọn các chủng vi sinh vật tổng hợp
mạnh glucoamylase nhưng lại không tổng hợp glucosiltransferase. Người ta
- Cấu tạo tế bào nấm không khác với cấu tạo tế bào của các vi sinh vật
khác. Màng tế bào cấu tạo bởi cellulose hay các chất gần giống với cellulose,
ở nhiều loại nấm trong màng tế bào có chứa chitin. Trong tế bào chất có
không bào và các chất khác. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen,
hạt volutin và các giọt mỡ. Tế bào nấm có 1, 2 hoặc nhiều hạch (nhân). Ở
nấm hiện tượng nhiều hạch là rất phổ biến.
Hình 1.2: Khuẩn lạc của Aspergillus awamori và Mucor miehei
Sinh sản của nấm mốc
Một số đặc điểm nổi bật của nấm là có nhiều hình thức sinh sản và
nhiều loại cơ quan sinh sản. Nấm sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra
sợi nấm và sau đó là hệ sợi nấm. Mặc dù vậy, bất cứ một đoạn sợi nấm hoặc
một mảnh nào của hệ sợi nấm cũng có thể dùng để sinh sản được. Các đoạn
này khi rơi trên môi trường dinh dưỡng thì phát triển và tạo thành một hệ sợi
nấm mới. (Hình 1.3)
17
Hình 1.3: Hình dạng bào tử của một số chủng nấm mốc
1.3.2. Khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại bào
Đa số các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp amylase ngoại
bào, điển hình là:
+ Aspergillus oryzae: là mốc có màu vàng, bào tử hở, được sử dụng
rộng rãi trong sản xuất tương và nước chấm. Đặc điểm của nó là có hệ
enzyme amylase và protease.
18
+ Aspergillus awamori: là mốc màu xám đen giàu hệ enzyme amylase
và được ứng dụng rộng rãi trong công nhgiệp sản xuất rượu.
+ Aspergillus usamii: là mốc màu xám trắng, rất giàu enzyme amylase.
Hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất rượu.
Ngoài ra, vẫn còn có một số chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp
amylase ngoại bào cao như: Aspergillus niger, Mucor rouxii [8].
tương đối khoảng 100%. Chế độ thông khí có thể liên tục, gián đoạn tùy thuộc
vào chiều dày môi trường nuôi.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình sản xuất amylase là liên quan
đến sự phát triển của vi sinh vật. Với nấm mốc, hầu hết những nghiên cứu sản
xuất amylase cho thấy nhiệt độ nằm trong vùng giới hạn từ 25 - 37
0
C. Lượng
amylase tối thích là đạt được ở 30 - 37
0
C đối với Aspergillus oryzae [27] [20].
Ảnh hưởng của thời gian nuôi nấm mốc
Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn thường được xác định
bằng thực nghiệm. Tùy thuộc vào tính chất sinh lý của chủng sinh vật và sự
ngừng tổng hợp enzyme mà có thể làm ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào
bất kỳ lúc nào cần thiết. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì
thường làm giảm hoạt lực của enzyme. Hầu hết các chủng nấm mốc
Aspergillus oryzae có hoạt động cực đại của amylase ở khoảng giờ thứ 24 -
36.
Ảnh hưởng của pH
pH thích hợp cho nấm mốc là môi trường acid yếu khoảng 5.5 - 6.5.
Các môi trường tự nhiên từ cám, ngô thường có sẵn pH ở khoảng này nên
không cần điều chỉnh. Đôi khi khả năng sinh bào tử của nấm mốc bị yếu hoặc
mất hẳn. Để khôi phục khả năng này có thể nuôi nấm mốc trong ánh sáng
khuếch tán trong một vài thế hệ.
1.3.4. Đặc tính amylase của nấm mốc [9]
α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị
thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân amylase là glucose và
maltose.
20
sản xuất ở tỉnh Thừa Thiên Huế:
Giai đoạn 1: cơm sau khi ủ bánh men 1 ngày
Giai đoạn 2: cơm sau khi ủ bánh men 2 ngày
Giai đoạn 3: cơm sau khi ủ bánh men 3 ngày
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất vô cơ: HCl, KCl, NaNO
3
, MgSO
4
.7H
2
O, Na
2
HPO
4
,
NaH
2
PO
4
.
- Hóa chất hữu cơ: Tinh bột hòa tan, glycerol, focmol, saccharose.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5417 – Nhật.
- Bể điều nhiệt kèm máy lắc Grant – Nhật.
- Tủ ấm Incubator MiR.262 – Nhật.
- Tủ lạnh Sanyo medicool – Nhật.
- Máy so màu Biowate – Nhật.
- Tủ cấy Labgard – Nhật.
C, 10 phút)
Ngưng phản ứng bởi 2ml HCl 0.01M
Đo OD
PƯ
ở bước sóng 660nm
Mẫu kiểm tra:
• Định nghĩa hoạt độ :
Một đơn vị hoạt độ amylase được định nghĩa là lượng enzyme có tác dụng
làm giảm 1% màu xanh (được biểu thị bởi mật độ quang) của dung dịch tinh
bột 2% ở 50
0
C, trong 10 phút.
• Tính kết quả :
Trong đó:
OD
KT
: Mật độ quang của mẫu KT
OD
PƯ
: Mật độ quang của mẫu PƯ
10: thời gian phản ứng (phút)
2.3.1.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp Enzyme ngoại bào (Amylase)
bằng phương pháp đục lỗ đĩa thạch
• Nguyên tắc:
Enzyme khuyếch tán từ lỗ đục vào thạch làm thủy phân cơ chất là tinh
bột, tạo vòng thủy phân không bắt màu với thuốc nhuộm Lugol.
24
100µl dịch enzyme
Ủ ổn nhiệt (50
0
2
O 0.05%, KCl 0.05%, FeSO
4
0.01%, saccaroza 3%, agar 2%). Sau
khi nuôi ở 35
0
C trong 24 đến 48 giờ, trên đĩa thạch đã xuất hiện các khuẩn lạc
vi sinh vật khác nhau. Tiến hành quan sát các khuẩn lạc này và dùng que cấy
lấy cẩn thận từng khuẩn lạc khác nhau cấy sang đĩa thạch khác. Tiến hành
phân lập nhiều lần để tách riêng từng khuẩn lạc.
2.3.2.2. Xác định hình thái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc
Sử dụng phương pháp nuôi cấy nấm ở trên phiến kính để xác định hình
thái, cấu tạo khuẩn lạc, tế bào của nấm mốc.
• Chuẩn bị :
- Phiến kính dùng để nuôi cấy nấm phải thật trong, sạch.
25
Nguồn phân lập
Xử lý mẫu
Pha loãng
Môi trường phân lập
Nuôi trong tủ ấm
Khảo sát các đặc
điểm khuẩn lạc
Tuyển chọn và thu nhận các
chủng VSV làm đối tượng
nghiên cứu
Copyright: Tài liệu đại học ©