BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ
ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI BÃ MÍA CỦA
NẤM MEN S. cerevisiae H13
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: SINH VIÊN THỰC HIỆN:
Ths. VÕ VĂN SONG TOÀN NGUYỄN LÊ BẢO TRÂN
PGs. Ts. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3102871
LỚP: CNSH TT K36
Cần Thơ, tháng 12/2014
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học i Viện NC&PT Công nghệ sinh học
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng năm 2014
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên) Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ sinh học
LỜI CẢM TẠ
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp bên cạnh sự cố gắng
của bản thân, tôi còn nhận được sự động viên khích lệ to lớn cả về vật chất lẫn tinh
thần từ gia đình. Đó chính là động lực to lớn giúp tôi vượt qua các khó khăn để
hoàn thành đề tài nghiên cứu này.
Xin gửi lới tri ân sâu sắc đến PGs. Ts Trần Nhân Dũng cùng với Ths. Võ
Văn Song Toàn, hai người đã nhiệt tâm hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập, xây dựng đề cương nghiên cứu, thực hiện thí
nghiệm và hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin chân thành cảnh ơn tất cả các thầy cô trong Viện nghiên cứu và
Phát triển Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ dạy những kiến thức hữu ích giúp cho
việc thực hiện luận văn được thuận lợi.
Cám ơn các cô chú công nhân viên của Viện đã giúp đỡ trong quá trình làm
việc trong và ngoài giờ để tôi hoàn thành đề tài đúng tiến độ quy định.
Tôi cũng vô cùng biết ơn tất cả các thành viên của phòng Công nghệ
7
tế
bào/ml . Cuối cùng với nghiệm thức thời gian cho kết quả thời gian nuôi cấy tối ưu
là 3 ngày với mật số thu được là 8,82x10
7
tế bào/ml. Cùng với các điều kiện tối ưu
trên, Hàm lượng vật chất khô cũng tăng đáng kể lần lượt là 8,07%; 10,73%;
8,94%; 9,52% và 9,81%. Hàm lượng xơ thô được phân giải theo thứ tự khảo sát là
12,08%; 13,27%; 13,07%; 14,17% và 14,38%. Trong quá trình nuôi cấy nấm men
hoàn toàn không sinh ra amoniac gây độc cho tế bào.
Từ khóa: bã mía, CF, DM, mật số nấm men, nấm men.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ sinh học
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ii
TÓM LƯỢC iii
DANH SÁCH HÌNH vii
DANH SÁCH BẢNG viii
TỪ VIẾT TẮT x
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1
2.6.2. Nước ngoài 15
CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
3.1. Phương tiện nghiên cứu 16
3.1.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 16
3.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm 16
3.2.1. Thiết bị 16
3.2.2. Dụng cụ 16
3.2.3. Hóa chất 16
3.3. Nguyên vật liệu 17
3.4. Môi trường nuôi cấy nấm men 17
3.5. Phương pháp nghiên cứu 19
3.5.1. Khảo sát thành phần hóa học của bã mía 19
3.5.2. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã
mía của H13 19
3.5.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát hoạt tính exoglucanase và endoglucanase của H13
20
3.5.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự
phân giải bã mía của H13 21
3.5.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của pH đến sự phân giải bã mía của H13
21
3.5.6. Thí nghiệm 5: Đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phân giải bã mía của
H13 22
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ sinh học
3.5.7. Thí nghiệm 6: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian đến sự phân giải bã mía của
H13 23
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
4.1. Kết quả khảo sát thành phần bã mía 24
4.2. Ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất lên sự phân giải bã mía của H13 25
Hình 9: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới mật số nấm men 29
Hình 10: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới hàm lượng DM 30
Hình 11: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nấm men tới hàm lượng CF 31
Hình 12: Ảnh hưởng của pH tới mật số nấm men 32
Hình 13: Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng DM 33
Hình 14: Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng CF 34
Hình 15: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới mật số nấm men 356
Hình 16: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng DM 367
Hình 17: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hàm lượng CF 378
Hình 18: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới mật số nấm men 39
Hình 19: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hàm lượng DM 40
Hình 20: Ảnh hưởng của thời gian ủ tới hàm lượng CF 40
Hình 21: Đường chuẩn glucose Phụ lục 2
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 1: Thành phần hóa học của bã mía 3
Bảng 2: Thành phần sinh khối khô của nấm men 9
Bảng 3: Thành phần môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1) 17
Bảng 4: Thành phần môi trường Potatose Glucose (PG) (M2) 17
Bảng 5: Thành phần môi trường lỏng Ryckeboer (2003) cải tiến (M3) 18
Bảng 6: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M4) 18
Bảng 7: Thành phần môi trường đặc Ryckeboer (2003) cải tiến (M5) 19
Bảng 8: Hàm lượng các thành phần trong 2 loại bã mía 24
Bảng 9: Hàm lượng đạm ammoniac sinh ra sau nuôi cấy 28
Bảng 10: Đường kính vòng halo 29
Bảng 35: Kết quả thống kê DM TN6 Phụ lục 3
Bảng 36: Kết quả thống kê CF TN6 Phụ lục 3
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học tiên tiến iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
TỪ VIẾT TẮT
BSA: Bovine serum albumin
CF: Crude fibers
CMC: Carboxymethyl cellulose
DM: Dry matter
kDa: Kilodalton
OD: Optical density
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
công việc quan trọng và cần thiết. Đó cũng là lý do đề tài “Ảnh hưởng của một số
yếu tố lên khả năng phân giải bã mía của nấm men H13” được tiến hành.
1.2. Mục tiêu đề tài
Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố lên khả năng phân giải bã mía của
nấm men H13. Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 3 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Bã mía
Bã mía là các thành phần sợi còn lại sau khi mía được nghiền để lấy nước
(Marcela và Jorge, 2013). Theo Cerqueira et al., (2007) một tấn mía tươi tạo ra
10
O
5
)
n
, một
polysaccharide gồm mạch thẳng từ hàng trăm đến hơn mười nghìn đơn phân D-
glucose thông qua liên kết β-1,4 glycosidic (Crawford, 1981). Cellobiose là cấu trúc
lặp của cellulose, với mỗi glucose xoay 180 độ so với các glucose bên cạnh. Ở thực
vật, cellulose có độ polymer hoá dao động từ 7000 – 14000 đơn phân, nhưng có khi
chỉ 500 đơn phân (Ljungdahl và Eriksson, 1985).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 4 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 1: Cấu trúc phân tử cellulose
Phân tử cellulose được bền hoá bằng các liên kết hydro trong và liên phân tử
và lực Van der Waals, thành lập các vi ống cellulose. Các vi ống này kết hợp lại tạo
chất xơ. Các phân tử cellulose sắp xếp song song. Cấu trúc này tạo thành domains
tinh thể trật tự chặt chẽ xen lẫn với các domain phân tán không chặt chẽ.Mức độ
tinh thể hoá đạt 60-90% (Marchessault và Sundararajan, 1983).
(*Nguồn:Heinze and Lieberd, 2012)
2.2.2. Hemicellulose
Hemicellulosic polymers là những thành phần phức trong vách tế bào của
các loài thực vật.Hemicellulose thành lập các liên kết hydro với cellulose và thành
lập các liên kết cộng hoá trị (đa phần là α-benzyl ether) với lignin và liên kết ester
với các đơn phân acetyl và hydroxycinnamic acids. Các liên kết trên giữ chặt
hemicellulosic polymers vào vách tế bào (Jing et al., 2012). Trong khi cellulose ở
polysaccharide của vách tế bào thực vật đều ưa nước và vì vậy thẩm thấu nước, thì
lignin kỵ nước hơn. Các liên kết chéo của lignin ngăn cản hiện tượng thẩm thấu
nước.Vì vậy, lignin cho phép mô vận chuyển của cây hoạt động hiệu quả (Sarkanen
và Ludwig, 1971).
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 6 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Hình 3: Cấu trúc các liên kết trong lignin polymer
Theo Kamstra et al. (1958), lignin ngăn cản sự phân giải cellulose nhờ có cấu
trúc rất bền, ngay cả với acid mạnh và enzyme vi khuẩn. Vách tế bào thực vật gồm
các cấu trúc phức chất lignin – cellulose làm giảm khả năng phân giải cellulose của
vi khuẩn. (*Nguồn: Shimin et al., 2013)
2.3. Nấm men
2.3.1. Giới thiệu chung về nấm men
Nấm men là tên gọi chung của nhóm nấm có những đặc điểm như cấu tạo
đơn bào, đa số sinh sôi nảy nở bằng cách nảy chồi hoặc phân cắt tế bào, nhiều loại
có khả năng lên men đường. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong
các môi trường có chứa đường, pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, mật mía, rỉ
đường, mật ong, trong đất ruộng trồng mía, đất vườn cây ăn quả, trong các đất có
nhiễm dầu mỏ (Nguyễn Lân Dũng, 1999). Nấm men có nhiều ứng dụng rộng rãi
trong lĩnh vực thực phẩm, con người từ lâu đã biết ứng dụng nấm men vào các sản
(a) Mô hình mặt cắt tế bào (*Nguồn: http://www.sigmaaldrich.com/life-
science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-center/lysing-enzymes.html)
(b) Hình mô phỏng các thành phần của tế bào
(*Nguồn: http://www.biocourseware.com/iphone/cell/)
Vỏ tế bào
Bao quanh nấm men và được cấu tạo bởi protein, polysaccharide, phosphate
và lipid. Trong thành phần polysaccharide có chứa glucan (chủ yếu) và manan
(chiếm 90% chất khô của vỏ). Glucan – một polymer của glucose là thành phần
chính của vỏ. Nằm phía trong tiếp giáp màng tế bào chất. Nếu lớp glucan bị phá
hỏng thì toàn bộ tế bào bị phá hủy. Manan có thế kết hợp với protein tạo thành lớp
manoprotein rất khó phá hủy (Lương Đức Phẩm, 2006).
Màng tế bào chất
Là lớp màng mỏng, dày 0,1nm dính chặt với tế bào chất.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 9 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
Chức năng của màng tế bào chất:
Bảo vệ, làm hàng rào thẩm thấu
Điều chỉnh chất dinh dưỡng từ ngoài vào trong và ngược lại
Thực hiện tổng hợp thành phần của vỏ tế bào
Nơi cư trú của một số enzyme và bào quan (ribosome)
Tế bào chất
Ở thể keo, được cấu tạo từ protein, lipid, khoáng, nước (90%) và các hợp
chất khác. Có độ nhớt cao, chứa các bào quan. Cấu trúc thay đổi tùy theo tuổi của
nấm men (Lương Đức Phẩm, 2006).
Nhân
Cấu tử bất biến, nhân thật chứa DNA và RNA. Kích thước nhân không đồng
nhất ngay khi trong cùng một chủng hay ở các chủng nấm men khác nhau (Lương
Đức Phẩm, 2006).
Các bào quan khác
nấm men không sử dụng được nitrat, nguồn nitơ chính là muối amoni: amoni
sunlfat, phosphate, muối acetate, … Trong môi trường chứa muối sunlfat thì nấm
men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid sử dụng sau hoặc dùng để acid hóa môi
trường. Môi trường lỏng ammoniac (NH4
+
) là môi trường lý tưởng cho nấm men.
Nấm men sử dụng cả ure và pepton.
Chất vô cơ
Các nguyên tố vô cơ rất quan trọng. Trong đó nhu cầu phospho được quan
tâm trước hết, tiếp đến là kali, magie, lưu huỳnh, … Bên cạnh đó các nguyên tố vi
lượng như mangan, đồng, sắt, kẽm, … cũng rất cần thiết cho quá trình sinh lý của tế
bào.
2.3.3.3. Đặc tính sinh sản của nấm men
Theo Nguyễn Lân Dũng (1999), nấm men có hai hình thức sinh sản là sinh
sản vô tính và sinh sản hữu tính.
Sinh sản vô tính: chủ yếu bằng hình thức nảy chồi (diễn ra ở hầu hết các chi
nấm men), hình thức phân cắt (ở chi Schizosaccharomyces), bằng bào tử (ở chi
Geotrichum, Sporobolomyces, Candida albicans).
Sinh sản hữu tính: nấm men hình thành bào tử túi ở các chi Saccharomyces,
Zygosaccharomyces và nhiều chi nấm men khác thuộc bộ Endomycetales.
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 11 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
2.3.4. Saccharomyces cerevisiae
Tế bào nấm men S. cerevisiae được Meyen mô tả vào năm 1938 có dạng
hình trứng, bầu dục…, kích thước trung bình 3 – 6 * 5 – 12 µm, sinh sản bằng hình
thức nảy chồi không theo qui luật, có thể xuất hiện từng cái một, từng đôi hoặc một
chuỗi. Khuẩn lạc có màu trắng nhạt, rìa tròn, lồi lên, bề mặt sáng lấp lánh, đường
kính 1 – 2 mm vào ngày thứ ba. Phát triển tối ưu ở 33 – 35
0
0
C thì sự sinh sản của nấm men chậm hoặc dừng hẳn.
Ở 30
0
C, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn S. cerevisiae 2 – 3 lần, ở
35 – 38
0
C chúng phát triển nhanh hơn 6 – 8 lần. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm
Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 36 Trường Đại học Cần Thơ
Chuyên ngành Công nghệ sinh học 12 Viện NC&PT Công nghệ sinh học
men giảm nhanh, còn ở nhiệt độ thấp khoảng 20 – 23
0
C lại hạn chế được mức độ
tạp nhiễm và khả năng lên men cao, kéo dài hơn.
2.3.5.3. pH của môi trường
pH tối ưu cho nấm men ở khoảng 4,5 – 5,6. Ở pH = 4, tốc độ tích lũy sinh
khối giảm, pH = 3 – 3,5 thì sự sinh sản của nấm men dừng lại. Mức độ hấp thu chất
dinh dưỡng vào tế bào, hoạt động của hệ thống enzyme, sự sinh tổng hợp protein
đều bị ảnh hưởng bởi pH nên chất lượng của nấm men sẽ giảm nếu pH môi trường
nằm ngoài khoảng 4,5 – 5,6.
2.4. Sơ lược về enzyme thủy phân cellulose
Liên kết chủ yếu trong cellulose là β-1,4 glycosidic và để phá hủy cấu trúc
này cần có các enzyme cellulase với những tác động đặc trưng riêng biệt.
2.4.1. Endoglucanase hoặc β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4)
Enzyme endoglucanase hoặc β-1,4-D-glucan glucanohydrolase (còn gọi là
carboxyl methyl cellulose) thủy phân liên kết β-1,4 glycosidic trong phân tử
cellulose bởi tác động ngẫu nhiên trong chuỗi polymer hình thành các đầu chuỗi
khử tự do và các chuỗi oligosaccharide ngắn. Các endoglucanase không thể thủy
phân tinh thể hiệu quả nhưng nó phá vỡ các liên kết tại khu vực vô định hình tương
khô là nguyên liệu (AOAC, 2000).
2.5.4. Phương pháp kiểm tra hoạt tính cellulose bằng đường kính vòng halo
Congo Red có thể liên kết với cầu nối 1,4-β-glucoside trên CMC hoặc
cellulose tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường khi nhuộm. Sau khi nhuộm 15 – 60
phút rửa lại bằng dung dịch NaCl 1M (Wood và Bhat. 1988). Khi đó các dòng vi
sinh vật có khả năng sản sinh enzyme cellulose phân giải cầu nối β-1,4-glucoside sẽ
tạo vùng không bắt màu với Congo Red xung quang khẩn lạc (vòng halo). Vùng
này có đường kính càng lớn thể hiện vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose càng
cao (Teather và Wood. 1981).
2.5.5. Phương pháp chuẩn độ đạm ammoniac
Ammoniac trong nguyên liệu không tồn tại ở dạng NH
3
mà thường tồn tại ở
dạng muối amon. Để định lượng ammoniac thì cần phải đẩy muối amon ra thể tự do
(dưới tác dụng của muối NH
4
Cl) bằng một chất kiềm mạnh hơn như Mg(OH)
2
.
Copyright: Tài liệu đại học ©