BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT
CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME
DOXORUBICIN PEG HÓA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ
TÁC DỤNG TRÊN KHỐI U ĐỘNG VẬT
CỦA THUỐC TIÊM LIPOSOME
DOXORUBICIN PEG HÓA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Phạm Thị Minh Huệ
DS. Lê Phương Linh
LỜI CẢM ƠN 3
DANH MỤC BẢNG 9
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 10
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Doxorubicin 2
1.1.1. Đại cương về doxorubicin 2
1.1.2. Tính chất 2
1.1.3. Dược động học 2
1.1.4. Chỉ định 3
1.1.5. Tác dụng không mong muốn 3
1.1.6. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường 3
1.2. Tổng quan về liposome 4
1.2.1. Định nghĩa 4
1.2.2. Phân loại 4
1.3. Liposome PEG hóa 6
1.3.1. Dược động học của liposome truyền thống 6
1.3.2. Liposome gắn PEG và cơ chế tác dụng 7
1.3.3. Các phương pháp bào chế liposome PEG hóa 8
1.4. Những nghiên cứu gần đây 9
1.5. Sơ lược mô hình đánh giá độc tính của thuốc 12
1.5.1. Các dòng tế bào 12
1.5.2. Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào 13
1.6. Sơ lược mô hình đánh giá tác dụng trên khối u động vật thực nghiệm 14
1.6.1. Động vật thực nghiệm 14
1.6.2. Phương pháp đánh giá tác dụng 14
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 15
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 15
chuột cấy dòng tế bào HT29 40
3.6. Bàn luận 41
3.6.1. Về quy trình bào chế liposome DOX PEG hóa ở quy mô 100 lọ/mẻ 41
3.6.2. Về độc tính của liposome DOX PEG hóa trên tế bào 43
3.6.3. Về đánh giá tác dụng của thuốc tiêm liposome dox PEG trên khối u chuột 44
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 1
PHỤ LỤC 5
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Từ viết tắt
Tên đầy đủ
1
Chol
Cholesterol
2
DĐVN
Dược điển Việt Nam
3
DLS
Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động
4
DOX
Doxorubicin
5
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - Môi trường cơ bản
dùng cho nhiều dòng tế bào khác nhau
6
50
50% Inhibitory concentrations – Nồng độ thuốc ức chế 50%
đối tượng thử
16
KTTP
Kích thước tiểu phân
17
KTTB
Kích thước trung bình
18
MPS
Mononuclear Phagocytic System (hệ thực bào đơn nhân)
19
PEG
Polyethylen glycol
20
PDI
Polydispersity Index - Chỉ số đa phân tán
21
RSD
Relative standard deviation – độ lệch chuẩn tương đối
22
SPC
Soy phosphatidylcholin
23
SRB
Sulforhodamine B
24
TCCS
Tên bảng
Trang
Bảng 1.1. Một số chế phẩm doxorubicin trên thị trường
3
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng
15
Bảng 3.1. Chất lượng thuốc tiêm liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml
29
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký
29
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác
31
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ đúng
31
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ đúng
33
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống đo quang
34
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính chính xác
36
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng
36
Bảng 3.9. Tiêu chuẩn cơ sở đề xuất của thuốc tiêm liposome doxorubicin
PEG hóa
37
tích pic.
33
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ phospholipid và độ
hấp thụ quang.
35
Hình 3.8. Khả năng gây độc trên dòng tế bào A549
38
Hình 3.9. Khả năng gây độc trên dòng tế bào HT29
39
Hình 3.10. Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào A549
40
Hình 3.11. Kích thước khối u ở chuột cấy dòng tế bào HT29
40
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Với nhiều ưu điểm và khả năng mang được nhiều loại dược chất, liposome
nhanh chóng trở thành hệ mang thuốc được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên
thế giới. Ứng dụng lớn nhất của liposome là làm chất mang thuốc điều trị ung thư
và đã có nhiều chế phẩm thương mại được bán trên thị trường như với các dược
chất như doxorubicin (Doxil); amphotericin B (Ambisome)…
Ở Việt Nam, việc nghiên cứu bào chế liposome với chất mang là thuốc điều
trị ung thư doxorubicin đã được tiến hành, tuy nhiên mới chỉ bào chế được ở thể
tích nhỏ (vài chục ml) do những khó khăn về thiết bị. Đồng thời, phần lớn các
nghiên cứu đều tiến hành với liposome doxorubicin quy ước, chưa có nghiên cứu
nào đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa. Với mong muốn tăng
quy mô bào chế và đánh giá được tác dụng của liposome doxorubicin PEG hóa,
- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-
((3-amino-2, 3, 6-trideoxy-α-L-
lyxo-hexopyranosyl) oxy) -7, 8,
9, 10-tetrahydro-6, 8, 11- tri
hydroxyl-8-(2-hydroxy acetyl)-
1-methoxy-5, 12-
napthacenedion [5].
- Công thức phân tử:
C
27
H
29
NO
11
.HCl.
- Khối lượng phân tử: 579,99.
3
Thải trừ: 40 – 50% doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 – 7 ngày, 5% bị đào
thải qua nước tiểu trong 5 ngày [20].
1.1.4. Chỉ định
Ung thư vú, u xương ác tính và u xương Ewing, u mô mềm, u khí phế quản,
u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến
giáp. Ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang,
ung thư tinh hoàn. Khối u đặc của trẻ em: Sarcom cơ vân, u nguyên tế bào thần
kinh, u Wilm [1]
1.1.5. Tác dụng không mong muốn
Doxorubicin là hoạt chất có độc tính cao, phụ thuộc đường dùng, liều dùng
và số lần dùng thuốc trong ngày. Các tác dụng không mong muốn thường gặp: rụng
tóc, buồn nôn. Theo Muggia cũng cộng sự, 2 – 3% bệnh nhân gặp phải những triệu
4
Thuốc tiêm
liposome
Caelyx lọ 10 ml, 2 mg/ml
Schering
Phospholipidough
Doxil lọ 10 ml, 2 mg/ml
Sequus pharm (USA)
Lipo-DOX lọ 10 ml, 2 mg/ml
TTYBiopharm
Myocet lọ 10 ml, 2 mg/ml
GP – Pharm
1.2. Tổng quan về liposome
1.2.1. Định nghĩa
Liposome là một hệ mang thuốc gồm một hoặc nhiều lớp lipid kép bao
quanh một khoang chứa nước (Hình 1.2), được hình thành một cách tự nhiên khi
phân tán các phân tử phospholipid trong môi trường nước, khi đó đầu thân nước tự
sắp xếp hướng về phía khoang chứa nước, trong khi đuôi dài kị bị đẩy về hướng
ngược lại tạo thành các hạt có kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng
chục micromet. [23]
Hình 1.2. Cấu trúc liposome [28]
1.2.2. Phân loại
Đặc điểm nổi bật của liposome là rất đa dạng về cấu trúc và chức năng, do đó
có rất nhiều cách phân loại liposome. Cách phân loại phổ biến nhất là dựa trên
thành phần cấu tạo và ứng dụng lâm sàng, gồm có các loại sau [30]:
- Liposome dạng quy ước (conventional liposome)
5
như pH, tác nhân oxy hóa khử, tác nhân phân giải cấu trúc tại môi trường mô bệnh
(tác nhân nội) hoặc có thể là do tác động từ bên ngoài như siêu âm, điện từ trường,
nhiệt độ (tác nhân ngoại) [31],[29].
1.3. Liposome PEG hóa
1.3.1. Dược động học của liposome truyền thống
Liposome sau khi tiêm sẽ tương tác với các thành phần trong máu dẫn đến sự
mất ổn định lớp màng kép làm giải phóng các phân tử bên trong liposome vào máu.
Tương tác đầu tiên là với các protein huyết tương. Các protein khi hấp phụ lên bề
mặt liposome có thể làm tăng tính thấm của màng, làm giảm khả năng lưu giữ thuốc
bên trong. Các protein này được gọi là opsonin và quá trình chúng hấp phụ lên bề
mặt liposome gọi là quá trình opsonin hóa [19]. Quá trình này tạo điều kiện cho các
tế bào của hệ thống lưới nội mô (RES) nhận biết và khởi động quá trình thực bào
liposome nhờ tạo ra các vị trí gắn cho receptor của RES [39]. RES là một phần của
hệ thống miễn dịch có chức năng chính là loại bỏ các tác nhân lạ khỏi cơ thể. RES
bao gồm các tế bào như bạch cầu đơn nhân và đại thực bào, chủ yếu được tìm thấy
trong các tế bào Kruffer ở gan, phổi và lách. Do đó, phần lớn các liposome sau khi
tiêm sẽ được vận chuyển về gan và lách. Các liposome vượt qua được hàng rào trên
sẽ được tích lũy ở đích theo cơ chế chủ động hoặc bị động. Với cơ chế chủ động,
liposome được gắn thêm các yếu tố hướng đích và tích lũy nhờ ái lực với đích.
7
Liposome cũng có thể tích lũy thụ động ở các khối u hoặc các vị trí viêm nhờ hiện
tượng thoát mạch qua các kẽ hở của thành mạch và được giữ lại do giảm sự dẫn lưu
của hệ bạch huyết tại các vị trí này. Hiện tượng này được gọi là hiệu ứng tăng tính
thấm và khả năng lưu giữ (EPR) (Hình 1.4) [30]. Tuy nhiên sự tích lũy thụ động của
liposome tại khối u là quá trình diễn ra tương đối chậm, trong khi các liposome quy
ước nhanh chóng bị thải trừ khỏi hệ tuần hoàn, do đó việc tăng thời gian tuần hoàn
là yêu cầu cần thiết để phát triển hệ mang thuốc dạng liposome.
Hình 1.4. Hiện tượng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ [30]
nước đến độ ổn định của liposome càng lớn, đặc biệt đối với liposome đa lớp thì thể
tích dược chất mang được giảm xuống rất nhiều.
1.3.3.2. Gắn PEG lên bề mặt các liposome đã tạo thành từ trước
Phương pháp này gồm 2 kỹ thuật:
- Gắn vật lý (post – insertion): nguyên tắc của phương pháp này dựa vào khả
năng di chuyển của phân tử lipid từ pha lipid này sang pha lipid khác (hình 1.5b).
Trong phương pháp này, các PEG lipid được thêm từ từ vào hỗn dịch liposome đã
tạo ra từ trước ở nhiệt độ gần với nhiệt độ chuyển pha của lipid màng. Để ngăn cản
quá trình tự hình thành các micel của PEG lipid khi thêm vào pha nước, nồng độ
của chúng được duy trì ở dưới nồng độ micel tới hạn, do đó năng lượng nhiệt động
cần đề tạo micel sẽ thấp hơn so với gắn vào lớp màng của liposome. PEG – lipid sẽ
dần dần chuyển sang gắn với màng liposome, kết quả thu được liposome PEG hóa.
9
Ưu điểm của phương pháp này là PEG chỉ gắn ở mặt ngoài của liposome, không
làm giảm không gian bên trong khoang nước của dược chất. Tuy nhiên phương
pháp này có nhược điểm là khả năng chèn PEG – lipid vào bề mặt liposome phụ
thuộc vào chiều dài chuỗi PEG, chuỗi càng dài càng khó gắn.
- Gắn hóa học (post – modification): nguyên tắc của phương pháp là dựa vào
phản ứng hóa học để tạo liên kết đồng hóa trị giữa PEG đã hoạt hóa với nhóm phản
ứng trên bề mặt liposome. Phương pháp này có nhược điểm là dung môi và điều
kiện phản ứng dễ phá vỡ cấu trúc liposome, khó khăn trong việc tách các chất phản
ứng và sản phẩm phụ,… do đó ít được sử dụng hơn.
Hình 1.5. Các phương pháp gắn PEG [26]
1.4. Những nghiên cứu gần đây
Wan-Liang Lu và cộng sự (2004) [24] đã nghiên cứu dược động học, dược
lực học, và độc tính của liposome PEG hóa trên tế bào hepatocarcinoma (Bel7402)
và tế bào hepatocarcinoma chuột (H22) trên mô hình khối u rắn ở chuột xenograft.
Kết quả dược động học ở chuột cho thấy liposome doxorubicin PEG hóa kéo dài rõ
cả sóng siêu âm và DOX có thời gian sống trung bình tăng đáng kể so với mẫu động
vật chỉ nhận được 1 trong 2 phương pháp siêu âm hay DOX, hay không nhận được
phương pháp điều trị nào. Thời gian sống trung bình của động vật mẫu điều trị bằng
cả 2 (siêu âm và DOX) tăng 100% so với động vật không được điều trị, trong khi
động vật được điều trị bằng DOX chỉ tăng 16%. Động vật chỉ được điều trị bởi siêu
âm không cho thấy sự tiến triển nào. Không 1 khối u nào được phát hiện trong 4/8
11
nhóm động vật thuộc nhóm điều trị siêu âm + DOX, và trong 2 nhóm động vật còn
lại, chỉ phát hiện rất ít tế bào ung thư. Tóm lại, nghiên cứu chứng minh rằng sử
dụng kết hợp sóng siêu âm và liposome doxorubicin tăng cường khả năng cung cấp
thuốc và có ảnh hưởng tốt tới quá trình điều trị bệnh u thần kinh đệm.
Kenji Yokoi và cộng sự (2014) [40] đã nghiên cứu phương pháp sử dụng
liposome doxorubicin PEG hóa để tăng tích lũy thuốc tại khối u và nâng cao hiệu
quả điều trị. Mặc dù doxorubicin dạng liposome PEG hóa (PEGylated liposomal
doxorubicin – PLD) có thể tốt hơn doxorubicin dạng tự do vì sự tích lũy của PLD
tại khối u nhờ hiệu ứng tăng tính thấm và khả năng lưu giữ (EPR), tuy nhiên việc
tăng tỉ lệ sống sót ở những bệnh nhân được điều trị tổng thể với PLD khá khiêm
tốn. Khi các tế bào nội mô khối u bị tổn thương do PLD, tính thấm thành mạch đối
với các đại phân tử có thể được gia tăng lên do sự hình thành các lỗ lớn và sự gián
đoạn của các lớp tế bào nội mô. Sự tổn thương tế bào nội mô và sự gia tăng tính
thấm thành mạch sẽ được dần dần khôi phục bằng các phản ứng tạo mạch của các
mạch máu. Do đó, tác giả đưa ra giả thuyết rằng PLD được tiêm ngay trong khoảng
thời gian khi tính thấm thành mạch tăng do liều điều trị ban đầu, sẽ thoát mạch và
tích lũy nhiều hơn vào khối u so với PLD được tiêm sau khi các mạch khối u đã hồi
phục. Chuột sau khi cấy tế bào ung thư vú 4T1 được tiêm tĩnh mạch với PLD. Để
đánh giá hiệu quả của PLD trên hiệu ứng EPR, FITC-liposome PEG hóa (PFL)
được tiêm trước 1, 2, 3, 5, 7, hoặc 10 ngày sau khi tiêm PLD. Chuột tại mỗi sáu giờ
sau khi tiêm PFL bị giết, số lượng PFL thoát mạch và tích tụ trong khối u cũng như
các cơ quan được đánh giá bằng hình ảnh miễn dịch huỳnh quang của các mô.
đề xuất và thẩm định tại Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương. Đánh giá tác dụng
của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ưu thế vượt trội của thuốc tiêm
dạng liposome so với dạng dung dịch đặc biệt trên khối u dưới da [5].
1.5. Sơ lược mô hình đánh giá độc tính của thuốc
1.5.1. Các dòng tế bào
Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đã di căn) đều xuất
phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành. Do đó ung thư có thể được phân
loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào đó. Tuy nhiên, trong nhiều
13
trường hợp, người ta không xác định được khối u nguyên phát. Các tế bào thử được
chia thành 4 nhóm chính: Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu
mô (ví dụ như ở ống tiêu hóa hay các tuyến tiêu hoá); Bệnh lý huyết học ác tính
(hematological malignancy), xuất phát từ máu và tủy xương; ung thư mô liên kết
(sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xương hay cơ; ung thư hắc tố
(melanoma) do rối loạn của tế bào sắc tố.
1.5.2. Phương pháp đánh giá độc tính trên tế bào
Với các tác nhân chống ung thư, chỉ số điều trị được đánh giá dựa vào hiệu
quả điều trị và độc tính. Liposome doxorubicin PEG hóa là một dạng thuốc cải tiến
với mục tiêu tăng hoạt động diệt tế bào ung thư, giảm độc tính, tăng thời gian lưu
thông trong hệ thống tuần hoàn. Để đánh giá khả năng ức chế tế bào ung thư, cần
tiến hành đánh giá độc tính trên tế bào. Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường,
nhiệt độ, thời gian thích hợp. Sau đó mang đánh giá độc tính của thuốc bằng các
phương pháp khác nhau. Có rất nhiều phương pháp đánh giá độc tính tế bào khác
nhau, một số phương pháp thường dùng:
- Thứ nghiệm SRB (sulforhodamine B) : Phép thử tiến hành xác định tổng hàm
lượng protein tế bào dựa vào mật độ quang học (OD-Optical Density) đo được khi
protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). SRB là một thuốc
nhuộm màu hồng sáng với hai nhóm sulfonic tích điện âm, hai nhóm này sẽ liên kết
tĩnh điện với các phần tích điện dương của protein. Giá trị OD máy đo được tỉ lệ
tiến hành bằng cách ghép khối u hoặc tiêm hỗn dịch của tế bào u từ cơ thể chuột đã
mang u sẵn sang cơ thể chuột thực nghiệm. Số lượng tế bào mang cấy khoảng 10
5
–
10
7
/động vật. Sau đó, chuột được chia thành các nhóm để tiến hành điều trị bằng
các công thức khác nhau. Liều tiêm tùy thuộc từng thí nghiệm. Thời điểm bắt đầu
tiến hành cũng rất khác nhau tùy từng thí nghiệm, có thể điều trị ngay sau khi cấy
truyền tế bào thành công, cũng có thể để khối u phát triển một cách chắc chắn.
15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Liposome DOX PEG hóa.
2.1.2. Nguyên vật liệu
Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu được sử dụng.
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu
chuẩn
1
Doxorubicin hydroclorid
Ấn Độ
USP
2
Cholesterol
TKHH
9
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether)
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
10
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ
TCCS
11
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
12
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH
13
Methanol
Merk – Đức
USP
14
Acetonitril
Merk – Đức
USP
Copyright: Tài liệu đại học ©