BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
DIOSGENIN TỪ NẦN VÀNG
BẰNG DUNG MÔI SIÊU TỚI HẠN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

VƯƠNG MINH VIỆT
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VƯƠNG MINH VIỆT

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT

viên Bộ môn Công Nghiệp Dược và Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc gia đã giúp đỡ
tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi tới toàn thể giảng viên, cán bộ trường Đại học
Dược Hà Nội lời cảm ơn chân thành vì sự dạy bảo, dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học tập
tại trường.
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè,
những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó khăn
nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận.

Hà Nội, ngày 7 tháng 4 năm 2015
Sinh viên
Vương Minh Việt MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn 2
1.1.1. Khái niệm 2
1.1.2. Thiết bị và nguyên tắc hoạt động 5
1.1.3. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới
hạn 7
1.1.4. Ứng dụng 7
1.2. Tổng quan về diosgenin 8
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8
1.2.2. Công dụng của diosgenin 9
1.3. Tổng quan về cây Nần vàng 9

3.3.1. Đồng dung môi 32
3.3.2. Áp suất chiết xuất 34
3.3.3. Nhiệt độ chiết xuất 36
3.3.4. Thời gian chiết xuất 38
3.4. Tinh chế dịch chiết 39
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 41
4.1. Về khảo sát ảnh hưởng các thông số tới quá trình chiết xuất 41
4.2. Về quy trình tinh chế dịch chiết. 42
KẾT LUẬN 43
KIẾN NGHỊ 44 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

AOAC

Hiệp hội cộng đồng phân tích chính thức.
K
c

Điểm tới hạn.
T
c
Nhiệt dộ tới hạn.
P
c
Áp suất tới hạn.
sCO
2
CO

4
Bảng 1.2
So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu
tới hạn
4
Bảng 1.3
Các sapogenin trong thân rễ Nần vàng
11
Bảng 1.4
Các hợp chất saponin thu được từ dịch chiết ethanol của Nần
vàng
12
Bảng 2.1
Tên, tiêu chuẩn và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí
nghiệm
16
Bảng 3.1
Kết quả đánh giá độ thích hợp hệ thống
24
Bảng 3.2
Kết quả đánh giá độ tuyến tính
25
Bảng 3.3
Độ lệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
27
Bảng 3.4
Độ thu hồi của phương pháp
28
Bảng 3.5
Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp

Hình 1.2
Mặt phân chia giữa thể lỏng và thể khí của CO2 biến mất khi
đạt đến điểm tới hạn.
3
Hình 1.3
Sơ đồ thiết bị chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn.
5
Hình 1.4
Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp).
6
Hình 3.1
SKLM 6 vết diosgenin chuẩn bước sóng 366nm
25
Hình 3.2
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính giữa diện tích
Peak và lượng chất trên vết.
26
Hình 3.3
Peak sắc ký ứng với vết diosgenin chuẩn
29
Hình 3.4
Peak sắc ký ứng với vết diosgenin trong dung dịch thử
29
Hình 3.5
Peak diosgenin chuẩn.
30
Hình 3.6
Peak diosgenin trong dung dịch pha từ cắn chiết.
30
Hình 3.7

này có mặt trong nhiều họ thực vật, song chỉ có họ Dioscoreaceae (chi Dioscorea) thì
mới có giá trị thực tế trong việc khai thác chiết xuất diosgenin [14].
Tại Việt Nam, Nần vàng (Dioscorea collettii Hoof.f.) được đánh giá có triển
vọng làm nguồn nguyên liệu chiết xuất diosgenin [10]. Việc chiết xuất diosgenin từ
thân rễ Nần vàng trong các nghiên cứu trước đây được thực hiện bằng cách chiết với
dung môi hữu cơ chloroform. Nhưng trong công nghiệp vấn đề phát sinh với kỹ thuật
này là phải loại bỏ dung môi hữu cơ từ các sản phẩm cuối cùng, xử lý chất thải, độc
tính của chloroform còn lẫn trong sản phẩm…. Do đó, phương pháp chiết diosgenin
một cách nhanh chóng, rẻ tiền và ít độc tính là một yêu cầu cấp thiết. Chiết xuất bằng
dung môi siêu tới hạn (Supercritical fluild extraction) có nhiều lợi thế hơn các phương
pháp tách chiết dung môi lỏng truyền thống như: tính chọn lọc được cải thiện và thân
thiện với môi trường. Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là một sự thay thế cần
thiết cho việc sử dụng các dung môi hữu cơ thông thường.
Đề tài “Nghiên cứu chiết xuất diosgenin từ Nần vàng bằng dung môi siêu
tới hạn” được thực hiện với những mục tiêu sau:
1. Xây đựng được phương pháp định lượng diosgenin bằng sắc ký lớp mỏng.
2. Chiết xuất được diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn
và khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất
diosgenin từ thân rễ Nần vàng bằng dung môi siêu tới hạn.
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đại cương về phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn
1.1.1. Khái niệm
Chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn là quá trình chiết rắn – khí trong đó dung
môi là chất khí ở điều kiện siêu tới hạn. Độ nhớt thấp và sức căng bề mặt gần như bằng
không, cho phép dung môi siêu tới hạn thấm vào dược liệu sâu hơn và nhanh hơn so

biến mất khi đạt đến điểm
tới hạn.
Trong đó giai đoạn:
1. Ranh giới giữa 2 pha lỏng - khí dễ dàng quan sát.
2. Khi gia tăng nhiệt độ ranh giới giữa hai pha bắt đầu mờ đi nhưng vẫn dễ dàng
quan sát được
3. Khi đạt được áp suất tới hạn, nhiệt độ tới hạn thì không còn sự phân cách giữa
hai pha, ranh giới giữa hai pha cũng không tồn tại. Hình thành một pha đồng
nhất gọi là pha siêu tới hạn.
Tính chất của dung môi siêu tới hạn
Ở trạng thái siêu tới hạn: Tỉ trọng của dung môi thay đổi theo áp suất và nhiệt độ.
 Tỉ trọng càng nhỏ nó càng giống với một chất khí, tỉ trọng càng tăng nó càng
giống với một chất lỏng.
 Ở nhiệt độ hằng định, tỉ trọng dung môi tăng mạnh theo áp suất, các phần tử
dung môi bị nén lại gần nhau hơn và khả năng hòa tan tăng lên.
 Các tính chất khác ví dụ độ nhớt, hằng số điện môi cũng thay đổi theo áp suất
và nhiệt độ.

4

Bảng 1.1 Điểm tới hạn của một số dung môi [1]
Dung môi
Phân tử lượng
(g/mol)
Nhiệt độ tới
hạn (
o
C)
Áp suất tới
hạn (bar)

58,08
508,1
46,4
0,278

Bảng 1.2 So sánh các đặc tính của chất ở 3 trạng thái lỏng, khí và siêu tới hạn
Đặc tính vật lí
Khí
Siêu tới hạn
Lỏng
Tỷ trọng ρ (kg.m
-3
)
0,6 - 2
200 - 500
600 - 1600
Độ nhớt (g/cm/s)
10
-4
10
-4

10
-2

Hệ số dẫn nhiệt λ (W/mK)
0,01 - 0,025
Maximum
b
0,1-0,2

Bình
tách

Bình
chiết
Làm
lạnh
Bơm
Làm
nóng

Điều
chỉnh
P, t
0
C
Bình ngưng tụ
(CO
2
lỏng)
1.1.2. Thiết bị và nguyên tắc hoạt động
Quá trình chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn được thực hiện trong điều kiện
thay đổi áp suất và nhiệt độ. Thiết bị chiết xuất phải được trang bị bộ phận điều chỉnh
áp suất và nhiệt độ ở cả bình chiết và bình tách.

- Dung môi dạng khí được tách ra rồi quay trở lại máy nén để lặp lại chu kì chiết
tiếp theo.
- Hệ thống có thể chứa nhiều bình chiết, nhiều bình tách với các áp suất tách khác
nhau.
Một số lưu ý:
 Xử lí mẫu chiết: Trong vài trường hợp đặc biệt, mẫu cần chiết có thể được điều
chỉnh pH, hoặc thêm dung môi hoặc làm thấm ướt. Nếu hợp chất có tính phân
cực, một lượng nhỏ nước được thêm vào để làm thấm ướt mẫu cần chiết giúp
việc chiết xuất thêm dễ dàng. Nếu hợp chất chiết có tính không phân cực, một
lượng dầu nhỏ hoặc chất béo trộn thêm vào mẫu chiết.
 Chất cho thêm: CO
2
chỉ phù hợp để chiết xuất các hợp chất có độ phân cực kém
cho đến trung bình. Nếu muốn chiết xuất các chất có tính phân cực cao, cần bổ
sung thêm methanol, ethanol hoặc methylen clorid. Hình 1.4: Hệ thống máy chiết xuất siêu tới hạn SEPAREX (Pháp)
7

1.1.3. Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp chiết xuất bằng dung môi siêu tới
hạn
Ưu điểm
- Độ nhớt thấp, khả năng khuếch tán tốt, khả năng hòa tan cao; áp suất hơi cao,
điểm siêu tới hạn của CO
2
dễ đạt. CO
2
là dung môi chiết rẻ tiền, không độc hại
và không ô nhiễm.
trên, người ta sử dụng công nghệ chiết xuất bằng sCO
2
để loại bỏ, hạ thấp hàm lượng
cafein xuống < 0,1% mà vẫn giữ nguyên hương vị tự nhiên ban đầu [1].
 Chiết xuất các dầu thực vật:
Công nghệ chiết xuất siêu tới hạn sử dụng sCO
2
đã khắc phục được những nhược
điểm về nhiệt độ cao của phương pháp truyền thống. Sang Yo Byun đã chiết được dầu
hạt vừng đen (Sesamum indicum L.) công suất 15.000 tấn/năm. Sản phẩm thu được có
hàm lượng alpha tocopherol cao hơn hẳn so với sử dụng công nghệ chiết xuất truyền
thống [29].
 Chiết xuất tinh dầu, chất thơm trong dược liệu:
Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này là hiệu suất chiết cao và chất lượng sản
phẩm tốt hơn so với phương pháp cất kéo hơi nước hoặc dùng dung môi hữu cơ.
1.2. Tổng quan về diosgenin
1.2.1. Công thức hóa học, tính chất lý hóa
Công thức cấu tạo  Diosgenin là một sapogenin steroid. Được sản xuất thông qua thủy phân saponin
bằng acid, base mạnh hoặc các enzyme.
 Tỷ trọng: 1,13g/cm
3
.

 Nhiệt độ nóng chảy: 205-208
o

pregnenolon, prednisolon, estrogen, testosteron, hydrocortison, dexamethason,
betamethason.
Diosgenin là một trong những nguyên liệu chính để tổng hợp thuốc chống viêm
corticosteroid giúp kháng viêm, lành sẹo các bệnh như phát ban, zona… Diosgenin
còn chống oxy hóa ở cơ thể người, giảm mức lipid huyết thanh, ức chế sự phát triền
và ngừng chu kỳ hoạt động của các tế bào u xương ác tính, ung thư biểu mô tế bào
gan [28], [27].
Theo một số nghiên cứu diosgenin làm giảm cholesterol trong gan chuột, tăng
bằng biết cholesterol thành acid mật và tăng bài tiết của các sterol trung tính [16],
[17],[22].
1.3. Tổng quan về cây Nần vàng
1.3.1. Vị trí phân loại
Vị trí phân loại của Nần vàng trong hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan
1987 [2].
Ngành ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp hành (Liliopsida)
Phân lớp hành (Liliidae)
Bộ củ nâu (Dioscoreales)
Họ củ nâu (Dioscoreaceae)
Chi Dioscorea
Dioscorea collettii Hook.f
 Tên khoa học của vị thuốc: Dioscorea collettii Hook.f [4].
 Tên khác: Nần vàng, nần vàng, râu hùm [4], [7].

1.3.2. Đặc điểm thực vật
10

Địa thực vật, thân vặn, quấn trái, không có lông, đôi khi có lông màu vàng dày
và ngắn [28]. Thân rễ mọc ngang, phân nhiều nhánh ngắn hình dạng giống gừng,
chiều dài đa dạng, dày khoảng 2cm, lõi màu vàng, rễ mảnh dạng sợi [28].


Bảng 1.3: Các sapogenin trong thân rễ Nần vàng [24].
STT
Tên chất
Công thức cấu tạo
1
Diosgenin 2
Yamogenin
3
β – sitosterol

4
Dihydroxysterol

5
∆
3,5
–
deoxyneotigogen

6
∆
3,5
-
deoxyneotigogenin
2: R
1
=R
3
=α-L-Rha, R
2
=H
3: R
1
=α-L-Rha, R
2
=β-D-Glc, R
3
=H
2
Dioscin
3
Gracillin
4
Proromeodioscin

5
Protodioscin
6
Protoneogracillin
7
Protogracillin
8
Methyl
protoneodioscin

Cao Nần vàng có tác dụng hạ Cholesterol khá rõ rệt trên mô hình gây tăng
cholesterol thực nghiệm. Tất cả các chỉ số lipid máu đều trở về trị số bình thường.
Điều đáng lưu ý là Nần vàng hạ cholesterol, đặc biệt hạ rất mạnh LDL, trong đó lại
có xu hướng tăng HDL (40 ± 2,1 đến 36 ± 2,5 với p< 0,05), do đó hạ được chỉ số
cholesterol/HDL (4,3 đến 3,2) [9].
Thử nghiệm Diosgin cho khoảng 200 người bệnh, kết quả xét nghiệm sinh hóa
trên 5 chỉ tiêu về lipoprotein trong máu (triglycerid, cholesterol toàn phần, LDL,
HDL và Cholesterol toàn phần / HDL) cho thấy Diosgin cho tác dụng tốt, trong quá
trình điều trị không thấy có tai biến, tác dụng phụ nào [6].
c. Tác dụng chống viêm
Cao Nần vàng với liều 300mg/kg cho chuột bị gây viêm bằng dextran uống 3
lần (24 giờ, 3 giờ, 30 phút trước khi gây viêm) có tác dụng giảm viêm rõ rệt, tác
dụng này tương đương với prednisolon liều 70mg/kg uống 1 lần 30 phút trước khi
gây viêm [9].
Nần vàng cũng được sử dụng để chống viêm trong đau do viêm khớp, được
khuyến cáo như 1 biện pháp khắc phục để chống viêm khớp, tăng lưu thông máu,
giãn cơ, rất hữu dụng trong đau do thấp khớp và tê chân tay. Ngoài ra nó còn được
sử dụng như 1 chất chống viêm cho các tổn thương ngoài da, bao gồm cả eczema
[15].
d. Tác dụng gây giãn cơ trơn
Cao Nần vàng gây giãn cơ trơn của mạch và ruột [8].
 Trên ruột thỏ cô lập:
Liều 0,1; 0,2; 0,3ml dung dịch cao Nần vàng 5% nhỏ vào 50ml dịch nuôi ruột
gây giãn rõ rệt. Tác dụng hết sau 10-15 phút. Liều 0,5ml trở lên gây giãn không
hồi phục.
 Trên mạch tai thỏ cô lập:
Liều 0,1-0,2ml dung dịch cao Nần vàng 5% (được truyền lẫn vào dòng chảy
của dung dịch nuôi tai) gây tăng rõ rệt số giọt chảy (gấp 3-4 lần). Tác dụng hết
sau 10-15 phút. Liều 0,5 ml trở lên gây giãn mạch, nhiều trường hợp giãn không
hồi phục [8].

chỉ thống, khu phong trừ thấp. Cây được dùng trị đau khớp xương do phong thấp,
đau lưng gối, cảm nhiễm đường tiết niệu, bạch đới, rắn độc cắn [4].
Cao của thân rễ có tác dụng chống viêm và làm giảm cholesterol trong máu [3].
16

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG,
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Nguyên liệu
Thân rễ Nần vàng được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60
o
C.
2.1.2. Hóa chất
Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc của các hóa chất dùng trong thí nghiệm
STT
Tên hóa chất
Nguồn gốc
1
Diosgenin chuẩn 99,3%
Viện kiểm nghiệm
2
n-hexan
Trung Quốc
3
Ethanol 96%
Việt Nam
4
Aceton
Trung Quốc
5

Dụng cụ
 Bình nón: 100ml.
 Ống đong : 100ml, 500ml.
 Bình định mức 10ml.
 Cốc có mỏ 100ml, 250ml, 500ml.
 Pipet: 1ml, 10ml.
 Phễu lọc.
 Bản mỏng silicagel 60 F
254.

 Mao quản chính xác 5 µL.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết xuất diosgenin
a) Chuẩn bị dược liệu
Thân rễ Nần vàng sau khi thu hoạch, rửa bằng nước cho sạch, loại bỏ rễ con,
thái thành lát mỏng, sấy tới khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 60
o
C (chú ý: Tránh sấy ở
nhiệt độ trên 70
o
C vì sẽ khiến hàm lượng diosgenin bị giảm mạnh [12]). Xay nhỏ
dược liệu khô ta thu được bột dược liệu Nần vàng.
Thủy phân bột dược liệu Nần vàng:
. Cân 1kg bột dược liệu Nần vàng vừa thu được, cho vào bình cầu cỡ lớn, có gắn
ống sinh hàn, thêm vừa đủ dung dịch acid H
2
SO
4
10% qua ống sinh hàn cho ngập
dược liệu, đun hồi lưu trong 4 giờ. Để nguội bình phản ứng, lấy bột dược liệu sau