BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
CAO THỊ THƢƠNG
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ETHYL-P-METHOXYCINNAMAT
TỪ ĐỊA LIỀN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI CAO THỊ THƢƠNG
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
ETHYL-P-METHOXYCINNAMAT
TỪ ĐỊA LIỀN
Sinh viên
Cao Thị Thƣơng MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1 Tổng quan về cây Địa liền 2
1.1.1 Vị trí phân loại 2
1.1.2 Đặc điểm thực vật 3
1.1.3 Phân bố và sinh thái 3
1.1.4 Cách trồng 4
1.1.5 Bộ phận dùng 5
1.1.6 Thành phần hóa học 5
1.1.7 Tác dụng dược lí 6
1.1.8 Tính vị, công năng 7
1.1.9 Công dụng 7
1.2 Tổng quan về Ethyl-p-methoxycinnanat 8
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa 8
1.2.2 Công dụng của Ethyl-p-methoxycinnamat 9
1.2.3 Các phương pháp chiết xuất EPMC từ Địa liền 11
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 13
2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị 13
13
C-NMR
:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13
DĐVN
:
Dƣợc điển Việt Nam
ESI-MS
:
Electro Spray Ionization - Mass spectrometry
(Khối phổ - Ion hóa bằng phƣơng pháp phun mù điện tử)
EPMC
:
Ethyl-p-methoxycinnamat
1
H-NMR
:
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton
HPLC
:
High Performance Liquid Chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
IR
:
Infrared (Hồng ngoại)
MAO
:
Monoaminoxydase
MITF
:
C NMR và
1
H NMR 27
Bảng 3.4 Kết quả của phƣơng pháp Soxhlet bằng 2 dung môi n-hexan và ethyl
acetat 30
Bảng 3.5 Bảng so sánh các phƣơng pháp nghiên cứu chiết xuất EPMC từ Địa
liền 30
MỤC LỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1 Sơ đồ phƣơng pháp nghiên cứu 16
Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nƣớc 17
Hình 2.3 Bộ chiết Soxhlet 18
Hình 3.1 Mẫu cây tƣơi Địa liền 21
Hình 3.2 Đƣờng chuẩn thể hiện mối liên quan tuyến tính 23
Hình 3.3 Công thức cấu tạo của EPMC 26 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nƣớc Việt Nam ta đƣợc thiên nhiên ƣu đãi với những cánh rừng nguyên
sinh chạy dọc đất nƣớc. Thống kê có hơn 5000 loại cây thuốc trong đó có nhiều
cây có tiềm năng rất to lớn trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ nhân dân.
Trong hệ thống đa dạng và phong phú cây thuốc Nam, Địa liền đƣợc xem là một
cây thuốc quý đƣợc dân gian, cộng đồng sử dụng nhiều để dùng chữa ngực bụng
lạnh đau, tiêu chảy, thuốc kiện vị, giúp tiêu hóa chữa chứng ăn uống khó tiêu,
đau dạ dày, cảm, ho, nôn mửa, hen suyễn và một số tác dụng khác [2].
Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 -3,9% tinh dầu. Thành phần chủ yếu là
acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và ethyl-p-methoxycinnamat [2]. Trong
Phân lớp Gừng (Zingiberidae )
Bộ
Bộ Gừng (Zingiberales)
Họ
Họ Gừng (Zingiberaceae)
Phân họ
Phân họ Gừng (Zingiberoideae)
Chi
Chi Địa liền (Kaempferia)
Loài
Kaempferia galanga L.
Tên khoa học của vị thuốc: Rhizoma Kaempferia [3], [6].
Tên đồng nghĩa: Kaempferia rotunda Ridl [3].
Tên khác: sơn nại, tam nại, thiền liền, sa khƣơng, faux galanga,
co xá choóng (Thái) [1], [3], [4], [5], [6]. 3
1.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây thảo, sống lâu năm, không có thân. Thân rễ gồm nhiều củ nhỏ, hình
trứng mọc nối tiếp nhau, có nhiều vân ngang. Lá, 2-3 cái hình trứng gần tròn,
xòe rộng sát mặt đất, đầu tù rồi thuôn nhọn, gốc thuôn hẹp thành một cuống
ngắn rộng có rãnh, mặt trên nhẵn bóng, mặt dƣới hơi có lông mịn, mép lông
màu đỏ, hai mặt có nhiều chấm hình vòng tròn, phiến lá dài 8-10 cm, rộng 6-7
cm [1], [6].
Cụm hoa không cuống, nằm ẩn trong bẻ lá; lá bắc hình mũi mác nhọn;
hoa 6-12 cái, xếp thành hình bánh xe, màu trắng có đốm tím ở giữa; đài có 3
răng dài, hẹp và nhọn; tràng có ống dài, mang 3 thùy; nhị không có chỉ nhị, bao
mạnh. Chỉ cần một nhánh nhỏ cũng có thể mọc thành cây. Tuy nhiên, để đảm
bảo năng suất, cần chọn những nhánh củ chƣa mọc thành cây, có đƣờng kính
1,5-2 cm, không bị nhiễm bệnh, không dập nát.
Địa liền trồng đƣợc trên nhiều loại đất, nhƣng phải tơi xốp, cao ráo, thoát
nƣớc, đủ ánh sáng. Cây hơi chịu bóng nên có thể trồng xen với các cây khác. Ở
các vƣờn gia đình, trong điều kiện bị che bóng một phần, cây vẫn sinh trƣởng
tốt. Đất cần làm cho nhỏ, để ải, vơ sạch cỏ, bón phân lót, lên luống rồi trồng. Củ
Địa liền ăn nông trên mặt đất nên luống chỉ cần cao 20 - 30 cm. Mặt luống rộng
hay hẹp tùy theo việc chăm sóc. Trung bình, mỗi hécta dùng 20 - 25 tấn phân
chuồng hoai mục, 250 kg supe lân, 150 kg kali và có thể thêm 3 -5 tạ tro bếp để
bón lót. Riêng đối với kali bón lót một nửa và một nửa để bón thúc. Phân có thể
bón lót theo hốc, theo hàng hay trộn đều với đất trên mặt luống. Mầm đƣợc
trồng với mật độ 15×20 hoặc 20×20 (cm) phủ đất dày 1-2 cm, cho trấu hoặc rơm
rạ lên trên rồi tƣới nƣớc giữ ẩm hàng ngày. Mỗi hecta cần 1,5- 2 tấn củ giống.
5
Thời kì đầu, cần xới xáo nhẹ để giữ cho mặt luống thông thoáng. Từ
tháng 5 đến tháng 8, dùng nƣớc phân, nƣớc giải hoặc đạm pha loãng để bón thúc
cho cây, cứ 25 - 30 ngày bón một lần.
Địa liền ít bị sâu bệnh. Tuy nhiên, cần đặc biệt lƣu ý thoát nƣớc sau mƣa.
Cây bị úng dễ thối cả củ.
Sau tháng mƣời hai, cây bắt đầu tàn lụi. Lúc này có thể thu hoạch củ
hoạch để đến tháng giêng. Củ đào về, rửa sạch, thái nhỏ, sấy lƣu huỳnh qua một
đêm rồi phơi hoặc sấy nhẹ đến khô. Năng suất củ tƣơi đạt trung bình 15- 20
tấn/ha. Tỷ lệ tƣơi/ khô dao động trong khoảng 3,5- 4 [1].
1.1.5 Bộ phận dùng
Thân rễ, thu hái vào mùa đông xuân, rửa sạch phơi khô hoặc sấy [1].
1.1.6 Thành phần hóa học
Thân rễ Địa liền khô chứa 2,4 -3,9% tinh dầu. Thành phần chủ yếu là
acid p-methoxycinamic, ethyl cinamat và p-methoxy ethylcinamat. Hợp chất p-
liền không thể hiện tác dụng giảm đau kiểu morphin [1].
- Tác dụng chống viêm
Trên mô hình gây phù bàn chân chuột cống trắng bằng cách tiêm nhũ dịch
kaolin 10%, Địa liền có tác dụng chống viêm rõ rệt, dạng cao cồn với liều
10g/kg thể trọng ức chế viêm 63,8%, dạng cao nƣớc với liều 10g/kg thể trọng
cũng ức chế viêm 60%. Tinh dầu và dạng tinh thể chiết từ Địa liền cũng có tác
dụng chống viêm tƣơng tự [1].
“Kapurkachari” là một loại thuốc Ayurvedic (thảo dƣợc Ấn Độ) nổi tiếng
với việc điều trị các bệnh khác nhau nhƣ ho, viêm loét, Ngoài ra, chúng còn
đƣợc sử dụng để chữa đầy hơi, chƣớng bụng và dùng làm mỹ phẩm, bao gồm
thân rễ của ba cây cụ thể là: Hedychium spicatum Buch. Ham. ex Smith.,
Kaempferia galanga Linn. và Curcuma zedoaria Rosc. (nghệ đen). Tất cả ba
cây trên đều thuộc một phân lớp Scitaminae, họ Zingiberaceae. Tất cả các cây
này đều chứa các loại tinh dầu, nhựa, tinh bột nhƣ phytoconsituents. Trong số
ba cây, hoạt động chống viêm của hedychium spicatum đƣợc nghiên cứu chi
tiết hơn cả. Trong khi hai cây khác cũng đƣợc bán tại các thị trƣờng dƣới tên
thƣơng mại, ngƣời ta nghĩ đến việc đánh giá để xác định hiệu quả chống viêm
7
của các loại thuốc Thí nghiệm đã chứng tỏ rằng dịch chiết ethanol của tất cả ba
thân rễ ức chế sự hình thành phù nề chân có ý nghĩa trong điều trị cấp với tác
nhân carageenan gây phù nề ở chuột. Hedychium spicatum ức chế 55,54%,
Kaempferia galanga 50,98% trong khi Curcuma zedoaria là 39,78%. Kết quả
cho thấy rằng, dịch chiết ethanol của Kapurkachari có khả năng kháng viêm
mạnh, có thể ức chế đợt viêm cấp tính ở chân chuột gây ra bởi carageenan [8].
- Tác dụng hạ sốt
Trên thỏ gây sốt thực nghiệm bằng pyrogen chuẩn (natri nucleinat). Địa
liền với liều 5g/kg bằng đƣờng uống, 2 giờ sau khi dùng thuốc, làm hạ sốt 0,4 –
0,5
0
[6].
Ngoài ra, tinh dầu Địa liền để chế nƣớc hoa, mỹ phẩm, làm vị điều hƣơng
trong thực phẩm. Bột Địa liền có tác dụng bảo vệ quần áo chống nhậy cắn.
Ở Philippin, nƣớc sắc Địa liền chữa ăn uống khó tiêu, sốt rét. Lá Địa liền
giã nát hơ nóng, đắp chữa tê thấp. Ở Malaysia, thân rễ Địa liền đƣợc dùng chữa
cao huyết áp, lở loét, hen suyễn. Lá và thân rễ nhai ngậm chữa ho và đau họng.
Thân rễ dùng riêng chữa cảm lạnh. Một vài nơi dùng lá và thân rễ Địa liền làm
rau ăn sống [1].
1.2 Tổng quan về Ethyl–p-methoxycinnanat
1.2.1 Công thức hóa học, tính chất lý hóa
9
Công thức cấu tạo:
Danh pháp hóa học: ethyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat; ethyl(E)-4-
methoxycinnamat; ethyl-4-methoxycinnamat; ethyl-p-methoxycinnamat; (E)-3-
(4-methoxyphenyl)-2-propenoic acidethyl ester; 3-(4'-methoxyphenyl)-(E)-
propenoic acid ethyl ester; (E)-3-(4-methoxyphenyl) propenoic acid ethyl ester.
Tên IUPAC: ethyl 3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoat.
Chỉ số CAS: 24393-56-4.
Công thức phân tử : CH
3
OC
6
H
4
CHCHC(O)OC
2
H
= 31.59 μmol/l, tế bào gây ung thƣ phổi A-549 ở ngƣời với IC
50
=
50.35 μmol/l [17], [9].
10
- Ức chế 1 số loại nấm: Candida albicans [21], Trichophyton rubum, Trichophyton
mentagrophytes, Microsporum gypseum…[9]; vi khuẩn: Mycobacterium tuberculosi…[13].
- Ức chế 1 số loại enzym: COX1, COX2 [21], MAO [16], nấm men bánh
mì α-glucosidase…[7].
- Ức chế tổng hợp melamin do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da melamin:
α-melanocyte stimulating hormon (α-MSH), tyrosinase. Ngoài ra, EPMC cấu tạo
hóa học có chứa nhân thơm và nối đôi dễ bị oxy hóa có khả năng hấp thụ UV-
VIS. Vì vậy, EPMC là thành phần hay đƣợc sử dụng trong kem chống nắng và
làm trắng da [22], [12], [9].
- Cảm ứng enzym gan cytP450s: CYP1A và CYP2B [19].
Trong đó, nổi bật là tác dụng chống viêm tƣơng tự NSAIDs do ức chế
COX và tác dụng làm trắng da, chống nắng do ức chế enzym tổng hợp sắc tố da
melamin – tyrosinase và có khả năng hấp phụ UV-VIS.
Trong một nghiên cứu invitro chống viêm, EPMC đã đƣợc tìm thấy để ức
chế cả COX-1 và COX-2 không chọn lọc. Tuy nhiên, sự ức chế COX-2 là rõ rệt
hơn (57,82%) so với COX-1 (42,9%). Indomethacin là một chất ức chế COX
không chọn lọc, chống viêm bằng cách ức chế cả COX-1 và COX-2. Tuy nhiên,
indomethacin đã đƣợc ghi nhận là có tác dụng ức chế trên COX-1 là tƣơng đối
mạnh và sâu sắc hơn tác động của nó trên COX-2. Ví dụ, trong một nghiên cứu
trƣớc đây, IC
50
của indomethacin đã đƣợc tìm thấy là 18 ± 3 nM cho COX-1 và
26 ± 6 nM cho COX-2. Indomethacin cho thấy xu hƣớng tƣơng tự trong ức chế
COX-1 và COX-2 trong điều kiện thử nghiệm với sự ức chế mạnh hơn của
thành tinh thể đƣợc xác định là một hợp chất duy nhất (49 g). Từ phân tích cộng
hƣởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy các cấu trúc hóa học của hợp chất là EPMC.
Hiệu suất quá trình chiết và phân lập này là gần 1,96% [12].
12
Còn theo Wanna S. (2011), quá trình thực hiện nhƣ sau: bột thân rễ khô
của K. galanga L. ngâm với dichloromethan (1 kg/ 2,5 lít) trong 7 ngày. Sau đó
lọc qua giấy lọc Whatman 1, bốc hơi dung môi bằng máy cô quay (Eyela, SB-
1000, Nhật Bản). Đƣợc dịch chiết xuất dichloromethan của K. galanga L. (DEK)
màu nâu thạch đƣợc bảo quản ở 4
0
C đến khi sử dụng. Để có đƣợc hợp chất
EPMC, DEK đƣợc sắc ký cột silica gel (70-230 mesh) và tách rửa với gradient
dichloromethan: hexan (70:30 đến 95:5). Các phần tách rửa đƣợc thu thập và
kiểm tra bởi TLC (silica gel, GF 254) với dung môi là dichloromethan: hexan
(95:5). Các đoạn có chứa EPMC đƣợc gộp chung và sấy khô. Độ tinh khiết của
EPMC đƣợc kiểm tra bằng cách sử dụng phƣơng pháp HPLC nhƣ sau; HPLC
(Agilent 1100 series và UV-VWD, Agilent Nhật Bản), sử dụng hệ dung môi,
acetronitril: methanol: 20 mM NaH2PO4 (30:40:30 v / v / v) với tốc độ dòng
chảy 1ml/phút, 5micron, 4.6x250mm (Agilent, Đức) và cột bảo vệ, μBondpack
10 micromet C18 (nƣớc, U.S.A.). Tại bƣớc sóng UV 270 nm. DEK đã cho thấy
đỉnh lớn có chứa 80 mg% EPMC [19].
- Cất kéo tinh dầu bằng hơi nước:
Phƣơng pháp này đƣợc Luger P. thực hiện năm 1996 có nội dung sau.
Các cây đƣợc thu hoạch vào tháng mƣời năm 1994, tại Đắc Lắc, Việt Nam. Cất
kéo tinh dầu bằng hơi nƣớc từ thân rễ tƣơi trong 6 giờ với thiết bị, dụng cụ thủy
tinh (hàm lƣợng dầu 3,1%). Tinh dầu hòa tan đƣợc cả trong chloroform và
ethanol. Dung dịch chloroform giữ tại nhiệt độ 277-279
0
K (4- 6
Trung Quốc
4
Ethyl acetat
Trung Quốc
5
Acid sulfuric
Việt Nam
6
Ceri sulfat
Việt Nam
2.1.3 Máy móc, thiết bị
Máy móc
- Máy cất quay chân không Büchi B-490 và R-220 (Thụy Sỹ).
- Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S (Thụy Sỹ).
- Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức).
- Tủ sấy MEMMERT (Đức).
14
- Bể siêu âm
- Bộ cất tinh dầu
- Bộ chiết Shoxlet
- Dụng cụ thái dƣợc liệu: dao thái
- Máy sắc khí bản mỏng CAMAG
- Máy xay
Dụng cụ
- Bình nón: 100ml.
- Ống đong : 100ml, 500ml.
- Bình định mức 10ml.
- Cốc có mỏ: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml.
pháp chiết xuất EPMC theo sơ đồ hình 2.1:
16 Phƣơng pháp Phƣơng pháp Soxhlet
Cất kéo hơi nƣớc
Kết tinh Kết tinh
17
Hộ, tập 3; Từ điển thực vật thông dụng – Võ Văn Chi, tập 2; Flora of China,
Vol. 24) và các mẫu lƣu tại phòng tiêu bản Herbier Muséum Paris – Muséum
National d’ Histoire Naturelle (P) với các đặc điểm của các bộ phận mẫu cây, để
xác định mẫu cây. Quá trình xác định đƣợc thực hiện tại Bộ môn thực vật,
trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội. Đƣợc tiến hành bởi Ths. Nghiêm Đức Trọng.
2.3.2 Phương pháp chiết tinh dầu bằng cất kéo hơi nước
- Xử lý dƣợc liệu, cân dƣợc liệu
- Lắp bộ cất, cất tinh dầu bằng hơi nƣớc
- Xử lý hỗn hợp tinh dầu thu đƣợc
- Kết tinh dịch vừa xử lý, lọc thu tủa, xác định khối lƣợng tủa thu đƣợc
- Xác định phổ, nhiệt độ nóng chảy chất thu đƣợc. Hình 2.2 Bộ cất tinh dầu bằng cất kéo hơi nước
1. Bình cất dung dịch: bình cầu 2000 ml
2. Bầu bảo hiểm
3 Ống sinh hàn
4. Bình hứng 500 ml
5. Nƣớc làm lạnh
Copyright: Tài liệu đại học ©