BỘYTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
_
______
*****
_______
_
LÊ THỊ THỌ
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT MỘT số
GLYCOSID TỪ CÂY cỏ NGỌT
(STEVIA REBAUDIANA (BERT.)
HEMSL.), HỌ CÚC (ASTERACEAE)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Văn Tài
2. TS. Nguyễn Thu Hằng
Nơi thực hiện:
1. Khoa Hóa thực vật -Viện Dược Liệu
2. Bộ môn Dược Liệu
ỊĩR Ư Ờ N a ĐH
Noàv V ’
HÀ NỘI-2011
LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của
các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới:
TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược
liệu.
TS. Nguyễn Thu Hằng - Phó trưởng Bộ môn Dược liệu , Trường ĐH
Dược Hà Nội.

1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY c ỏ
NGỌT 14
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

17
2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 17
2.1.1 Nguyên liệu
17
2.1.2 Thiết bị, hóa chất 17
2.2 NỘI DƯNG NGHIÊN CÚXJ 18
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
Chương 3. THựC NGHIỆM , KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20
3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 20
3.1.1. Dự kiến các giai đoạn chính trong quy trình chiết xuất glycosid
từ cỏ ngọt 20
3.1.2 Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt
bằng n-butanol bão hòa nước

20
3.1.3. Khảo sát khả năng tách glycosid của một số cột nhựa hấp phụ23
3.1.4. Khảo sát hệ dung môi rửa giải cột Diaion HP-20

25
3.1.5. Khảo sát nhiệt độ của quá trình chiết suất 26
3.1.6. Khảo sát thời gian chiết suất 27
3.1.7. Khảo sát tỷ lệ dược liệu/dung môi của quá trình chiết suất

28
3.1.8. Khảo sát số lần chiết suất 30
3.1.9. Đánh giá khối lượng và độ tinh khiết của CNl trong quá trình

phụ 26
Bảng 4 : Sự ảnh hưởng của dung môi rửa giải cột đến hiệu suất chiết glycosid
từ cỏ ngọt 27
Bảng 5. Sự phụ thuộc của hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào nhiệt độ
28
Bảng 6. Sự phụ thuộc hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt vào thời gian chiết
dược liệu 29
Bảng 7. Sự phụ thuộc tỷ lệ dược liệu/dung môi (w/v) trong quá trình chiết
dược liệu đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ ngọt 31
Bảng 8. Sự ảnh hưởng của số lần chiết xuất đến hiệu suất chiết glycosid từ cỏ
ngọt 32
Bảng 9. Khối lượng CNl thu được sau mỗi lần kết tinh lại

33
Bảng 10: Dữ liệu phổ IH-NMR và 13C-NMR của chất C N l 39
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid

5
Hình 2. Cấu trúc hóa học của Steviosid

7
Hình 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của Bùi Thị
Song Sơn 16
Hình 4. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt của
Giovanetto 18
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt

24
Hình 6. Ảnh chụp sắc ký đồ của CNl trong hệ dung môi CHClsiMeOHiHiO

ban châu Âu về an toàn thực phẩm đã đưa ra két luận về sự an toàn của các
glycosid chiết từ cỏ ngọt dựa trên rất nhiều dữ liệu và thí nghiệm đã được
công nhận [15].
ở Việt Nam, mặc dù được nhập về trồng từ trước năm 1990 ở quy mô
sản xuất nhưng việc sử dụng cây cỏ ngọt mới chỉ dừng lại ở những dạng dùng
đơn giản và chủ yếu dùng cho xuất khẩu. Đây là một loại cây có giá trị kinh tế
cao và hiện việc trồng cỏ ngọt đã được mở rộng ra nhiều vùng trên cả nước.
Việc trồng cỏ ngọt ở Việt Nam có nhiều thuận lợi vì vốn đầu tư ban đầu
không lớn, việc chăm sóc không quá khó khăn và cho năng suất cao. Do đó,
việc nghiên cứu chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt để thay thế đường đang được
các nhà khoa học quan tâm. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu
chiết xuất một số glycosid từ cây cỏ ngọt
{Stevia rehaudỉana (Bert.) Hemsl.),
họ Cúc (Asteraceae)” với các mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt
2. Xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. VÈ THựC VẬT
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo các tài liệu về phân loại thực vật [2], cây cỏ ngọt có vị trí phân
loại như sau:
Giới Thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta )
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Cúc (Asteridae)
Bộ Cúc (Asterales)
Họ Cúc (Asteraceae)
Chi Stevia Cav.
1.1.2. Đăc điểm thưc vât
• • •

độ khác nhau. Nguyễn Kim cẩn và cộng sự đã chiết được stevioside trong lá
cỏ ngọt trồng ở Việt Nam với hàm lượng từ 1,66-4,78% tùy theo khu vực lấy
mẫu [5],[12’.
- Các labdan diterpen gồm jhanol, austroinulin, 6-0-acetylaustroinulin [12’.
- Các triterpen gồm |3-amyrin acetat, lupeol [12’.
- Các thành phần khác gồm ß-sitosterol, stigmasterol, tanin và tinh dầu [12].
Nhóm hợp chất đáng chú ý trong cây cỏ ngọt là các steviol glycosid.
Các glycosid này chiếm 10-20% khối lượng lá cỏ ngọt khô và có bộ khung
cấu trúc được trình bày ở hình 1.
Hình 1. Khung cấu trúc hóa học của các steviol glycosid
CHn
Steviol Ri = R2 = H
Cho đến nay đã có 9 steviol glycosid được phân lập từ lá cỏ ngọt được
tổng kết ở bảng 1 [1],[12],[20].
Bảng 1. Cấu trúc của các steviol giycosid chiết xuất từ cỏ ngọt
STT Tên chất
Ri
Ri
TLTK
1
Steviosid -ß-glc
-ß-glc-ß-glc (2-^ 1)
[1],[3],[4],[5
],[6Ì[7],
2
Steviolbiosid -H
-ß-glc-ß-glc (2-^ 1)
[1],[12],[20]
3 Rebaudiosid A -ß-glc
-ß-glc-ß-glc (2->l)

-ß-glc-ß-xyl (2^ 1)
1
-ß-glc(3-^l)
[20]
9 Dulcosid A
-ß-glc -ß-glc-a-rha (2-^ 1) [1],[12],[20],
[3^
Từ bảng 1 cho thấy bốn glycosid được đề cập đến nhiều nhất trong các
tài liệu tham khảo là dulcosid A (0,3%); rebaudiosid c (0,6%); rebaudiosid A
(3,8% ) và steviosid (9,1%). Trong số này, chỉ có steviosid và rebaudiosid A
đã được xác định rõ các đặc tính vật lý và cảm quan. Steviosid và rebaudiosid
A đã được thử nghiệm độ ổn định trong các đồ uống có ga và cả hai chất được
xác định là bền với nhiệt và pH [3 r .
Các steviol glycosid ngọt hơn nhiều so với saccharose, trong đó:
steviosid ngọt hơn 110 đến 270 lần, rebaudiosid A ngọt hoTi 150 đến 320 lần,
rebaudiosid c ngọt hon 40 đến 60 lần, dulcoside A ngọt hơn 30 lần. [32]
Rebaudiosid A là chất có dư vị ít đắng nhất trong số bốn chất. Dubois
và Stephanson đã xác nhận rebaudiosid A ít đắng hơn steviosid và giải thích
nguyên nhân có dư vị đắng của steviosid và rebaudiosid A là do những đặc
tính vốn có của hai hợp chất này chứ không phải do tạp chất trong quá trình
chiết xuất. Dư vị đắng có xu hướng tăng cùng với sự tăng nồng độ của cả
Steviosid và Rebaudiosid A [32].
Steviosid (13-[(2-0-P-D-glucopyranosyl-a-D-glucopyranosyl) oxy]kaur-16-
en-18-oic acid |3-D- glucopyranosyl ester) là hoạt chất chính chiết từ lá cây cỏ
ngọt có cấu trúc hóa học được trình bày ở hình 2.
Hình 2. Cấu trúc hóa học của steviosid
OH
Q
HO'
HO

huyết [10].
1.3.2.2. Tác dung giãn mach và ha huyết áp
<♦ Nghiên cứu in vitro
Các nghiên cứu in vitro cho thấy steviosid ức chế sự co mạch gây ra bởi
vasopressin với sự có mặt của calcium [15].
♦♦♦ Nghiên cứu in vivo
-Nghiên cứu trên chuột đực trưởng thành với liều 25mg steviosid/kg thể
trọng/ngày (tương đương khoảng lOmg steviol/kg thể trọng/ngày) so với lô
chứng sử dụng 16,7 mg glucose/kg thể trọng/ngày thông qua nước uống trong
6
tuần cho thấy tác dụng hạ huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trưong có ý
nghĩa của steviosid so với nhóm chứng và không có dấu hiệu tăng đáng kể về
trọng lượng cơ thể [15'.
-Các nghiên cứu khác trên chuột cao huyết áp tự phát (SHR) và chó lai
khỏe mạnh cũng cho thấy tác dụng ngăn chặn sự phát triển của bệnh cao
huyết áp trên những con chuột còn nhỏ hay tác dụng hạ huyết áp trên chó của
steviosid [15].
-Một vài nghiên cứu khác sử dụng đường tiêm tĩnh mạch và tiêm màng
bụng cũng cho thấy khả năng hạ huyết áp của steviosid ở liều từ 25 đến 400
mg/kg thể trọng/ngày (tương đương với liều 10 đến 158 mg steviol/ kg thể
trọng/ngày) [15].
♦♦♦ Các thử nghiệm lâm sàng
10
- Sau 3 tháng sử dụng steviosid (3 lần/ngày với liều 250mg) trên những
người bị cao huyết áp từ nhẹ đến trung bình thấy cả huyết áp tâm thu và huyết
áp tâm trương đều giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng [15].
- Ket quả tương tự cũng thu được khi sử dụng steviosid trong vòng 2 năm
(với liều 500mg, 3 lần/ngày) [15‘.
1.3.2.3. Tác dung trên chức năng thân
♦♦♦ Nghiên cứu ỉn vitro

-Các nghiên cứu sử dụng steviosid (độ tinh khiết 95,6%) trong chế độ
ăn của chuột Fischer trong 90 ngày cũng đã đưa ra kết luận: 5% steviosid
trong chế độ ăn tương đương 2500mg/kg thể trọng/ngày (tương ứng xấp xỉ
942mg steviol/kg thể trọng/ngày) là mức không quan sát thấy tác hại [15’.
ĩ .3.2.7. Khả năng gây đôt biến.
Các nghiên cứu cả in vivo và in vitro về khả năng gây đột biến của các
steviol glycosid, của steviol và các chất chuyển hóa của steviol đã đưa ra kết
luận:
Stevỉosỉd và rebaudiosid A không cho thấy các bằng chứng về khả năng
gây đột biến ở cả in vitro và in vivo. Stevioỉ và một vài dẫn chất oxi hóa của
nó cho thấy bằng chứng rô ràng về độc tính với vật liệu di truyền ở in vitro,
đặc biệt khi có mặt hệ thống hoạt hóa sự chuyển hóa. Tuy nhiên, các nghiên
cứu về sự nguy hại với ADN và nhân tế bào ở chuột cống, chuột bạch và
12
chuột đồng in vivo cho thấy khả năng gây đột biến của steviol không thể hiện
ở liều lên tới 8000 mg/kg thể trọng [15],
1.3.2.8. Đôc tính man và khả năng gây ung thư
Các kết quả nghiên cứu về khả năng gây ung thư của các steviol
glycosid vào năm 1985, 1992, 1997 đều cho thấy các steviol glycosid không
gây ung thư ở các mô hình thử nghiệm [15'.
1.3.2.9. Ảnh hưởng đối với sư phát triển vả sinh sản
Nghiên cứu được thực hiện trên chuột Wistar bao gồm cả chuột đực và
cái ở thế hệ Fo, Fi, p2 và những con chuột đang mang thai cho thấy không có
tác dụng phụ nào đối với sự phát triển của cơ thể và cơ quan sinh sản cũng
như chức năng sinh sản hay bất kỳ ảnh hưởng nào đến bào thai ở chế độ ăn có
nồng độ steviosid lên tới 2100mg/kg thể trọng/ngày (tương đương 840 mg
steviol/kg thể trọng/ngày) [15'.
1.3.2.10. Khả năng gây di ứng của Steviol glycosid
-Đã có hai trưòng họp được báo cáo bị dị ứng có liên quan đến cỏ ngọt:
trường hơp thứ nhất là một bé gái 7 tháng tuổi sau khi nhai lá cỏ ngọt và

qua trung gian IgE.
Tóm lại, ủy ban châu Ấu về an toàn thực phẩm sau khi xem xét tất cả
các dữ liệu nghiên cứu về rebaudiosỉd A và steviosỉd đã đưa ra kết luận các
steviol glycosid đạt các yêu cầu kỹ thuật đề xuất thì không gây ung thư, không
gãy đột biển hoặc có bất kỳ tác dụng không mong muốn nào trên hệ phát triển
và sinh sản của cơ thể [15 .
14
1.4. MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT GLYCOSID TỪ CÂY
C ỏ NGỌT
1.4.1. Phương pháp 1
Phương pháp này được thực hiện trong khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại
học của Bùi Thị Song Sơn năm 1996 tại trường Đại học Dược Hà Nội [11
theo phương pháp mô tả trong tài liệu của Hiroshi Kohda, Kyoli Kasai, Kazuo
Ymasaki, Kuniko, Murakami và Osanu Tanaka.
Quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt được tóm tắt ở sơ đồ hình 3.
1.4.2. Phương pháp 2: Phương pháp của Giovanetto 1988
Phương pháp này được coi là nền tảng cho rất nhiều nghiên cứu về sau
trong việc sử dụng cột trao đổi ion để loại tạp màu trong dịch chiết nước cỏ
ngọt [27].
Quy trình chiết xuất được tóm tắt ở sơ đồ hình 4.
1.4.3. Phương pháp 3: Phương pháp của Payzant 1999
Quy trình chiết xuất của Payzant có giai đoạn đầu giống với phương
pháp của Giovanetto, tuy nhiên dịch nước thu được sau khi qua cột nhựa trao
đổi cation và anion được tiếp tục cho qua cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-7
và được rửa giải bằng dung dịch methanol. Dịch methanol này có chứa trên
95% steviol glycosid của dung dịch thu được sau khi qua cột nhựa trao đổi
ion, sau đó được bay hơi dung môi và tách steviosid bằng phương pháp kết
tinh trong methanol [26].
15
Hình 3. Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất glycosid từ lá cỏ ngọt

sấy ở nhiệt độ 105-110® c trong 60 phút.
- Cột sắc ký, bình chiết quả lê, bình nón, bình cầu, cốc có mỏ, ống
nghiệm, pipet Pasteur, phễu lọc Buchner.
- Máy đo phổ khối mW LETT PACKARD HP 5890, Serie II tại
Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.
18
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUCKER AVANCE-500
MHz tại Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia.
Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích;
MeOH, EtOH, Chloroform, n-Butanol, Ca(0 H)2, FeCla, Acid Citric
monohydrat, nhựa Amberlite XAD-2, nhựa Amberlite XAD-7, nhựa Diaion
HP-20, H2SO4 đặc.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u
- Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt theo hướng áp
dụng vào sản xuất.
- Xác định cấu trúc hóa học chất phân lập được
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
Xây dựng quy trình chiết xuất glycosid từ cỏ ngọt
- Khảo sát khả năng chiết glycosid từ dịch chiết nước cỏ ngọt bằng n-
buthanol và cột nhựa hấp phụ.
- Khảo sát các thông số của quá trình chiết xuất: nhiệt độ chiết, thời gian
chiết, số lần chiết, tỷ lệ dược liệu/dung môi.
- Hiệu suất chiết xuất tính theo dược liệu khô theo công thức (*):
m
A(%) =

X 100 Trong đó: A : Hàm lương phần trăm (%)
M(l-b)
m; Khôi lượng Steviosid thô (g)