BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN CƯỜNG BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TẠO MK-7
TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY
Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ
LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn
chân thành tới thầy giáo DS. Lê Ngọc Khánh – Giảng viên bộ môn Công
nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn quan tâm, tận tình
hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học.
Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân cùng toàn
thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược –
Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các
thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi
trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên
Lê Xuân Cường


2.1.1. Vi sinh vật sử dụng 15
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng 15
2.1.3. Môi trường 15
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto. 16
2.2.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B.
subtilis natto. 17
2.3. Phương pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy B. subtilis natto. 17
2.3.2. Phương pháp chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy 18
2.3.3. Phương pháp định tính MK-7 bằng sắc kí lớp mỏng 19
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22
3.1. Khảo sát có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.22
3.1.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong phần sinh khối B. subtilis natto22
3.1.2. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong dịch lọc môi trường nuôi cấy B.
subtilis natto 24 3.2. Lựa chọn hệ dung môi chiết MK-7 từ môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto 28
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO

rARN ribosomal Acid Ribonucleic
VSV Vi sinh vật
γ-PGA Gama polyglutamic acid
v/v Thể tích/Thể tích
w/v Khối lượng/Thể tích
mARN messenger Acid ribonucleic
TLC Thin layer chromatography

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng
Tên bảng
Trang
2.1
Nguyên liệu và hóa chất

kí là CHCl
3
:CH
3
OH (20:1, v/v)
26
3.5
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với pha động sắc
kí là Etylacetat:n-hexan (7:3, v/v)
27
3.6
Kết quả sắc kí lớp mỏng của dịch lọc với hệ dung môi
chiết là n-hexan:2-propanol (2:1, v/v)
31 DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình
Tên hình
Trang
1.1
Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto
4
1.2
Công thức cấu tạo của MK-7
6

Cl
2
(1:1, v/v)
30
1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trên thế giới, các bệnh loãng xương, gãy xương là những vấn đề về sức
khỏe nghiêm trọng và chi phí chăm sóc y tế và quản lý là rất lớn. Ở Mỹ năm
1995, chi phí chăm sóc sức khỏe liên quan đến gãy xương do loãng xương là
khoảng 13,8 tỷ USD [34]. Theo một nghiên cứu về tỉ lệ loãng xương ở bệnh
nhân trên 50 tuổi ở bệnh viện đa khoa huyện Cái Nước tỉnh Cà Mau, kết quả
cho thấy tỷ lệ loãng xương chiếm 21,53 % [11]. Ngoài ra các vấn đề về còi
xương ở trẻ nhỏ cũng đang là một vấn đề cần được quan tâm. Một nghiên cứu
cho thấy tỷ lệ còi xương ở trẻ em 1-36 tháng tuổi ở vùng miền núi phía Bắc là
14,4% [1].
Trước đây, con người thường ít quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức khỏe
của xương từ lúc ban đầu và thường chỉ phát hiện ở giai đoạn sau của bệnh và
thường phải dùng thuốc điều trị triệu chứng. Các thuốc điều trị loãng xương
như Calci, vitamin D, Calcitonin. Tuy nhiên các thuốc này thường gây ra các
tác dụng không mong muốn. Hiện nay, một số loại thực phẩm giúp phòng và
điều trị loãng xương, giúp xương chắc khỏe có tác dụng rất tốt.
Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa
xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7 [46]. Ngoài tác dụng trên
xương MK-7 cũng đã được chứng minh ngăn ngừa quá trình vôi hóa thành
mạch, cải thiện sức khỏe tim mạch [22]. Từ đây con người mới bắt đầu chú ý
và nghiên cứu MK-7. MK-7 là một loại vitamin K2 có nguồn gốc tự nhiên, có
trong các thực phẩm lên men đặc biệt có nhiều trong Natto - một loại thực

subtilis của Seki năm 1975 [36] và kết quả phân tích gen 16S rARN của
Tamang năm 2002 [43] cho thấy B. subtilis natto thuộc loài B. subtilis, các
khóa phân loại đã xếp B. subtilis natto là một dòng thuộc loài B. subtilis
nhưng phân biệt với các dòng khác là khả năng lên men tạo natto [44], [38].
Dòng B. subtilis natto có nhiều loại như B. subtilis natto N441 [1], B.
subtilis N18 [5], B. subtilis natto B-12 [55], B. subtilis natto N-77 [39]
1.1.3. Nguồn gốc
B. subtilis natto được giáo sư Shin Sawamura phân lập từ Natto, một loại
thực phẩm lên men từ đậu tương là món ăn truyền thống của người nhật Bản
[24]. Vi khuẩn này có nhiều trong rơm rạ, cỏ khô, phát triển trên các loại ngũ
cốc, các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật như thịt, cá đặc biệt phát triển
tốt trên đậu tương đã nấu chín [47], [42].
4

1.1.4. Đặc điểm hình thái
B. subtilis natto là trực khuẩn hình que, Gram (+). Nội bào tử hình que có
kích thước dưới 1μm. Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay nối với nhau
thành chuỗi (Hình 1.1). Khuẩn lạc khô, không màu, có kích thước lớn hơn
hay hình dạng bất định. Bề mặt hơi nhăn tạo thành lớp mịn, lan rộng trên bề
mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch [38].

Hình 1.1. Hình thái vi khuẩn B. subtilis natto [60].
1.1.5. Đặc điểm sinh lý
B. subtilis natto là sinh vật hiếu khí bắt buộc, có thể phát triển ở nồng độ
oxy lớn hơn 3%. Vi khuẩn phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng (30
o
C –
50
o
C); pH trung tính hoặc hơi kiềm, khoảng pH tối ưu cho sự sinh trưởng là

khuẩn Bacillus subtilis natto. Hiện nay, Nhật Bản sản xuất trên 300.000
tấn/năm [5]. Hai chất được tìm thấy trong natto là nattokinase và
menaquinone 7. Nattokinase tiêu fibrin là enzyme làm tan huyết khối, được
phát hiện trong Natto vào năm 1980 [43] và menaquinone 7 một sản phẩm
cũng đang được nghiên cứu rất nhiều hiện nay [41], [45], [50], [13], [26].
1.2.1. Nguồn gốc
Menaquinone 7 có tên khác là: Vitamin K2 (menaquinone – 7), Vitamin
K2 (35), Menaquinone K7, Vitamin MK 7, MK-7.
Vitamin K lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1929 bởi Henrik Dam [9].
Vitamin K gồm có vitamim K tự nhiên và vitamin K tổng hợp. Vitamin K
tự nhiên gồm có vitamin K1 (phylloquinone hoặc 2-methyl-3eicosa-2
’
-ene-
1,4-naphthoquinone) và vitamin K2 (menaquinone hoặc 2-methyl-3-
6

multiprenyl-1,4-naphthoquinone) [15]. Vitamin K tổng hợp gồm 3 loại là
vitamin K3, vitamin K4, vitamin K5 [21].
Vitamin K2 (MK-n) gồm có các chất được phân biệt với nhau dựa vào số
lượng isoprene-5-carbon ở mạch nhánh, chiều dài chuỗi khác nhau từ 2 đến
15 đơn vị isoprene [42] (n từ 2 đến 15). Trong đó MK-4, MK-7 là được
nghiên cứu nhiều nhất.
MK-7 là vitamin K2 có nguồn gốc từ thiên nhiên, có nhiều trong những
thực phẩm lên men như phomat, miso, và đặc biệt là ở natto. Cứ 100 g natto
cung cấp 870 µg vitamin K2 chủ yếu dưới dạng MK-7 [9].
1.2.2. Cấu trúc
Công thức cấu tạo

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của MK-7 [56].
Công thức phân tử C

tăng đáng kể các thành phần sinh hóa (phosphatase kiềm, ADN và canxi) ở
các mô xương đùi chuột trong ống nghiệm [52]. Hơn nữa, MK-7 làm tăng
đáng kể phosphatase kiềm, protein (osteocalcin) và ADN trong các tế bào
sinh xương MC3T3-E1 trong ống nghiệm [53]. Hiệu quả của MK-7 trong các
tế bào sinh xương bị ức chế bởi cycloheximide [52], [18], [16]. Như vậy,
MK-7 đã được chứng minh kích thích sự hình thành tế bào sinh xương do
tăng tổng hợp protein [51]. Mặt khác, trong tế bào sinh xương có chứa một
protein là osteocalcin. Osteocalcin là một protein không thuộc dạng collagen,
quan trọng nhất trong cấu trúc xương, là protein gắn kết calci chuyên biệt cho
xương phụ thuộc vào vitamin K [4]. Osteocalcin tạo ra từ tế bào sinh xương
nhờ được cảm ứng bởi vitamin D3 nhưng ở dạng chưa hoạt hóa. Khi đó, MK-
7 sẽ hoạt hóa osteocalcin giúp protein này có thể gắn và vận chuyển calci vào
xương, hình thành xương và giúp xương vững chắc [33].
MK-7 cũng đã được chứng minh có tác dụng ức chế tái hấp thu tế bào hủy
xương [16]. MK-7 ức chế các yếu tố bao gồm hormone tuyến cận giáp (PTH)
và prostaglandin E2 (PGE2). Tế bào hủy xương được hình thành khi có mặt
của các yếu tố như PTH, PGE2 và các yếu tố khác [16]. Ở nồng độ từ (10
-8
-
10
-5
M), MK-7 giúp ngăn chặn PTH- hoặc PGE2 là các chất hình thành tế
bào hủy xương.
Hiệu quả của MK-7 trên tế bào hủy xương trưởng thành được phân lập từ
mô xương đùi chuột cũng đã được kiểm tra. MK-7 làm giảm số lượng các tế
bào hủy xương trưởng thành trong ống nghiệm [16].
8 Hình 1.3. MK-7 ngăn chặn con đường của NF-κB truyền tín hiệu [49].

bệnh tim mạch lên đến 50%, mà không gây ra tác dụng phụ nào [57].
MK7 làm tăng lượng Collagen ở lớp thượng bì trên da. Đồng thời, giúp
giảm lượng Canxi tích tụ trên da, nhờ đó, giúp da khỏe mạnh và giảm nếp
nhăn [57].
Các sản phẩm có chứa MK-7:
Natto: là nguồn thực phẩm từ đậu nành lên men có nguồn gốc từ Nhật Bản
[44].
10

Một số loại thực phẩm lên cũng có chứa MK-7 như phô mai, sữa đông
[9].
Một số loại thực phẩm chức năng có chứa MK-7 như: MenaQ7, Vững cốt,
Vipteen Hình 1.5. Các sản phẩm có chứa MK-7
1.5. Lên men tạo MK-7 từ Bacillus subtilis natto
1.5.1. Nuôi cấy vi sinh vật sản xuất MK – 7
Phương pháp lên men bề mặt:
Vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được
làm ẩm và vô trùng. Môi trường này thường gồm các nguyên liệu tự nhiên
như cám gạo, khô cám, cám mỳ, ngô (chiếm 90 - 95%) có bổ sung trấu nhỏ
hoặc mùn cưa (khoảng 5 - 10%) để làm xốp canh trường khiến oxy dễ thâm
nhập. Các nguyên liệu trên cung cấp các chất dinh dưỡng như: nitơ, carbon,
vitamin, muối khoáng cho VSV phát triển. Môi trường được làm ẩm (50 -
60%) và tiệt khuẩn (1atm, 120
o
C) sau đó hạ nhiệt độ xuống 30 – 40
o
C để

a) Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các chất của B. subtilis
natto
Vi sinh vật là những cơ thể sống, ngoài những nhu cầu về dinh dưỡng
còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như nhiệt độ, PH, thời gian lên men
Các yếu tố này có thể kích thích vi sinh vật phát triển tạo nhiều sản phẩm
nhưng cũng có thể ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ môi trường và vi sinh vật có quan hệ mật thiết với nhau. Nhiệt
độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh tổng hợp
các chất của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật có khoảng nhiệt độ tối thiểu, tối thích,
tối đa mà chúng có thể chịu đựng. Khi nhiệt độ lên quá cao vi sinh vật sẽ bị
12

chết hoặc nhiệt độ xuống quá thấp màng sinh chất bị đông kết lại như vậy đều
ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp các chất của vi sinh vật [2], [7].
Theo Aydin Berenjian và cộng sự khi lên men trong máy lắc nhiệt độ tối
ưu để tạo MK-7 là 37
o
C [13].
Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng
Dinh dưỡng là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng tới sự phát triển và tổng
hợp các chất của vi sinh vật [2]. Với cùng một giống vi sinh vật nhưng nếu
nuôi cấy trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau thì sẽ có thu được các
sản phẩm cũng như nồng độ các sản phẩm khác nhau. Tùy vào sản phẩm
muốn thu nhận sẽ có các môi trường dinh dưỡng phù hợp.
Theo nghiên cứu của Aydin Berenjian và cộng sự thì môi trường có
peptone đậu tương, glycerol, cao nấm men, K
2
HPO
4

1.6. Một số nghiên cứu về B. subtilis natto và MK-7
Các nghiên cứu về tổng hợp, chiết tách MK-7:
Ở trong nước: Chưa có một công trình nghiên cứu nào về quá trình tổng
hợp, tách chiết MK-7.
Ở ngoài nước:
Surya Rosa-Putra và cộng sự đã nghiên cứu sinh tổng hợp MK-7 từ
Sphingobacterium multivorum thông qua con đường methylerythritol
phosphate và tiến hành tinh chế MK-7 bằng TLC (CH
2
Cl
2
:n-hexan, 1:1, R
f
=
0,4) [32].
Các nghiên cứu về tác dụng của MK-7:
Năm 1999, Yamaguchi đã nghiên cứu MK-7 trong việc ngăn ngừa loãng
xương ở chuột, kết quả cho thấy MK-7 có tác dụng ngăn ngừa loãng xương
[50].
Năm 2004, Tsukamoto nghiên cứu tác động trong quá trình chuyển hóa
xương và vai trò ngăn ngừa loãng xương của MK-7. Kết quả cho thấy MK-7
14

tác động đến quá trình hình thành xương và đóng vao trò quan trọng trong
việc ngăn ngừa loãng xương [46].

15

Dicloromethane
Trung Quốc
Vững cốt
Việt Nam
Tricloromethane
Trung Quốc
Nước cất
Việt Nam
Etylacetat
Trung Quốc

2.1.3. Môi trường
a) Công thức môi trường canh thang
Thành phần Lượng
Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Nước máy vđ 100ml
b) Công thức môi trường thạch thường
Thành phần Lượng
16

Pepton 1,0g
Cao thịt 0,5g
NaCl 0,5g
Thạch thường 2,3g
Nước cất vừa đủ 100ml.
2.1.4. Máy móc, thiết bị và dụng cụ
Danh sách các thiết bị sử dụng được đưa ra trong Bảng 2.2
Bảng 2.2. Thiết bị sử dụng

2.2.1. Khảo sát sự có mặt của MK-7 trong môi trường nuôi cấy B. subtilis
natto.
Khảo sát sự có mặt của MK-7 bằng sắc ký lớp mỏng trong:
- Phần dịch lọc tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.
- Phần sinh khối tách từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto.