BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG PHƯƠNG HẢO
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
BÀO CHẾ VI BỌT
DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN
TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG PHƯƠNG HẢO
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
BÀO CHẾ VI BỌT
DÙNG LÀM CHẤT TƯƠNG PHẢN
TRONG SIÊU ÂM CHẨN ĐOÁN
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Phúc Nghĩa

DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản 2
1.2. Cơ chế tăng cường tương phản của vi bọt 2
1.3. Những vi bọt lý tưởng cho siêu âm tương phản 3
1.4. Cấu tạo vi bọt 4
1.4.1. Lõi khí 5
1.4.2. Vỏ ngoài 6
1.5. Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm 9
1.6. Cơ chế hoà tan vi bọt 10
1.6.1. Vi bọt với lõi không khí 10
1.6.2. Vi bọt với lõi không khí kết hợp với khí ổn định 11
1.6.3. Cơ chế hoà tan vi bọt có vỏ được ổn định bằng các chất diện
hoạt 11
1.7. Ứng dụng khác của vi bọt trong y học 12
Chương 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU 13
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 13
2.1.1. Nguyên vật liệu 13
2.1.2. Thiết bị 13
2.2. Nội dung nghiên cứu 14 2.3. Phương pháp nghiên cứu 14
2.3.1. Phương pháp bào chế vi bọt 14
2.3.2. Phương pháp đánh giá đặc tính hoá lý của vi bọt 16
2.3.3. Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt 16
Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18

DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Bảng
Tên bảng
Trang
1
1.1
Âm trở một số môi trường
2
2
2.1
Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
13
3
2.2
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
14
4
2.3
Công thức các dịch nhiều thành phần
15
5
3.1
Thời gian phân lớp vi bọt của các dịch tạo bọt một
thành phần
19
6
3.2
Kết quả khảo sát một số đặc tính hoá lý của vi bọt
thay đổi theo nguyên liệu tạo vỏ

Hình 3.1
Cột bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) thời
điểm phân 3 lớp (trái) và phân 2 lớp (phải)
18
3
Hình 3.2
Vi bọt tạo từ poloxamer 188 1% (kl/tt) quan sát
ở vật kính 10x
19
4
Hình 3.3
Cột bọt tạo từ CT 3 thời điểm phân 3 lớp (trái)
và phân 2 lớp (phải)
20
5
Hình 3.4
Vi bọt tạo từ CT 3 quan sát ở vật kính 40x
21
6
Hình 3.5
Phân bố kích thước vi bọt tạo từ các nguyên liệu
khác nhau
23
7
Hình 3.6
Phân bố kích thước vi bọt khi thay đổi cường độ
siêu âm
26
8
Hình 3.7

cung cấp chất lượng hình ảnh đầy đủ cho phép quan sát trực quan bên trong tim để
chẩn đoán chính xác về rối loạn chức năng tâm thất. Do đó bắt buộc phải bổ sung
thêm các quy trình kiểm tra khác mà những phương pháp đó thường xâm lấn, đắt tiền
hơn và đôi khi rủi ro cao hơn [22].
Tác nhân tương phản siêu âm được định nghĩa là tác nhân có thể làm thay đổi
độ tương phản của hình ảnh siêu âm một cách có ý nghĩa giúp các chẩn đoán có thể
phân biệt được điều kiện bình thường và bất thường [22]. Trên thế giới, vi bọt đã
được sử dụng phổ biến làm tác nhân tương phản lí tưởng cho siêu âm. Tuy vậy, ở
Việt Nam, bào chế và ứng dụng vi bọt trong siêu âm tương phản là một vấn đề rất
mới mẻ. Do vậy, đề tài: “Bước đầu nghiên cứu bào chế vi bọt dùng làm chất tương
phản trong siêu âm chẩn đoán” được thực hiện nhằm mục đích:
1. Khảo sát lựa chọn nguyên liệu và thông số bào chế vi bọt
2. Đánh giá một số đặc tính hoá lý và độ bền của vi bọt
2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Sự cần thiết của tác nhân siêu âm tương phản
Vi bọt được sử dụng làm tác nhân tăng cường tương phản trong siêu âm vì:
- Phần lớn cơ thể người là nước (73%) nên cơ thể đồng nhất về âm. Máu và mô
xung quanh có cùng mức độ phản xạ âm nên khó phân biệt rõ ràng dòng máu,
tưới máu hoặc mặt phân cách giữa mô và máu trong siêu âm [15].
- Siêu âm với tác nhân vi bọt có thể đánh giá dòng máu trong thời gian thực.
- Siêu âm với tác nhân vi bọt an toàn hơn các hình ảnh học phân tử khác (ví dụ
như hình ảnh học đồng vị phóng xạ sử dụng chất phóng xạ ảnh hưởng không
tốt đến sức khoẻ bệnh nhân trong khi đó vi bọt khá an toàn) [16].
- Các hình ảnh học phân tử khác như chụp cộng hưởng từ, chụp cắt lớp bằng
bức xạ positron và chụp cắt lớp đơn photon rất đắt tiền. Trong khi đó siêu âm
là phương pháp chẩn đoán kinh tế và phổ biến [14].
- Vì vi bọt tạo phản xạ âm rất mạnh nên chỉ cần liều tiêm tĩnh mạch nhỏ khoảng
microgram vi bọt. Trong khi đó các phương pháp hình ảnh học phân tử khác

5

Thận
1,62 x 10
5

Gan
1,65 x 10
5

Xương
6,10 x 10
5

Khi một nguồn siêu âm lan truyền qua hai môi trường có âm trở khác nhau sẽ
tạo nên hiện tượng phản xạ siêu âm, còn một phần siêu âm xuyên qua môi trường.
Chênh lệch âm trở càng lớn thì cường độ chùm siêu âm phản xạ càng tăng. Thiết bị
siêu âm sẽ thu sóng phản xạ có cường độ khác nhau và biến đổi thành hình ảnh, như
vậy hình ảnh siêu âm được tạo nên nhờ chùm siêu âm phản xạ từ các mặt phân cách
đối tượng khảo sát với môi trường xung quanh. Cường độ chùm siêu âm phản xạ càng
lớn thì hình ảnh siêu âm càng rõ.
Mặt khác, chất khí có khả năng nén cao hơn vài lần so với chất lỏng và chất
rắn, điều này làm cho vi bọt có khả năng tăng cường âm tốt hơn. Chỉ cần tiêm tĩnh
mạch một lượng nhỏ tác nhân vi bọt thì phần không gian máu chứa vi bọt, bao gồm
cả các buồng tim sẽ trở nên sáng hơn, cho phép phân biệt máu với các mô xung quanh
[22].
Ngoài việc tạo một chênh lệch âm trở lớn giữa vi bọt và các bộ phận cơ thể, vi
bọt cũng cộng hưởng với sóng siêu âm, làm tăng mức phản xạ tại vị trí có vi bọt lên
rất nhiều, điều này cho phép thiết bị siêu âm nhận được duy nhất tín hiệu phản xạ siêu
âm từ vi bọt [17]. Đặc biệt, vi bọt với kích thước micromet thường cộng hưởng trong

quyết định cơ chế phản xạ siêu âm. Do chứa lõi khí với mức độ phản xạ âm cao hơn
hẳn mức độ phản xạ âm của mô mềm cơ thể nên khi sử dụng tác nhân tương phản là
vi bọt, mức độ phản xạ âm được tăng cường sẽ cung cấp hình ảnh có chất lượng cao
hơn, qua đó tăng độ chính xác và độ tin cậy của việc chẩn đoán bệnh. Tuy nhiên, nếu
chỉ riêng lõi khí tồn tại trong môi trường nước sẽ không ổn định do ảnh hưởng của
sức căng bề mặt [24], vì thế vi bọt cần một vỏ bao quanh bên ngoài. Vỏ ngoài bao
5

bọc có vai trò như một rào cản giữa lõi khí và môi trường nước xung quanh và giúp
ổn định vi bọt. Vỏ có thể được tạo bởi chất diện hoạt, lipid, protein, polyme, hoặc kết
hợp các vật liệu này.

Hình 1.1. Cấu trúc một vi bọt điển hình với các loại vỏ khác nhau
1.4.1. Lõi khí
Lõi khí là phần quan trọng nhất của vi bọt vì nó quyết định mức độ phản xạ
âm. Khi được siêu âm, vi bọt sẽ bị nén, dao động, và sau đó phản xạ lại âm. Điều này
tạo ra một hình ảnh có độ tương phản cao hơn hẳn trong siêu âm. Lõi khí có thể là
không khí, perfluorocarbon (PFC), hoặc nitơ [15]. Những khí kém tan trong nước sẽ
khó thoát khỏi vi bọt hơn và tồn tại lâu hơn trong tuần hoàn máu [18].
Các dẫn chất PFC được dùng rất phổ biến trong bào chế vi bọt do tính tan trong
nước thấp và áp suất hơi cao, các khí này giúp vi bọt đạt được sự ổn định cần thiết
khi làm tác nhân siêu âm tương phản. Độ tan trong nước thấp sẽ làm giảm sự thoát
khí vào máu (một nguyên nhân gây co nhỏ vi bọt). Áp suất hơi cao sẽ làm khí chậm
hoá lỏng hơn khi mà áp lực Laplace không ngừng tăng lên do vi bọt bị co nhỏ theo
thời gian, mà khí hoá lỏng là nguyên nhân vi bọt bị méo mó, nhăn nhúm hoặc biến
mất. Khi tiêm vào cơ thể, vi bọt được phân phối trong khắp không gian mạch máu và
tồn tại trong suốt thời gian của một cuộc kiểm tra siêu âm, do đó, độ tan thấp và áp
suất hơi cao của khí sẽ kiểm soát chặt chẽ kích thước, sự phồng lên của vi bọt và đặc
biệt tạo vỏ có biến dạng đàn hồi cao tránh gây vỡ bọt khi siêu âm [22].
6

phải làm nóng để làm biến tính các albumin trước khi siêu âm và tạo điều kiện đóng
vỏ [19]. Vỏ albumin được liên kết với nhau thông qua cầu nối disulfide giữa các phân
tử cystein trong quá trình tạo bọt [12].
7

Từ Albunex, một loại vi bọt vỏ albumin khác được tạo ra nhưng với lõi khí là
perfluorocarbon, được đặt tên là Optison ™ [7]. Độ hòa tan thấp của khí
perfluorocarbon giúp các vi bọt lưu thông ổn định lâu dài trong cơ thể [21].
Một số protein khác cũng được sử dụng để làm vỏ vi bọt. Cavalieri và đồng
nghiệp sử dụng lysozyme để tạo vi bọt và nhận thấy chúng khá ổn định [3]. Trong
báo cáo của mình, Cavalieri và đồng nghiệp đã khẳng định vai trò của cầu nối
disulfide trong việc hình thành lớp vỏ protein ổn định.
1.4.2.2. Vỏ chất diện hoạt
Chất diện hoạt là một nhóm khá lớn của các hợp chất hoá học. Do cấu tạo gồm
hai phần: phần thân nước và phần thân dầu nên các chất diện hoạt có khả năng hấp
phụ trên bề mặt phân cách pha và tạo thành một lớp đơn, đa phân tử hoặc các ion
được định hướng làm thay đổi bản chất phân cực của lớp bề mặt và giảm năng lượng
bề mặt giữa hai pha [1]. Nhờ vậy, vỏ chất diện hoạt dễ dàng hình thành bao quanh lõi
khí và giúp vi bọt ổn định.
Wheatley và đồng nghiệp đã xây dựng công thức vi bọt với vỏ là hỗn hợp các
chất diện hoạt Span- 40 và Tween- 40 [23] [25]. Dung dịch Span/ Tween với tỉ lệ 1:1
được siêu âm trong không khí để tạo thành các vi bọt ổn định. Tỷ lệ này được xác
định nhờ phương pháp màng phim Langmuir Blodgett [25].
Một công thức khác về vi bọt liên quan đến chất diện hoạt được Dressaire và
đồng nghiệp thiết kế từ sucrose stearat (mono và di-ester) kết hợp với 75% khối lượng
siro glucose ở 70°C [9]. Những vi bọt này ổn định hơn một năm và cho thấy nhiều
ưu điểm đáng chú ý.
1.4.2.3. Vỏ lipid
Vi bọt vỏ lipid là một trong những công thức có nhiều ứng dụng nhất trong
hình ảnh y sinh học và phân phối thuốc. Lipid có nhiều trong tự nhiên và khá tương


dụng một lõi rắn dễ bay hơi, sau này có thể thăng hoa đi và tạo ra vi bọt. Đường kính
vi bọt dao động trong khoảng 2-20µm.
Vào năm 2005, Cavalieri và đồng nghiệp mô tả một phương pháp để tạo ra vi
bọt có vỏ là PVA [4]. Vi bọt được tạo ra bằng cách khuấy dung dịch PVA đã được
xử lý ở tốc độ cao (8000 vòng/ phút). Đường kính trung bình vi bọt là khoảng 6 ±
1µm. Độ dày vỏ có thể được giảm từ 0,9 xuống 0,7µm khi giảm nhiệt độ tác động từ
nhiệt độ phòng đến 4°C. Vi bọt PVA có hạn sử dụng trong vài tháng và có khả năng
vận chuyển thuốc kỵ nước, chất mang polyme (ví dụ DNA), phân phối thuốc tới đích.
1.5. Phương pháp bào chế vi bọt bằng siêu âm.
Siêu âm là phương pháp phổ biến nhất để bào chế vi bọt. Khi sóng siêu âm đi
qua một chất lỏng, sự giãn nở do siêu âm sẽ gây ra áp suất âm trong chất lỏng và kéo
các phân tử ra xa nhau. Khi áp suất âm này lớn hơn sức căng bề mặt của chất lỏng
(sức căng cực đại này lại phụ thuộc vào từng chất) tức là cường độ siêu âm đủ mạnh
thì sự giãn nở này sẽ tạo ra những lỗ hổng. Sau đó nguyên liệu tạo vỏ sẽ bao phủ dần
lên lỗ hổng và vi bọt được hình thành. Nhiệt độ và áp suất cao do sóng siêu âm tạo ra
những biến đổi hoá học của nguyên liệu tạo vỏ làm tăng độ ổn định cho vi bọt [12].
Phân bố kích thước vi bọt bào chế bằng siêu âm phụ thuộc vào tần số, cường
độ và xung siêu âm. Phân bố kích thước này tương đối rộng nên cần phải kiểm soát
chặt chẽ [20].
Trong đề tài này, máy siêu âm sử dụng bào chế vi bọt có các thông số sau:
Cường độ, xung và thời gian siêu âm. Các thông số này đều ảnh hưởng đến chất lượng
vi bọt bào chế được:
- Cường độ siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lỗ hổng để hình thành nên vi
bọt và ảnh hưởng đến độ ổn định vi bọt tạo ra
- Xung siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng lấy khí tạo lõi khí cho vi bọt
- Thời gian siêu âm: Ảnh hưởng đến khả năng tạo lớp vỏ bền cho vi bọt
10

1.6. Cơ chế hoà tan vi bọt

của một vi bọt lõi không khí trong môi trường nước được Epstein và Plesset đưa ra
như sau:
















) (2)
Dw: Hệ số khuếch tán pha khí
F: Tỉ lệ giữa nồng độ không khí tan trong nước và nồng độ không khí khi đã
cân bằng với áp suất khí quyển
L: Hệ số Ostwald. L =



11

Từ phương trình (2) ta thấy để làm giảm tốc độ hoà tan của vi bọt cần sử dụng
khí ổn định (như PFC hoặc nitơ). Khí sử dụng tốt nhất là không hoà tan trong nước,



=




(







) (3)
Trong đó Rp là khả năng hạn chế sự khuếch tán khí của màng vi bọt.
1.7. Ứng dụng khác của vi bọt trong y học
Ngoài vai trò là tác nhân tương phản trong siêu âm, vi bọt còn nhiều ứng dụng
quan trọng trong y học như hình ảnh phân tử, liệu pháp gen và vận chuyển thuốc tới
đích.
Để ứng dụng trong hình ảnh phân tử, những vi bọt được thiết kế có khả năng
chọn lọc các receptor đích và tại đó, vi bọt sẽ tăng cường mức độ phản xạ âm. Nhờ
vậy mà các tín hiệu từ receptor đích được ghi lại [6] [14]. Một số bệnh sử dụng
phương pháp này như viêm và xơ vữa động mạch [8] [11].
Trong liệu pháp gen, người ta tiêm đồng thời DNA plasmid với vi bọt. DNA
tạo liên kết tĩnh điện với bề mặt vi bọt, nhờ đó DNA được phân phối tới đích cùng
với vi bọt. Việc sử dụng vi bọt làm chất mang còn giúp bảo vệ DNA khỏi sự phân
giải của nuclease qua đó tăng thời gian lưu thông của DNA trong máu.
Trong ứng dụng làm chất trung gian vận chuyển thuốc tới đích, các phân tử

USP
Cremophor A25
Công ty cổ phần sao Thái
Dương
TCCS
Poloxamer 188
Công ty cổ phần sao Thái
Dương
USP
Tween 80
Trung Quốc
TCCS
Cremophor RH40
Đức
EP
Nước cất
Việt Nam
TCCS
2.1.2. Thiết bị

14

Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
STT
Thiết bị
Ghi chú
1
Bể điều nhiệt
Hãng Buchi- Đức
2

CT
2
CT
3
CT
4
Pha nước
Cremophor A25
0,2g
0,2g Poloxamer 188
0,2g

0,2g
0,2g
Tween 80

0,2g

0,2g
Cremophor RH40 0,2g

Pha dầu
GMS
0,2g

phân 3 lớp) đến lúc cột bọt phân 2 lớp.
- Kích thước trung bình:
 Làm tiêu bản: Sau khi tạo bọt, tiến hành hút bọt bằng micro pipet ở thời điểm
10 phút tại vi trí cố định, làm tiêu bản.
 Soi dưới kính hiển vi gắn camera, chụp ảnh ở vật kính 40x, lưu ảnh.
 Xử lý hình ảnh bằng phần mềm ImageJ cho kết quả là số lượng bọt và diện
tích bọt tương ứng. Từ diện tích S của vi bọt, tính ra đường kính vi bọt theo
công thức: d= 2 x




Xử lý thống kê dữ liệu về đường kính vi bọt bằng Microsoft Office Excel từ
đó tính đường kính trung bình.
- Phân bố kích thước:
Xử lý thống kê dữ liệu về đường kính vi bọt bằng Microsoft Office Excel để
tính đường kính trung bình d và độ lệch chuẩn SD. Lấy phân bố kích thước
nằm trong khoảng d ± 2SD tức là 95,45% vi bọt có đường kính nằm trong
khoảng phân bố này.
2.3.3. Phương pháp đánh giá độ bền vi bọt
- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong một tiêu bản
17

Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát diễn biến quá trình thay
đổi kích thước của hệ bọt trên một vi trường bọt cố định.
Chụp lại ảnh ở vật kính 40x ở các thời điểm 10 phút, 30 phút, 60 phút, 120
phút, 180 phút, 240 phút, xử lý hình ảnh, dùng phần mềm ImageJ đếm số bọt còn
trong giới hạn đường kích từ 1- 10μm.
- Đánh giá độ ổn định vi bọt trong ống nghiệm
Sau khi tạo bọt, làm tiêu bản như mục 2.3.2, quan sát dưới kính hiển vi gắn