Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 i Đại học Nha Trang

Lời cảm ơn
Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của thầy cô giáo
Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Trường ĐH Nha Trang và các anh chị tại Trung tâm
Nghiên cứu Quan trắc và Cảnh báo Môi trường dịch bệnh Thủy sản khu vực miền Bắc
(CEDMA) - Viện NCNTTS 1. Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Ban chủ nhiệm
Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Phòng thí nghiệm CEDMA đã
tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ và tài trợ kinh phí để tôi hoàn thành tốt chương trình
thực tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ts. Phan Thị Vân, Ths. Võ Anh Tú, Ks
Đồng Thanh Hà và Ks Nguyễn Thị Thu Hà đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy trong suốt
quá trình tôi thực tập tốt nghiệp và hoàn thành bài khóa luận. Ths. Võ Anh Tú là người
hướng dẫn, người chị luôn theo sát, đóng góp ý kiến kịp thời và tạo điều kiện thuận lợi
nhất cho tôi thực hiện đề tài. Cảm ơn chị vì sự giúp đỡ nhiệt tình và những ý kiến đóng
góp quý báu trong suốt thời gian qua. Đặc biệt tôi xin cảm ơn cô giáo hướng dẫn Ths.
Phạm Thị Thúy Nga đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại
trường Đại học Nha Trang.
Tập thể 49 Bệnh học đã cùng tôi đi suốt chặng đường 4 năm học với biết bao niềm
vui, sự thương yêu chân thành. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô giáo chủ nhiệm và các
bạn vì những tình cảm đó và cho tôi học hỏi được rất nhiều điều từ cuộc sống.
Cuối cùng, lời cảm ơn chân thành nhất xin được gửi tới bố mẹ và gia đình đã luôn
bên cạnh, động viên, giúp tôi cố gắng vươn lên.
Trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp, mặc dù đã có nhiều cố gắng, tuy nhiên
thời gian có hạn và kiến thức còn hạn chế nên không thể tránh khỏi những sai sót nhất
định. Tôi rất mong được sự quan tâm, góp ý của các thầy cô, anh chị và các bạn để
khóa luận hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Bắc Ninh, ngày 15 tháng 6 năm 2011

3.3. Phương pháp nghiên cứu 11
3.3.1. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu của đề tài 11
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 12
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 iii Đại học Nha Trang

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu mô học 14
Phần IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 17
4.1 Kết quả nghiên cứu 17
4.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá Giò khỏe 17
4.1.2 Biến đổi mô học cá Giò sau khi tiêm nhũ dầu 18
4.1.3 Biến đổi mô bệnh học cá Giò sau khi tiêm vắc xin không có nhũ
dầu 24
4.1.4 Biến đổi mô học cá Giò sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 33
4.2 Thảo luận 47
4.2.1 Quá trình viêm 47
4.2.2 Sự tiến triển của ổ viêm sau khi tiêm nhũ dầu, vắc xin và vắc xin
nhũ dầu 49
Phần V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53
5.1. Kết luận 53
5.2. Kiến nghị 54
Tài liệu tham khảo 55
Tài liệu tiếng Việt: 55
Tài liệu tiếng Anh: 56
Tài liệu Internet: 57

Hình 21: Cấu trúc cơ bị biến đổi sau khi tiêm 1 ngày. 34
Hình 22: Tiêu bản mô cơ 3 ngày sau sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu, H&E. 35
Hình 23: Mô cơ cá Giò 3 ngày sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu, H&E; ×40 35
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 v Đại học Nha Trang

Hình 24: Biến đổi mô học cá Giò 3 ngày sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu 37
Hình 25: Tiêu bản mô cơ 7 ngày sau khi tiêm vắc xin nhũ dầu 38
Hình 26: Ổ viêm (khoanh tròn) sau 7 ngày tiêm vắc xin nhũ dầu 38
Hình 27: Biến đổi mô tại ổ viêm 7 ngày sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu. 39
Hình 28: Các lớp tế bào hình thành sau 7 ngày tiêm vắc xin nhũ dầu, H&E; ×1000.
41
Hình 29: Tiêu bản mô cơ cá Giò 14 ngày 42
Hình 30: Ổ viêm sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 14 ngày, H&E; ×100. 42
Hình 31: Biến đổi mô tại ổ viêm sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 14 ngày. 43
Hình 32: Mô cơ sau khi tiêm vắc xin có nhũ dầu 21 ngày. 45

Macrophago (Đại thực bào)
NTTS

:

Nuôi trồng thủy sản
O :

Drop oil (Giọt dầu)
SRBC

:

Seep Red Blood Cells (Hồng cầu cừu)
WBC

:

White blood cell (bạch cầu)
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 1 Đại học Nha Trang

Phần I: LỜI MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề

thành viêm mãn tính, sinh sản có giới hạn về không gian thời gian và ngừng lại khi
hết kích thích.
Nghiên cứu cơ chế viêm là một phần quan trọng trong nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch của cơ thể cá sau khi tiêm vắc xin. Những nghiên cứu đi sâu vào tìm hiểu cơ
chế viêm trên cá sau khi tiêm vắc xin còn hạn chế. Do đó, Viện nghiên cứu NTTS 1
đã cho phép tôi thực hiện nội dung nghiên cứu nhỏ với tiêu đề “Bước đầu nghiên
cứu cơ chế viêm của cá Giò (Rachycentron canadum) sau khi tiêm vắc xin có
nhũ dầu và không có nhũ dầu bằng phương pháp mô học”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.
 Nghiên cứu biến đổi mô học tại vùng tiêm kháng nguyên.
 Bước đầu nghiên cứu khả năng gây đáp ứng miễn dịch của các thành phần
chính trong vắc xin gồm nhũ dầu, vi khuẩn bất hoạt và nhũ dầu kết hợp với vi
khuẩn bất hoạt.
1.3. Nội dung nghiên cứu
 So sánh biến đổi mô học tại vị trí tiêm nhũ dầu, vi khuẩn bất hoạt và vắc xin
nhũ dầu trên cơ cá Giò bằng phương pháp mô học ở 1, 3, 7, 14, 21 ngày sau khi
tiêm.
 Bằng phương pháp mô học có thể phát hiện được một số loại tế bào tham gia
trong phản ứng viêm của cá Giò. Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 3 Đại học Nha Trang

Phần II: TỔNG QUAN


loạt (Chang và ctv, 1999). Cho đến nay Đài Loan là nước dẫn đầu về sản xuất giống
và nuôi thương phẩm cá Giò, chiếm 80% lồng nuôi biển với sản lượng đạt 1.500 tấn
năm 1999 (Su và ctv, 2000) và đạt 5.000 tấn năm 2004 (Nguyễn Quang Huy và ctv,
2008).
Ngoài ra, cá Giò đã và đang được sản xuất giống và nuôi thương phẩm tại một số
nước như Nhật Bản, Mỹ, Austraylia, Trung Quốc, Malaysia, Singapo, Cu Ba, Hàn
Quốc và Việt Nam…
2.1.2. Tình hình nuôi cá Giò tại Việt Nam
Việt Nam được xem là nước đứng “hàng thứ 3” trên thế giới về sản xuất giống và
nuôi cá Giò (Niels Svennevig, 2001). Những năm gần đây, bên cạnh các đối tượng
nuôi biển khác như cá Song (Epinephelus spp), cá Hồng (Lutjanus spp), cá Cam
(Seriola dummerili), tôm Hùm (Panurilus spp), Trai ngọc (Pinctada spp)…, cá Giò
là đối tượng nuôi hấp dẫn và được nuôi khá phổ biển ở các vùng kín sóng gió ở các
tỉnh như Quảng Ninh, Hải phòng, Nghệ An ở phía Bắc và Vũng Tàu, Kiên Giang và
nhất là khu vực phía Nam (Nguyễn Quang Huy, 2002). Cá Giò đã được các nhà
khoa học Viện Nghiên cứu Hải sản bắt đầu nghiên cứu từ năm 1995, đến nay công
nghệ sản xuất giống đã và đang được hoàn thiện. Đây được đánh giá là đối tượng
nuôi có giá trị kinh tế cao, tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi, tỷ lệ sống, năng suất
nuôi cao (KHCN&KT Thủy sản, 2004).
2.2. Tình hình bệnh vi khuẩn trên cá Giò
2.2.1. Tình hình bệnh vi khuẩn cá Giò trên Thế giới
Cá Giò được đánh giá là nhạy cảm với ba nhóm tác nhân chính là virus, vi khuẩn
và kí sinh trùng làm cản trở việc phát triển công nghiệp sản xuất giống thủy sản
cũng như nuôi thương phẩm. Các bệnh virus Lymphocystis và bệnh ký sinh trùng
Myxosporidosis do Trichodina spp, Neobenedenia spp và Amylodinium spp cũng có
thể ảnh hưởng đến cá Giò (Kaiser và Holt, 2005). Tuy nhiên, theo các báo cáo thì
bệnh do vi khuẩn gây ra lại chiếm tỷ lệ khá lớn như bệnh Mycobacteriosis,
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản


thể. Cá bệnh bơi lờ đờ trên mặt nước, kém ăn hoặc bỏ ăn, chết lác đác và mọi kích
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 6 Đại học Nha Trang

thước cá đều có thể nhiễm bệnh. Bệnh Vibriosis có tỷ lệ gặp cao ở cá nuôi lồng
(100%), cá nuôi ao gặp thấp hơn (58,3%). Một số loài vi khuẩn Vibrio spp đã phân
lập được từ nội tạng cá bệnh, trong đó Vibrio anguillarum đã gây bệnh trong điều
kiện nhân tạo (60-80%) với liều tiêm 0,3ml huyền dịch có mật độ vi khuẩn 4.10
6
-
4.10
7
tb/ml sau 3 ngày tiêm.
2.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong nuôi trồng thủy sản
2.3.1. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS trên thế giới
Vắc xin là một chế phẩm có tính kháng nguyên từ toàn bộ hoặc một phần chiết từ
sinh vật nhiễm bệnh, được sử dụng để tăng cường phản ứng miễn dịch đặc trưng
của vật chủ mẫn cảm. Vắc xin phòng bệnh trong NTTS được bắt đầu nghiên cứu và
phát triển từ năm 1973, đến cuối những năm 1987 thì được đưa vào sử dụng
(Newman và ctv, 1993). Tháng 7 năm 2005, đã có 35 loại vắc xin phòng bệnh vi
khuẩn và 2 loại vắc xin phòng bệnh virus được đăng ký bản quyền và sử dụng cho 6
đối tượng nuôi phổ biến trên 41 quốc gia trên thế giới bao gồm cá Hồi, cá Chẽm
Châu Âu, cá Chẽm Châu Á, cá Rô phi, cá Turbot, và cá Bơn đuôi vàng. Tại Na Uy,
việc sử dụng vắc xin phòng bệnh do vi khuẩn gây ra tỏ ra rất có hiệu quả. Những
nghiên cứu trước đây cho thấy phòng bệnh cho cá bằng vắc xin ở quy mô thương
mại đã được thực hiện rất hiệu quả trong nghề nuôi cá hồi nhằm phòng ngừa các
bệnh do vi khuẩn: Bệnh do Vibrio (vibriosis), bệnh do Vibrio mùa lạnh (cold water
vibriosis), bệnh xuất huyết đường tiêu hóa (enteric redmouth-ERM), bệnh lở loét

nguyên và gây ra các tác dụng phụ khác. Nhìn chung kháng nguyên hòa tan cần
phải được sử dụng phối hợp với chất bổ trợ mới có thể tạo nên đáp ứng miễn dịch
dịch thể.
2.3.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng vắc xin trong NTTS ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và phát triển vắc xin trên cá còn hạn chế. Đến nay,
ở nước ta chưa có bất kỳ một loại vắc xin nào đã phát triển và ứng dụng thành công
trong NTTS và thích ứng được với nhu cầu thị trường. Năm 2006, Bộ Thủy sản
cũng đầu tư một dự án sản xuất vắc xin cho các đối tượng cá Tra, cá Basa, cá Mú,
cá Giò, cá Hồng nuôi công nghiệp nhưng cũng chưa có kết quả. Những nghiên cứu
về miễn dịch học, trong đó có tìm hiểu cơ chế viêm trên đối tượng thủy sản ở nước
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 8 Đại học Nha Trang

ta còn ở giai đoạn sơ khởi và chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào nghiên cứu cơ chế
viêm ở cá sau khi tiêm vắc xin.
2.4. Cơ chế viêm trong đáp ứng miễn dịch ở cá
Viêm là hiện tượng xảy ra ở tổ chức tế bào, là phản ứng phòng vệ của sinh vật
trước sự tấn công hay kích thích từ bên ngoài lên cơ thể thông qua phản xạ của hệ
thống thần kinh. Đây là một quá trình bệnh lý cơ bản, bao gồm một số quá trình nhỏ
sau:
 Biến đổi về chất của tổ chức tế bào tại vùng viêm
Tại vùng viêm, dưới tác dụng của tác nhân gây bệnh gây ra một số tế bào sẽ bị
chết. Khi chứng viêm bắt đầu, biến đổi về chất của tế bào xảy ra ưu tiên ở chính
giữa ổ viêm, còn xung quanh biến đổi về chất không rõ ràng. Nguyên nhân làm thay
đổi về chất của tế bào do trao đổi chất bị rối loạn, thiếu chất dinh dưỡng cung cấp
đến và do những kích thích cơ và hóa học cục bộ của tác nhân gây bệnh. Mặt khác,
hệ thống tuần hoàn bị rối loạn, làm tế bào phát sinh những biến đổi gây hoại tử. Kết
quả của quá trình này tạo ra các chất phân giải như protein và các axit hữu cơ.

bởi 5-hydroxytryptamin (serotonin) (Nilsson & Holmgren 1992). Đáp ứng tế bào
trong phản ứng viêm trải qua 2 giai đoạn, thoạt đầu là sự gia tăng số lượng bạch cầu
trung tính từ máu chuyển đến, tiếp sau là sự xuất hiện của bạch cầu đơn nhân và đại
thực bào tại ổ viêm. Bạch cầu trung tính tập trung khoảng 1 giờ sau khi tiêm tác
nhân gây viêm và số lượng sẽ đạt cực đại sau 48 giờ (Afonso ctv,1998). Phản ứng
viêm được kích ứng và kiểm soát bởi một số yếu tố, bao gồm các amin gây giãn
mạch, các bổ thể, eicosanoid và cytokine được giải phóng trong đáp ứng đối với tổn
thương mô hoặc sản phẩm của các tác nhân gây bệnh. Các amin gây giãn mạch (5-
hydroxytryptamin) là các nhân tố tiền phát, phản ứng nhanh. Sau đó các yếu tố mới
được tổng hợp như eicosanoid và cytokine sẽ thu hút và hoạt hóa các bạch cầu. Sau
khi tới ổ viêm, bạch cầu sẽ giải phóng các yếu tố nhằm điều hòa phản ứng viêm
(Secombes 1996). Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 10 Đại học Nha Trang

Phần III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
 Thời gian thực hiện từ 20/02/2010 tới 18/06/2010
 Địa điểm:
+ Tiến hành bố trí thí nghiệm và thu mẫu tại Cam Ranh - Khánh Hòa.
+ Tiến hành phân tích và xử lý mẫu tại: Phòng bệnh cá, Trung tâm Nghiên cứu
Quan trắc và Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực
miền Bắc - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 (Đình Bảng - Từ Sơn - Bắc
Ninh).
3.2. Đối tượng nghiên cứu

xuất)

Hình 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm. Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 13 Đại học Nha Trang Hình 4: Vắc xin bất hoạt vi khuẩn Vibrio và nhũ dầu. Hình 5: Các bể bố trí thí nghiệm

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 14 Đại học Nha Trang

3.3.3. Phương pháp nghiên cứu mô học
Áp dụng phương pháp mô bệnh học ( Histopathological method ) truyền thống,
phương pháp này đã được ứng dụng cho nghiên cứu ở động vật thủy sản và được
giới thiệu bởi D.V Lightner (1996).
Sơ đồ khối các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học

Hình 6: Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học.
 Cố định và bảo quản mẫu: Dùng dụng cụ giải phẫu cắt lấy một miếng nhỏ
(khoảng 0,5cm

C) với thời gian ít nhất là 6h.
 Đúc mẫu trong Parafin: Lấy mẫu đã ngâm trong parafin, phân bố vào các
khuôn, ghi nhãn để không bị nhầm lẫn, sau đó đổ parafin nóng chảy vào khuôn,
dùng panh để sắp xếp mẫu vào chính giữa khuôn, chuyển vào dàn lạnh để khối mẫu
nhanh chóng đông cứng thành khối parafin chứa mẫu ở trong.
 Cắt và sấy mẫu: Mẫu sau khi đúc parafin xong, được gọt thành khối hình
thang cân hoặc hình chữ nhật. Sau đó, gắn lên máy Microtom và tiến hành cắt mẫu
với độ dày lát cắt 4-5µ. Lát cắt được đưa vào nước ấm 40-50
0
C trong khoảng 1-2
phút có thể lâu hơn để mẫu giãn hết cỡ không bị nhăn, trong nước ấm có bổ sung
lòng trắng trứng gà. Tiếp theo, dùng lam sạch lấy lát cắt ra khỏi nước và đặt lên
máy sấy ở nhiệt độ 45-60
0
C trong 1-4 giờ.
 Phương pháp nhuộm Hematoxyline và Eosin (H&E): Nhằm để phát hiện
những biến đổi trong tổ chức mô và tế bào khi nhiễm bệnh. Quy trình thực hiện
nhuộm H&E như sau:
 Làm mất parafin:
 Xilen I : 5 phút
 Xilen II: 5 phút
 Làm no nước mẫu:
 Etanol 100% 2-3 phút
 Etanol 100% 2-3 phút
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 16 Đại học Nha Trang

 Etanol 95% 2-3 phút

4.1 Kết quả nghiên cứu
4.1.1 Đặc điểm mô học cơ cá Giò khỏe
Tiến hành tiêm cá Giò vào vị trí cơ lưng, cấu tạo chủ yếu là mô cơ vân.

Hình 7: Mô cơ cá Giò bình thường.
(sợi vân ngang (vùng B) và vân dọc (vùng C), H&E; A(×40), B(×100), C(×400), D(×1000)).
Hình 7 là tiêu bản mô cơ cá Giò khỏe ở các độ phóng đại khác nhau ×40, ×100,
×400, ×1000. Mô cơ vân bao gồm rất nhiều các sợi cơ liên kết với nhau, xếp song
Da

B

C

Nhân

Sợi
cơ
Tơ cơ
A

B

C

D

Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sản
thường
Da

O
Nguyễn Thị Phương Huyền K49 Bệnh học Thủy sảnKhóa luận tốt nghiệp - 2011 19 Đại học Nha Trang

những giọt dầu sau khi tiêm vào cơ lưng cá Giò được phân tán rải rác xen kẽ giữa
những sợi cơ (Hình 8).

Hình 9: Ổ viêm hình thành trong mô cơ 3 ngày sau khi tiêm nhũ dầu.
(H&E; ×100, Giọt dầu(O), vùng cơ bị hoại tử (khoanh tròn),vùng cơ chưa bị hoại tử ( ))
Vùng cơ rộng lớn đang bị hoại tử nghiêm trọng nằm ngay dưới lớp da cá Giò, bắt
màu thuốc nhuộm không đồng đều (Hình 9). Trung tâm ổ viêm có nhiều giọt dầu và
mô cơ đang dần bắt màu của thuốc nhuộm Hematocylin. Bên cạnh đó là những
vùng cơ bình thường chưa bị biến đổi (hình mũi tên), bắt màu hồng của thuốc
nhuộm Eosin. Vùng cơ bị hoại tử (khoanh tròn) có các sợi cơ bị phá hủy, rách nát,
nhất là quanh những giọt dầu (O) hầu như không còn nhìn thấy cấu trúc của cơ.
Liên kết trong mô lỏng lẻo, thưa dần tạo ra những khoảng rỗng lớn bắt màu thuốc
nhuộm không được rõ ràng khi quan sát ở độ phóng đại nhỏ. Điều này cho thấy hiện
tượng hoại tử diễn ra mạnh nhất tại trung tâm ổ viêm, mức độ giảm dần ra vùng
ngoại vi của ổ viêm.
O
O
O
O
Da
Cơ bị hoại tử