BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

HOÀNG THỊ MINH THU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2015
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT
SỐ PREBIOTICS LÊN QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY Lactobacillus acidophilus
VÀ Bifidobacterium longum
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HOÀNG THỊ MINH THU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên

Hoàng Thị Minh Thu MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
TỔNG QUAN 2 Chương 1.
1.1. Đại cương về probiotics 2
1.1.1. Khái niệm probiotics 2
1.1.2. Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotics 3
1.1.3. Tác dụng của probiotics với sức khỏe 6
1.2. Đại cương về prebiotics 8
1.2.1. Khái niệm prebiotics 8
1.2.2. Các chất được sử dụng làm prebiotics 9
1.2.3. Tác dụng của prebiotics với sức khỏe 12
1.3. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của prebiotics lên probiotics trên thế giới 13
1.4. Một số chế phẩm synbiotics trên thị trường Việt Nam 14
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 Chương 2.
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15
2.1.1. Nguyên vật liệu 15
2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15
2.1.3. Thiết bị 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 16

cfu
: Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc)
FAO
: Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới)
FOS
: Fructo – oligosacharid
GOS
: Galacto – oligosacharid
MRS
: de Man, Rogosa, Sharpe
MT
: Môi trường
NK
: Nature killer cells (tế bào diệt tự nhiên)
PPI
: Proton-pump inhibitor (Thuốc ức chế bơm proton)
VLDL
: Very Low Denstiy Lipoprotein (Lipoprotein trọng lượng rất thấp)
VSV
: Vi sinh vật
WGO
: World Gastroenterology Organization (Tổ chức Tiêu hóa thế giới)
WHO
: World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT
Tên bảng
Trang

Trang
1
Hình 1.1. Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi điện tử
4
2
Hình 1.2. Bifidobacterium longum dưới kính hiển vi điện tử
5
3
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của inulin
10
4
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của lactulose
11
5
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và pH
dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ inulin bổ sung vào môi trường
nuôi cấy L. acidophilus
21
6
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên pH và mật độ quang dịch
nuôi cấy khi thay đổi nồng độ inulin bổ sung vào môi trường nuôi
cấy B. longum
25
7
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và pH
dịch nuôi cấy khi thay đổi nồng độ lactulose bổ sung vào môi
trường nuôi cấy L. acidophilus
29
8
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn biến thiên pH và mật độ quang dịch


TỔNG QUAN Chương 1.
1.1. Đại cương về probiotics
1.1.1. Khái niệm probiotics
Probiotics là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”,
dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho vật chủ .
Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên
men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà khoa
học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở khoa
học. Trong cuốn sách “Kéo dài sự sống” của mình xuất bản năm 1907, ông nhận thấy
ăn sữa chua có chứa vi khuẩn lactic làm giảm số lượng các vi khuẩn có hại trong
đường ruột và giúp con người sống lâu hơn [6]. Thuật ngữ “probiotics” được nhắc đến
lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath. Theo ông, probiotics là “các yếu tố có nguồn
gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [15]. Đến năm 1989,
Fuller mới đưa ra một định nghĩa đầy đủ đầu tiên về probiotics: “probiotics là thực
phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải
thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [53].
Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về
probiotics ở thời điểm hiện tại như sau: “probiotics là những vi sinh vật sống mà khi
đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ”
[68], [72]. Theo đó, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn chủng vi khuẩn probiotics sử
dụng dưới dạng thực phẩm là chủng đó phải có khả năng sống sót qua hệ tiêu hóa và
phải có khả năng phát triển trong ruột. Do trong quá trình sử dụng, vi khuẩn probiotics
phải đối mặt với nhiều điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng,
bất cứ sản phẩm chứa probiotics nào cũng phải chứa ít nhất 10
6
cfu/ml tế bào vi sinh
vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị (FAO/WHO) [6],
[59].
3

L. acidophilus có khả năng lên men nhiều loại đường như glucose, fructose,
galactose, mannose, maltose, lactose và sucrose, quá trình này tạo ra các acid hữu cơ
(chủ yếu là acid lactic) làm giảm pH môi trường, ngoài ra có thể tạo ra các chất khí như
H
2
và CO
2
. Một vài chủng lên men raffinose, trehalose và dextrin yếu. L. acidophilus
không lên men các đường xylose, arabinose, rhamnose, glycerol, mannitol, sorbitol,
dulcitol và inositol [9].
4 L. acidophilus chiếm tỉ lệ chủ yếu trong số các vi sinh vật có ích cư trú ở ruột non
[23]. Chúng đối kháng lại sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh đường ruột như
Staphylococcus aureus, Salmonella typhimuriuma và Clostridium perfringens bằng
cách cạnh tranh chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí bám lên niêm mạc ruột
của các vi khuẩn gây bệnh, sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho vi khuẩn
có hại không phát triển được, do đó góp phần chống lại các nhiễm khuẩn đường ruột,
phòng ngừa bệnh tiêu chảy [34]. L. acidophilus còn giúp ngăn ngừa cholesterol máu
cao nhờ tác dụng phân giải các acid mật thành các acid tự do, buộc cơ thể phải tổng
hợp mới acid mật từ cholesterol, gây ra tác dụng giảm nồng độ cholesterol toàn phần
trong cơ thể [23], [65]. Ngoài ra L. acidophilus làm tăng các đáp ứng miễn dịch không
đặc hiệu như chức năng thực bào, số lượng các tế bào NK và các đáp ứng miễn dịch
đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế bào lympho,…), vì
vậy góp phần cải thiện chức năng miễn dịch của vật chủ. Một vài nghiên cứu khác còn
chứng minh L. acidophilus làm tăng cường chức năng của hệ tiêu hóa, làm giảm triệu
chứng khó tiêu, cải thiện khả năng dung nạp lactose và ngăn ngừa ung thư ruột kết
[34].
Hình 1.1. Lactobacillus acidophilus dưới kính hiển vi điện tử

huyết đường ruột do có khả năng sinh ra các hợp chất kết hợp với các verocytotoxin.
Ngoài ra B. longum còn giúp hỗ trợ trong điều trị bệnh celiac (bệnh lý đường ruột gây
ra bởi tình trạng nhạy cảm với gluten, một loại protein được tìm thấy trong lúa mì, gây
đến tình trạng viêm và bất sản niêm mạc ruột non), do đó cải thiện tình trạng sức khỏe
của các bệnh nhân mắc bệnh này [45]. B. longum cũng giúp hỗ trợ giảm cân và điều trị
táo bón. Thử nghiệm cho thấy những người sử dụng B. longum đạt được kết quả điều
trị táo bón tốt hơn so với những người dùng thuốc nhuận tràng [8]. B. longum còn có
thể được sử dụng như vector vận chuyển gen để điều trị ung thư vú bằng cách đưa
plasmid có gen cytosine deaminase vào B. longum. Những B. longum vận chuyển này
sẽ tạo ra cytosine deaminase trong các khối u kị khí. Đây là một phương pháp đầy triển
vọng và hứa hẹn trong tương lai [29].
1.1.3. Tác dụng của probiotics với sức khỏe
Probiotics có một số tác dụng chính như sau:
a. Ứng dụng trị liệu trong một số bệnh đường tiêu hóa ở người
 Ngăn chặn bệnh tiêu chảy
Probiotics được chứng mình là có tác dụng trong điều trị bệnh tiêu chảy. Hai tác
nhân có hiệu quả rõ rệt trong việc phòng ngừa tiêu chảy do kháng sinh là vi khuẩn
Lactobacillus rhamnosus GG và nấm men Saccharomyces boulardii [66]. Các tác nhân
khác đang được nghiên cứu là Bacillus clausii, Bifidobacterium longum, Lactobacillus
acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, [5], [66].
7

 Tác dụng lên bệnh viêm loét dạ dày tá tràng
Nhiều nghiên cứu cho thấy điều trị viêm loét dạ dày tá tràng dùng kết hợp phương
pháp điều trị bằng PPI và kháng sinh với chế phẩm probiotics đã làm giảm đáng kể tác
dụng không mong muốn của kháng sinh đến hệ vi sinh vật đường tiêu hóa. Do vậy, sử
dụng probiotics để phòng ngừa các bệnh lý liên quan đến viêm loét dạ dày tá tràng là
một hướng điều trị được chú ý trong những năm gần đây [23], [27].
Ngoài ra, probiotics còn có một số tác dụng khác như: tăng cường khả năng tiêu
hóa lactose và hoạt động của các enzym khác, điều trị rối loạn tiêu hóa do dùng kháng

xác có bao nhiêu dòng vi khuẩn có lợi nằm trong số các loài vi khuẩn được kích thích
ấy. Do đó vào năm 2007, các tác giả đã xem xét lại và đưa ra một khái niệm mới, trong
đó prebiotics được định nghĩa là thành phần được lên men có chọn lọc, tạo ra sự thay
đổi về thành phần và/hoặc hoạt động của hệ vi sinh vật đường ruột, mang lại lợi ích
cho sức khỏe vật chủ [42], [56].
Năm 2011, WGO cũng đưa ra định nghĩa về prebiotics, được phát biểu như sau:
“prebiotics là những thành phần thực phẩm (hầu hết là chất xơ và các oligosaccharid
không bị tiêu hóa bởi enzym trong cơ thể con người) nuôi dưỡng một nhóm vi sinh vật
chọn lọc đường ruột. Chúng kích thích sự phát triển của các vi sinh vật có lợi hơn là
các vi sinh vật gây hại” [46].
Vai trò của prebiotics là kích thích có chọn lọc sự phát triển và hoạt động của các
vi khuẩn có lợi như vi khuẩn lactic, vi khuẩn bifido, do đó, để tăng hiệu quả của
prebiotics cũng như probiotics, synbiotics đã ra đời. Theo Gibson và Roberfroid,
synbiotics là hỗn hợp của probiotics và prebiotics phù hợp, mang lại tác động có lợi
cho con người bằng cách cải thiện khả năng sống sót và phát triển của vi sinh vật sống
9

được bổ sung trong ruột [30]. Synbiotics thể hiện cả tác dụng của probiotics và
prebiotics [46].
1.2.2. Các chất được sử dụng làm prebiotics
Theo Gibson và Roberfroid, không phải bất cứ loại carbohydrat nào cũng có thể
xếp vào prebiotics mà chúng cần thỏa mãn các điều kiện sau [56]:
 Chống chịu được môi trường acid dạ dày, không bị phân giải bởi enzym đường
ruột và không bị hấp thu ở ruột.
 Có khả năng lên men bởi các vi khuẩn đường ruột.
 Kích thích có chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt động của vi khuẩn đường ruột
có lợi cho sức khỏe.
Hiện nay chỉ có những carbohydrat như inulin, fructo-oligosaccharid (FOS), (trans-
) galacto-oligosaccharid (TOS hoặc GOS) hay lactulose là đáp ứng được các yêu cầu
này [42], [46]. Prebiotics chủ yếu kích thích sự phát triển của vi khuẩn bifido, vì vậy

 Lactulose [51]
Lactulose (4-0-β-D-galactopyranosyl-D-fructofuranose) là một disaccharid tổng
hợp, sản phẩm đồng phân hóa của lactose, cấu tạo gồm hai phân tử đường fructose và
galactose liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glycosidic. Liên kết này của lactulose
Hình 1.3. Công thức cấu tạo của inulin
11

không bị thủy phân bởi các enzym tiêu hóa của động vật có vú do đó lactulose có thể
bền vững trong dạ dày [58] và đến ruột già bị các vi sinh vật phân giải tạo thành acid
lactic, acid acetic và acid formic, làm giảm pH đường ruột, ức chế sự hình thành và
tăng đào thải amoniac đồng thời tăng áp suất thẩm thấu thúc đẩy nhu động ruột [63].
Lactulose được sử dụng đặc trưng bởi Bifidobacterium sống trong đường ruột của
người [67]. Chúng kích thích sự phát triển của vi khuẩn có lợi trong đường ruột như vi
khuẩn bifido (Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum…) và vi khuẩn lactic
(Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei…), đồng thời ngăn chặn vi khuẩn có
hại như Salmonella [7], [49]. Trong công nghệ thực phẩm, lactulose được sử dụng rộng rãi trong sữa bột, sữa
chua, bánh mì, bánh quy, socola,… và còn được sử dụng như đường thay thế cho bệnh
nhân tiểu đường [18], [67]. Trong công nghệ dược phẩm, lactulose được sử dụng để
điều trị bệnh táo bón do có tác dụng thẩm thấu tại chỗ ở đại tràng, nên làm tăng lượng
nước trong phân, làm mềm phân và kích thích nhu động ruột. Ngoài ra, khi vào trong
ruột, lactulose được chuyển hóa bởi các vi khuẩn đường ruột thành acid lactic và một
lượng nhỏ acid acetic và acid formic. Những acid này làm giảm pH của phân và
chuyển amoniac là dạng khuếch tán sang dạng ion amoni không khuếch tán được từ
ruột vào máu, làm giảm amoniac máu, do đó lactulose được dùng để điều trị bệnh não
gan, biến chứng của bệnh gan. Ngoài ra lactulose còn có tác dụng điều trị nhiễm
Hình 1.4. Công thức cấu tạo của lactulose
12

giảm, đồng thời còn giảm việc gan nhiễm mỡ [22].
 Hấp thu chất khoáng
Prebiotics giúp cải thiện lượng hấp thu canxi, magie, sắt, kẽm…, tăng cường trao
đổi khoáng chuyển thành xương, do đó có lợi trong việc ngừa loãng xương cũng như
phòng tránh bệnh thiếu máu liên quan đến chế độ ăn uống và tăng cường sự hấp thu vi
chất dinh dưỡng để tránh tình trạng suy dinh dưỡng.
Ngoài ra prebiotics còn giúp hỗ trợ điều trị các bệnh tiêu hóa như viêm loét đại
tràng, hội chứng kích thích ruột, táo bón, các bệnh truyền nhiễm và tiêu chảy có liên
quan đến kháng sinh [22].
1.3. Tình hình nghiên cứu ảnh hưởng của prebiotics lên probiotics trên thế giới
Mỗi loại prebiotics chỉ phù hợp với một hoặc một số probiotics nhất định. VSV chỉ
có thể lên men một số loại prebiotics nếu chúng có enzym cần thiết để thủy phân liên
kết trong phân tử prebiotics đó. Vì vậy muốn tăng khả năng sống sót và sinh trưởng
của một loài VSV sử dụng trong chế phẩm probiotics, cần thiết phải lựa chọn
prebiotics thích hợp với nó để tạo thành synbiotics. Từ khi ra đời, synbiotics đã thu hút
mạnh mẽ sự chú ý của các nhà khoa học. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để xác
định các synbiotics tiềm năng trên cơ sở kết hợp prebiotics và probiotics. Phương pháp
chung được sử dụng là nuôi cấy VSV probiotics trong môi trường bổ sung prebiotics
rồi đánh giá khả năng sinh trưởng và sống sót của VSV bằng một số kĩ thuật như: sắc
ký trao đổi ion, đo mật độ quang, đếm số lượng tế bào VSV, đo pH và định lượng các
sản phẩm của quá trình lên men. Tuy nhiên các báo cáo thu được lại cho nhiều kết quả
trái ngược nhau [13], [31], [35], [47], [54], [60].
Như nghiên cứu của Heubner [31] cho thấy L. paracasei 1195 phát triển tốt hơn ở
môi trường MRS bổ sung FOS 10g/L và inulin 10g/L so với môi trường MRS thường,
trong khi nghiên cứu của Kaplan và Hutkins [35] khẳng định L. paracasei không có
14

khả năng lên men FOS. Nghiên cứu của Rastall và Maitin [54] thì chỉ ra inulin hầu như
không kích thích sự phát triển của vi khuẩn bifido trong khi ngược lại, báo cáo của B.
Özer [47] thể hiện inulin và lactulose đều thúc đẩy B. bifidum BB-02 tăng sinh trong đó

cfu/g),
Bifidobacterium longum (0,5.10
8
cfu/g), Bifidobacterium breve (0,5.10
8
cfu/g),
Enterococcus faecium (10
8
cfu/g), FOS, GOS, Lactulose.
Nhà sản xuất: Cell Biotech – Korea.
15

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 2.
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Nguyên vật liệu
 Chủng vi sinh vật: Lactobacillus acidophilus ATCC 4653
Bifidobacterium longum BB536
 Nguyên liệu:

Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Tên hóa chất
Nguồn gốc
Glucose
Trung Quốc
MnSO
4
.4H
2

L–cystein
Trung Quốc
Lactulose
Duphalac (Abbott)

2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu
 MRS lỏng (MT1)
Glucose 20g Acetat natri 5g
Pepton 10g K
2
HPO
4
2g
Cao thịt 10g MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
Cao nấm men 5g MnSO
4
.4H
2
O 0,05g
Triamoni citrat 2g Nước máy vđ 1000mL
pH 6,8 ÷ 7,0
16  Môi trường MRS đặc nuôi cấy Lactobacillus acidophilus (MT2)
MT2 = MT1 + thạch agar (20g/1000mL môi trường).

2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của inulin lên khả năng sinh trưởng và phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum
 Xác định tác dụng của inulin lên quá trình sinh trưởng, phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.
17

 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ inulin lên quá trình sinh trưởng, phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của lactulose lên khả năng sinh trưởng và phát triển
của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum
 Xác định tác dụng của lactulose lên quá trình sinh trưởng, phát triển của
Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ lactulose lên quá trình sinh trưởng, phát triển
của Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium longum.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống
Pha các môi trường MT1 (đối với Lactobacillus acidophilus) hoặc MT3 (với
Bifidobacterium longum) với thành phần công thức được liệt kê tại mục 2.1.2. Phân
phối môi trường vào các ống nghiệm sạch, 10mL/ống, nút kín. Tiệt khuẩn môi trường
tại 115
o
C/20 phút trong nồi hấp tiệt khuẩn. Để nguội xuống nhiệt độ phòng. Cấy giống
với tỉ lệ 10% vào các ống nghiệm trong tủ cấy vô trùng. Ủ các ống nghiệm đã được
cấy giống VSV trong tủ ấm 5% CO
2
trong 24h ở 37
o
C [4].
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Pha các môi trường MT1 (đối với Lactobacillus acidophilus) hoặc MT3 (với