Bộ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYÊN THỊ NHƯ QUỲNH
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT
BERBERIN
TỪ VÀNG ĐẮNG BẰNG Nước VÔI
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược sĩ
• • •
Người hướng dẫn:
TS. Nguyễn Văn Hân
Noi thực hiện:
Bộ môn Công nghiệp dược
■ ■ 'ìi
Ợ
'
/ỈHÀ NỘI-2013
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện khóa luận này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn
và giúp đỡ tận tình về mọi mặt từ các thầy cô, bạn bè. Nhân dịp này, tôi xin được
bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tớ i:
TS. Nguyễn Văn Hân
Người thầy đã dành cho tôi sự hưóng dẫn, giúp đỡ quý báu. Tôi cũng xin
bày tỏ lòng biết OTI sâu sắc đối với sự giúp đỡ nhiệt tình của các Thầy cô giáo,
anh chị kỹ thuật viên ở Bộ môn Công nghiệp dược, các thầy cô trong Ban giám
hiệu, Phòng đào tào cùng toàn thể các thầy cô, cán bộ trong trường đại học Dược
Hà Nội đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin cảm on gia đình và bạn bè đã động viên, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện khóa luận này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Sinh viên
Nguyễn Thị Như Quỳnh
13
m
2.2. Nội dung nghiên cứu 14
2.2.1. Xác định hàm lượng berberin trong dược liệu vàng đắng
14
2.2.2. Xác định độ tan của berbem clorid trong nước vôi trong và
acid sulâiric 0,4% 14
2.2.3. Khảo sát phưong pháp chiết xuất berberin bằng nước vôi
14
2.2.4. Tinh chế berberin 15
2.3. Phương pháp nghiên cứu 15
2.3.1. Phương pháp định lượng berberin 15
2.3.2. Phương pháp xác định độ tan 17
2.3.3. Phương pháp chiết xuất
18
2.3.4. Phương pháp tinh chế berberin clorid từ berberin th ô
19
Chương 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
21
3.1. Xác định hàm lượng berberin trong dược liệu vàng đắng
21
3.2. Xác định độ tan của berberin clorid trong nước vôi trong và acid
sulfuric 0,4% 22
3.3. Xác định nồng độ dung dịch nước vôi thích họp 23
3.4. Xác định số lần chiết thích họp 24
28
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, s ơ Đ ồ
Trang
Hình 1.1. Thân, lá, hoa và quả của cây vàng đắng
7
Hình 1.2. Lát cắt nghiêng thân, rễ cây vàng đắng 9
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết và tạo berberin clorid thô
19
Hình 2.2. Sơ đồ tinh chế berberin clorid thô
20
Hình 3.1. Sắc ký đồ berberin trong mẫu dược liệu 21
Hình 3.2. Hình ảnh sản phẩm berberin clorid thô
24
Hình 3.3. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết berberin với số lần chiết khác
nhau và dung môi khác nhau
26
Hình 3.4. Hình ảnh sản phẩm berberin tinh chế
29
Hình 3.5. Sơ đồ chiết xuất berberin từ vàng đắng
30
Hình 3.6. Sơ đồ tinh chế berberin clorid từ berberin th ô
31
ĐẶT VẤN ĐÈ
anthracen clorid dihydrat.
Lý tính: tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy
khi ở dạng base là 145”c (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm trong nước,
hơi tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400
trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong
cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ tan trong nước, tan trong ethanol [18].
Hóa tính', berberin có tính chất như một base bậc 4, tạo muối bằng cách thay thế
nhóm -OH, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà muối
tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại, nghĩa là có loại hai phân tử nước.
V í dụ: C20H18O4NOH + HCl => H2O + C20H18O4NCI [5].
1.1.2. Nguồn nguyên liệu chiết xuất berberỉn
Berberin là một alcaloid được phát hiện trong khoảng 150 loài thuộc
nhiều họ thực vật khác nhau: Họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên
(Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispemiaceae), họ Cam (Rutaceae)
Berberin thường có trong những cây thuộc chi Berberis, trong Từ điển cây
thuốc của Võ Văn Chi đã cho biết trong thân và rễ của Hoàng liên gai (Berberis
wallichiana. D. C) có chứa berberin [4].
Bên cạnh những cây thuộc chi Berberỉs cho berberin còn có những cây
khác cũng cho berberin như các cây thuộc chi Coptỉs: Coptỉs teeta Wall,
C.chỉnensis Franch, c.teetoỉdes C.Y.Cheng, c.deltoỉdea C.Y.Cheng et Hdiao[l]
với hàm lượng không ít hơn 4% [6].
Ngoài ra, berberin còn được tìm thấy trong vỏ các cây như: Hoàng bá
(Phellondendron amurense Rupr và p.chỉnense Schneider.y> với tỉ lệ 1,6% [6],
vàng đắng (Coscinỉum fenestratum Colebr.^ với hàm lưọng không ít hơn 1,5%
[6].
Hiện nay, người ta thường dùng vàng đắng để đưa vào sản xuất berberin
vì hàm lượng berberin trong thân và rễ cây cao, nguồn nguyên liệu nhiều, dễ thu
hái, có ở nhiều vùng của Việt Nam, biên giới Việt Lào, Campuchia. Do đó,
người ta coi vàng đắng là nguồn nguyên liệu số một để chiết xuất berberin.
1.1.3. Tác dụng dược lý và ứng dụng
ở dạng đơn chất hoặc có thể được dùng phối hợp với các thành phần hoạt chất
khác.
Dưới đây là một số ví dụ về các chế phẩm có chứa berberin.
Viên nang - Berberin lOOmg
CĐ: Nhiễm trùng đường một, tiêu chảy, lỵ, trực trùng, hội chứng lỵ, viêm ống
mật.
CCĐ: Quá mẫn, phụ nữ có thai.
NSX: Cty CP XNK Domesco.
Viên nén bao phim - Mộc hoa trắng - HT
Tp: Cao đặc Mộc hoa trắng 136mg
Berberin chlorid 5mg
Mộc hương lOmg
TD: vừa đủ một viên nén bao film
CĐ: lỵ, amip gây đau bụng, viêm đại tràng, tiêu chảy, ăn uống không tiêu, nhiễm
khuẩn đường tiêu hóa.
CCĐ: Phụ nữ có thai.
NSX: Cty CP Dược & TBYT Hà Tĩnh.
Thuốc nhỏ mắt - Naphacollyre
Dạng bào chế: Thuốc nhỏ mắt
Thành phần: Natri sulphacetamid: 1 g
Chlorpheniramin maleat: 0,002 g
Naphazolin nitrat: 0,0025 g
Berberin HCl; 0,0002 g
Nước cất, tá dược vừa đủ 10 ml.
Công dụng: Đau mắt đỏ, đau mắt hột, nhức mỏi mắt, viêm kết mạc. Các trường
hợp ngứa mắt do dị ứng.
Liều dùng: Nhỏ mắt mỗi lần 2-3 giọt, mỗi ngày 4- 5 lần.
Đóng gói: Hộp 8ml, hộp lOml
1.2. Cây vàng đắng
Vàng đắng thuộc chi Coscinium, là một chi nhỏ trong họ Tiết dê
không cuống, bao hoa có 6 - 9 bộ phận phía trong dài 1,5-2 cm, các bộ phận
ngoài cùng nhỏ hơn dài 1 - 1,5 mm đính thấp hơn. Bộ nhị có 6 nhị xếp thành 2
vòng; vòng ngoài gồm 3 nhị rời, dài 1 mm, 3 nhị ở vòng trong dính liền nhau ở
phía dưới. Hoa cái có bao giống như hoa đực, 6 nhị lép hình chùy dài 1 mm, bộ
nhụy gồm 3 lá noãn dài 2 mm, có lông dày, vòi hình sợi, uốn cong.
Chùm quả dài 10 - 15 cm, mang 20-30 quả hạch hình cầu, đường kính
2,5 - 3 cm, mặt ngoài có lông màu nâu đến vàng cam, thịt quả màu vàng, vị
đắng; vỏ quả trong tạo thành hạch cứng, dày tới 3 mm; mùa hoa quả : tháng 1 -
5 [2].
1.2.2. Phân bố và sinh thái
Chi Coscỉnỉum là một chi nhỏ trong họ Tiết dê (Menispermaceae) gồm có
2 loại, phân bố chủ yếu ở các nước vùng nhiệt đới. ở Việt Nam cây mọc phổ
biến ở miền Đông nam bộ, Nam trung bộ, Tây nguyên, Đồng Nai, Quảng Nam,
Đà Nang, Bình Định, Gia Lai, Đắk Lắk, Khánh Hòa, Bình Thuận Ngoài ra còn
thấy ở Lào, Campuchia, Ấn Độ, Malaixia, Xrilanca.
Vàng đắng thu hái hầu như quanh năm, thu hoạch về thái mỏng, phơi hay
sấy khô hoặc không chế biến gì khác [2],
1.2.3. Bộ phận dùng
Đoạn thân hình trụ, đường kính 1,5-6 cm, dài ngắn không nhất định, mặt
ngoài màu vàng, có vết bạc loang lổ, có đoạn có chỗ phình to tròn, có vết lõm
tròn do vết tích của cành non và cuống lá, có vết khía và nứt dọc nhỏ, đôi chỗ
bong mất lớp bần.
Hình 1.2. Lát cất nghiêng thân, rễ cây vàng đắng
Đoạn rễ hình trụ, màu vàng sẫm, không có bướu. Mặt cắt ngang có lớp vỏ
mỏng màu nâu nhạt,, phần gỗ màu vàng có tia tủy hình nan hoa bánh xe, lỗ chỗ
có nhiều chấm nhỏ (mạch gỗ), không mùi, vị đắng [2].
1.2.4. Thành phần hóa học
Trong thân và rễ cây vàng đắng ngoài berberin 1,5 - 3 %, còn có ít
palmatin, jatroưhizin [2].
10
viên, ngày uống 4 - 6 gam. Vàng dắng dùng làm nguyên liệu để chiết xuất
berberin. Berberin clorid dùng để chữa lỵ, ỉa chảy, đau mắt. Ngày uống 0,02 -
0,20 gam dưới dạng thuốc viên. Người ta còn dùng để chữa bệnh về gan, vàng
da, ăn uống
jkhó tiêu; hoặc pha dd 0,5 - 1% dùng để nhỏ mắt đau, hay để rửa mắt
[10].
Theo Vố Văn Chi: ở Ẩn Độ người ta dùng rễ vàng đắng để chữa lỵ, và
dùng ngoài rửa mụn nhọt, vết thương. Nước sắc vỏ dùng chữa sốt gián cách,
nước sắc thân dùng để trị rắn cắn [4],
Karbovic và Bespalova đã cho biết: vàng đắng dùng làm thuốc cầm máu
trong phụ khoa sau khi đẻ, viêm túi mật. Berberin Sulfat là giảm huyết áp, dùng
trị viêm túi mật và đặc biệt là bệnh sỏi mật. Dùng dạng viên nén 0,005 gam. Còn
12
Maskovski lại cho rằng: berberin Sulfat dùng chữa viêm gan, viêm túi mật, sỏi
mật, ngày 5 - 1 Omg, đợt điều trị từ 2 - 4 tuần.
1.3. Chiết xuất berberin từ thân cây vàng đắng
Berberin được chiết từ thân và rễ cây vàng đắng theo quy trình như sau:
300g bột thân và rễ vàng đắng, thêm 1 lít dung dịch acid sulfuric 0,4%, khuấy
đều, ngâm trong 24 giờ. Cứ 1 giờ khuấy lại 1 lần. Rút dịch chiết. Tiến hành chiết
tương tự để thu được dịch chiết lần 2. Dịch chiết lần 2 được sử dụng làm dung
môi chiết lần 1 cho mẻ khác. Thêm 20 gam natri clorid vào dịch chiết lần 1.
Khuấy mạnh cho tan hết natri clorid rồi để 24 giờ cho berberin kết tủa. Gạn lấy
phần tủa. Lọc và rửa tủa cho hết phản ứng acid, thu được berberin clorid thô.
Tẩy màu: Berberin thô hòa tan trong 5 phần ethanol 96°. Thêm than hoạt (lượng
than bằng 2 - 5% lượng berberin thô). Lắp sinh hàn hồi lưu, đun sôi trong 10
phút. Lọc nóng qua phễu Buchner để loại than hoạt. Thu dịch lọc. Dịch lọc để
kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner. Rửa tinh
thể 2 lần bằng ethanol 96°. sấy tinh thể trong tủ sấy ở 60°c [1].
Ngoài ra, còn có phương pháp chiết xuất berberin tò Hoàng Liên chân gà
{Coptis teeta Wall.) bằng ethanol 96%; Dược liệu khô (có chứa chủ yếu alcaloid
4
NaCl công nghiệp
Việt Nam
5
Than hoạt
p, Trung Quốc
6
Ethanol 96%
Việt Nam
7 Nước cất
Việt Nam
8
Vôi sống (CaO)
> Thiết bị, dụng cụ:
Tủ sấy MEMMERT (Đức)
Cân kỹ thuật điện tử Sartorius BP 20015 (Đức)
Cân phân tích Mettler Toledo AB204 - s ( Thụy Sỹ)
Máy khuấy từ Heidolph MR3001 (Đức)
14
• Máy săc kí lỏng hiệu năng cao Shimadzu (Nhật Bản), bao gôm: bộ phân
loại khí DGU - 14A, bơm cao áp LC - lOADVP, buồng chứa cột CTO -
lOAVP, bộ điều khiển SCL - lOAVP, detector dãy diod quang SPD - MIOAVP
và phần mềm Class vp 6.14
• Máy xay, máy hút chân không, bếp đun cách thủy
• Cốc thủy các loại, bình định mức các loại, pipet các loại, ống đong các
loại.
• Màng lọc cellulose acetat 0,45|im (Satorius)
• Bình chiết chịu acid, bông, phễu lọc Buchner
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xác định hàm lượng berberin trong dược liệu vàng đắng
độ chính xác khoảng 0,1 mg/ml (Cc).
Dung dịch thử:
Mau 1 - Mau thử là berberin clorid thô hoặc berherin tình chế: Cân chúih
xác một lưọng mẫu (nit) tương đương với 25 mg berberin clorid cho vào bình
định mức 250 ml. Thêm 150 ml pha động, lắc cho đến khi tan hết, bổ sung pha
động đến vạch thu được dung dịch có nồng độ Ci. Lọc qua giấy lọc, bỏ 20ml
dịch lọc đầu thu được dung dịch thử.
Mầu 2 - Với mẫu thử là bột dược liệu: Cân chính xác khoảng 100 mg (nit)
bột dược liệu (qua rây 710) vào bình định mức lOOml, thêm 80 ml pha động, lắc
siêu âm trong 40 phút, để nguội, thêm pha động đến vạch, lắc đều, lọc thu được
dung dịch thử.
Pha động: Hòa tan 3,4 gam kali dihydrophosphat trong hỗn hợp nước -
acetoniừil (1 : 1) và pha loãng thành 1000 ml với cùng dung môi.
Điều kiện sắc kỷ:
16
Cột thép không gỉ (25 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh Ci8 (5 ụm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 345 nm.
Nhiệt độ cột: 40°c.
Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút.
Thể tích tiêm: 5 ịil.
Cách tiến hành: Lần lượt tiêm 5 1^1 dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ
thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã mô tả.
2.3.I.3. Tính kết quả:
Gọi diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch thử lần lượt
là Sc và Sf Ta có:
Hàm lượng berberin trong dược liệu là:
StX rric X 2
o/o X = y X 100%
Sc X rrtai X 5
Hàm lượng bererin trong mẫu 1 là:
Chiết xuất: Cân 300 gam dược liệu. Lắp lưới và lót bông vào bình chiết.
Cho bột dược liệu vào bình chiết. Thêm 1 lít dung môi chiết, khuấy đều,
ngâm trong 24 giờ. Cứ 1 giờ khuấy lại một lần. Rút dịch. Tiến hành chiết tương
tự để thu được dịch chiết lần n.
Tạo tủa thô: Thêm 20 gam natri clorid vào dịch chiết (Nếu dung môi
chiết là nước vôi thì trung hòa bằng acid hydrocloric loãng đến PH = 3 trước khi
thêm NaCl). Khuấy mạnh cho tan hết natri clorid rồi để 24 giờ cho berberin kết
tủa. Gạn lấy phần tủa. Lọc và rửa tủa bằng dung dịch acid hydrocloric 0,4% để
loại tạp chất. Sau đó rửa tủa bằng nước cho hết phản ứng acid. Thu được
berberin clorid thô
18
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết và phân lập herherỉn clorid thô
2.3.4. Phương pháp tinh chế berberin clorid từ berberin thô
2.3.4.1. Sơ đồ quy trình (Hình 2.2.)
2.3.4.2. Mô tả quy trình
Tẩy màu bằng than hoạt: Cân 2gam berberin thô hòa tan trong 20 ml dung
môi tinh chế. Thêm 0,05 gam than hoạt. Đun cách thủy ở 80°c, khuấy trong 10
phút. Lọc nóng trên phễu Buchner để loại than hoạt, thu dịch lọc. Đậy kín dịch
lọc bằng màng PE, để kết tinh qua đêm ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy tinh thể trên
phễu Buchner. sấy tinh thể trong tủ sấy ở 60°c.
Copyright: Tài liệu đại học ©