BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN KIỀU DUYÊN NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH VÀ ĐÁNH GIÁ
SỰ THAY ĐỔI HÀM LƯỢNG ALCALOID TRONG CỦ
CÂY BÌNH VÔI - Stephania glabra (Roxb.) Miers,
THEO NĂM TUỔI VÀ THEO MÙA TRONG NĂM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI: 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

2. GS. TS. Phạm Thanh Kỳ

HÀ NỘI 2014
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được
rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của Trường Đại học Dược Hà Nội, các Thầy Cô
giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp, bạn bè và
gia đình.
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới
GS. TS. Phạm Thanh Kỳ, TS. Nguyễn Quốc Huy đã trực tiếp hướng dẫn,
hết lòng chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
khoa học.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Các cán bộ Phòng Kiểm tra chất lượng là đồng nghiệp của tôi và lãnh đạo của tôi
là Ths. Phùng Minh Dũng, DSCK II. Trần Bình Duyên - Công ty cổ phần
Dược TW Mediplantex
Các thầy cô Bộ môn Thực vật, Bộ môn Dược liệu và Bộ môn Dược học cổ
truyền - Trường ĐH Dược Hà Nội
đã đóng góp những ý kiến quí báu cho tôi khi thực hiện luận văn
này.

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các Giảng viên, các Kỹ thuật viên Bộ


Chữ viết tắt
Viết đầy đủ
CP
Cổ phần
DC
Dịch chiết
DL
Dược liệu
DĐVN III
Dược điển Việt Nam III
DĐVN IV
GAP
Dược điển Việt Nam IV
Good Agricultural Practices
Thực hành tốt trồng trọt
HPLC
High-performance liquid chromatography
(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)
HL
hàm lượng
NN & PTNT
Nông nghiệp và phát triển nông thôn
NCKH
Nghiên cứu khoa học
S.
Stephania
SKĐ
STT
TCCS

32
5.
Hình 3.5: Cây mầm sau 6 tháng gieo hạt
35
6.
Hình 3.6: Cây con vừa được vào bầu
36
7.
Hình 3.7: Nhà huấn luyện cây con
39
8.
Hình 3.8: Cây con được che bóng 75% sau 5 tháng ra bầu
39
9.
Hình 3.9: Cây con được che bóng 50% sau 5 tháng ra bầu
39
10.
Hình 3.10: Cây con được che bóng 25% sau 5 tháng ra bầu
40
11.
Hình 3.11: Cây giống đạt tiêu chuẩn trước khi đem trồng

40


27
6.
Bảng 2.6: Số lượng củ Bình vôi lấy mẫu theo số năm tuổi
28
7.
Bảng 2.7: Ngày lấy mẫu theo mùa trong năm
28
8.
Bảng 2.8: Giá trị tham khảo theo Test Dixon
30
9.
Bảng 3.9: Kết quả thực nghiệm theo dõi cách bảo quản hạt
33
10.
Bảng 3.10: Bảng quy trình xử lý hạt
34
11.
Bảng 3.11: Theo dõi hạt nảy mầm ở 3 phương pháp xử lý hạt
34
12.
Bảng 3.12. Số lượng cây sống sau khi ra bầu
36
13.
Bảng 3.13. Sự phát triển của cây con sau khi ra bầu
37
14.
Bảng 3.14: Tỷ lệ cây con sống sau khi ra bầu 5 tháng
38
15.
Bảng 3.15: Sự sinh trưởng và phát triển của cây con

46
26.
Bảng 3.26: Đánh giá độ thích hợp và độ ổn định của hệ thống
47
27.
Bảng 3.27: Đánh giá mức độ ảnh hưởng các thành phần alcaloid tới

rotundin
48
28.
Bảng 3.28: Hàm lượng rotundin ở củ cây 1 tuổi, 2 tuổi, 3 tuổi
48
29.
Bảng 3.29. Hàm lượng rotundin ở củ cây 2 tuổi, 3 tuổi, 4 tuổi
49
30.
Bảng 3.30: So sánh hàm lượng rotundin trong củ theo tuổi
49
31.
Bảng 3.31: Số lượng pic và % diện tích rotundin so với tổng diện tích
của alcaloid toàn phần
50
32.
Bảng 3.32 Kết quả định lượng rotundin theo mùa trong năm
50
33.
Bảng 3.33: Dữ liệu so sánh hàm lượng rotundin giữa các mùa

1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
3
1.1. Tình hình khai thác và nhu cầu sử dụng Bình vôi
1.1.1. Tình hình khai thác
1.1.2. Nhu cầu sử dụng
1.2. Đặc điểm thực vật và thành phần hóa học loài Stephania glabra (Roxb.) Miers
1.2.1. Đặc điểm thực vật
1.2.2. Thành phần hóa học
1.3. Phƣơng pháp định lƣợng, hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin ở củ một
số loài Việt Nam
1.3.1. Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần
1.3.2. Hàm lượng alcaloid toàn phần có trong củ một số loài Bình vôi
1.3.3. Phương pháp định lượng rotundin
1.3.4. Hàm lượng rotundin có trong củ một số loài Bình vôi
1.4. Sinh lý nẩy mầm của hạt và ƣu điểm nhƣợc điểm, một số yếu tố ảnh hƣởng
tới nhân giống hữu tính
1.4.1. Sinh lý học nẩy mầm củ hạt
1. 4.2. Ưu nhược điểm của phương pháp nhân giống hữu tính
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính
1.5. Hƣớng dẫn của tổ chức y tế thế giới (WHO) thực hiện thực hành tốt trồng cây
thuốc
1.5.1. Nhận dạng/ xác định cây thuốc được trồng
3
3
3
4
4
7


2.1.2. Trang thiết bị nghiên cứu
2.1.3. Hóa chất, thuốc thử và chất chuẩn
24
24
24
25
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
25
2.2.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S.glabra
25
2.2.2. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng alcaloid toàn phần và rotundin trong củ Bình
vôi theo năm tuổi và theo các mùa trong năm
2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
28

31
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
32
3.1. Nghiên cứu nhân giống hữu tính cây Bình vôi S. glabra
3.1.1. Xác định thời điểm thu hái, hạt đạt tiêu chuẩn
3.1.2. Lựa chọn cách bảo quản hạt
3.1.3. Lựa chọn phương pháp xử lý hạt và thời hạn bảo quản hạt
3.1.4. Lựa chọn công thức dinh dưỡng bầu
3.1.5. Xác định mức độ che bóng cây con
3.1.6. Tiêu chuẩn cây con trước khi đem trồng
3.2. Sự thay đổi hàm lƣợng alcaloid toàn phần và rotundin trong của Bình vôi
(S. glabra) theo tuổi và theo các mùa trong năm
3.2.1. Khảo sát sự thay đổi khối lượng củ theo tuổi
3.2.2. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ S. glabra theo tuổi
3.2.3. Định lượng alcaloid toàn phần trong củ theo các mùa trong năm ở cây trưởng

52
54

KẾT LUẬN
ĐỀ XUẤT
57
59

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC 1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Bình vôi (Stephania Lour.) là một chi lớn trên thế giới, được phân bố
chủ yếu ở các nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan…Việt Nam có
khoảng 20 loài Bình vôi, Bình vôi là dược liệu được sử dụng nhiều trong Y Dược
học cổ truyền và trong công nghiệp chiết xuất rotundin để làm nguyên liệu bào
chế thuốc tân dược với tác dụng an thần, gây ngủ. Tại công ty CP dược TW
Mediplantex hàng năm có nhu cầu khoảng 3 tấn vị thuốc Bình vôi khô (tương
đương khoảng 40 tấn Bình vôi tươi) và khoảng 1000 tấn Bình vôi tươi để chiết
xuất lấy 3000 kg rotundin.
Qua các tài liệu nghiên cứu về hàm lượng rotundin trong các loài Stephania
ở Việt Nam có nhiều loài có hàm lượng cao như S. brachyandra, S.
kuinanensis, S. kwangsiensis, S. glabra [21], [29]. Một số loài có hàm lượng

3

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. TÌNH HÌNH KHAI THÁC VÀ NHU CẦU SỬ DỤNG BÌNH VÔI
1.1.1. Tình hình khai thác
Trữ lượng Bình vôi ở Việt Nam trước đây rất phong phú, gần 10 năm trở
lại đây, do bị khai thác ồ ạt bán qua biên giới và sử dụng trong nước, nên nguồn
nguyên liệu này bị cạn kiệt nhanh chóng. Hiện nay, giá của rotundin đã tăng lên
khoảng 10.000.000đ/kg, 1000 kg Bình vôi chiết được khoảng 2-3 kg rotundin. Giá
thu mua cao cũng là một trong những nguyên nhân làm cho củ Bình vôi ngày
càng bị khai thác cạn kiện. Bên cạnh đó phần lớn Bình vôi được các tiểu thương
thu mua và bán sang Trung Quốc qua đường tiểu ngạch. Bình vôi tự nhiên bị thu

Loài Bình vôi S. glabra là cây dây leo, cây lâu năm có thể dài tới 5-15m,
hoặc hơn. Toàn thân nhẵn, nhựa từ thân và lá không mang màu. Thân rễ phình to
thành củ, có dạng hình cầu hay bất định, kích thước lớn, đường kính thân có thể
lên tới 60 cm, khối lượng củ có thể lên đến 30-170 kg. Lá đơn, mọc so le, mép lá
nguyên, đôi khi hơi chia thùy phần ngọn lá. Toàn thân và lá không có lông. Cuống
lá dài 5-10cm, gốc cuống lá hơi phình lên và cong. Phiến lá to, hình tim với gốc lá
phẳng hoặc hơi lõm, ngọn lá thuôn nhọn, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới xanh lợt.
Gân lá có khoảng 11, xếp tỏa tròn do cuống lá đính vào 1/3 phiến lá tính từ gốc lá
[1], [10].
5

Cụm hoa đực dạng xim tán kép, cụm hoa càng về gốc cuống lá càng dài (3-
12cm). Mỗi cuống cụm hoa mang từ 5-8 tán, mỗi tán mang 8 tán cấp 2, mỗi cuống
tán cấp 2 lại mang 4 tán cấp 3, kết thúc gồm 3 hoa với cuống của mỗi hoa rất ngắn
(1-2 mm). hoa đực: đài 6, rời, hình trứng hẹp (phía móng hơi thu hẹp lại), xếp
thành 2 vòng (mỗi vòng 3) gần như bằng nhau, chiều dài 1,5mm. Hoa 3 cánh,
hình trứng, màu xanh lá khi còn trong nụ và màu vàng khi hoa nở, dài 0,8 – 1 mm,
rộng 1,2 mm. Bộ nhị hàn liền thành 1 trụ, bao phấn 6, màu vàng nhạt xếp thành
vòng tròn đường kính 0,6 - 1mm trên 1 trụ do chỉ nhị hàn liền biến thành cột ngắn
0,5-1 mm. Khi hoa nở các bao phấn mở nắp ngang quay ra xung quanh. Hạt phấn
nhỏ màu vàng. Khi hoa già các bao phấn tạo thành 1 viên tròn như vành khăn màu
nâu sẫm hoặc thâm đen [14], [29]
Cụm hoa cái dạng xim tán, cuống các bông hoa rất ngắn nên các bông hoa
xếp xít vào nhau thành dạng đầu. Mỗi đầu gồm 20-70 bông hoa. Cuống cụm hoa
dài 2-5 cm. Hoa cái không đều, đài 1, hình elip, dài khoảng 1mm; cánh hoa 2,
hình gần tròn, đường kính 1-1,2 mm; đài và cánh hoa xếp lệch về 1 phía của hoa.
Bầu hình trứng, núm nhụy chia 4-5 thùy dạng gai nhỏ và hầu như không có vòi
nhụy. Quả hạch, hình trứng ngược dài 5 - 6 mm, rộng 4-5mm. Vỏ quả ngoài nhẵn,
lúc non màu xanh, chuyển sang màu vàng đến đỏ sẫm khi chín. Hạt hình trứng
ngược, cụt một đầu, vỏ hạch cứng chia nhiều vạch (17- 20 vạch). Giá noãn có lỗ

- Thành phần hóa học trong củ Bình vôi gồm có alcaloid, flavonoid tinh bột,
đường khử, acid malic, men oxydase [31], [34], [35]. Trong đó alcaloid là thành
phần chính và được quan tâm nhiều nhất.
- Cho đến nay đã có trên 300 alcaloid được phân lập và xác định cấu trúc hóa học
từ các loài thuộc chi Stephania Lour. Từ loài S. glabra đã phân lập được một số
alcaloid như: rotundin, promeferin, grindarin, grindaricin, gindarinin, hyndarin,
magnoflorin, roemerin, stephararin, cycleanin, stepholidin, stepharin, palmatin,
dehydrocorydalmin, stephranin [31], [32], [33], [34].
1.2.2.2. Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài S. glabra tại Việt Nam
Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững đã phân lập được 2 alcaloid từ loài S. glabra là
rotundin và roemerin [30].
1.3. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG, HÀM LƯỢNG ALCALOID TOÀN
PHẦN VÀ ROTUNDIN CỦA MỘT SỐ LOÀI BÌNH VÔI Ở VIỆT NAM
1.3.1. Phương pháp định lượng alcaloid toàn phần
- Phương pháp cân [16], [17]: Phải chiết được alcaloid tinh khiết bằng dung môi
thích hợp, đem bốc hơi dung môi, sấy cặn tới khối lượng không đổi đem cân
- Phương pháp trung hòa [6], [16], [17]: Chiết alcaloid ở dạng base, dung dịch
phải trong, không lẫn các chất kiềm, amin, chất béo, chất màu vì sẽ gây sai số
thừa. Phương pháp này được DĐVN III công bố trong chuyên luân dược liệu Bình
vôi chỉ tiêu định lượng “Cân chính xác khoảng 10 g bột dược liệu. Thấm ẩm bằng
amoinac 6N trong 2 giờ. Sau cho vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến
hết alcaloid cất thu hồi cloroform, hòa tan cắn trong acid clohydric 5%, (5-7 lần
mỗi lần 5ml). Rửa dịch chiết bằng ether dầu hỏa 3 lần, mỗi lần 10ml, kiềm hóa
bằng amoniac 6N đến pH 10-11. Chiết bằng cloroform 5 lần, mỗi lần 10 ml để lấy
hết alcaloid. Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính. Bốc hơi
dịch chiết tới khô. Hòa tan cắn với 1 lượng chính xác 20,0 ml dung dịch acid
sulfuric 0,1 N. Định lượng acid dư bằng dung dịch kali hydroxyd 0,1N với chỉ thị
8

đỏ methyl. Hàm lượng alcaloid toàn phần được tính theo rotundin, 1ml dung dịch

Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã công bố hàm lượng alcaloid toàn phần từ 3
loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần
(nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)
Stt
Tên loài
Nơi thu hái
HL alcaloid toàn phần (%)
1
S. glabra (Roxb.) Miers
Ninh Bình
2,96
2
S. kuinanensis H.S.Lo
Lạng Sơn
4,41
3
Stephania sp3.
Quảng Ninh
2,32

Năm 2002, Lã Đình Mỡi [21], đã khảo sát hàm lượng alcaloid toàn phần trong 5
loài Bình vôi bằng phương pháp trung hòa (Bảng 1.2)
9

Bảng 1.2. Kết quả định lượng alcaloid toàn phần
(nghiên cứu của Lã Đình Mỡi)

, dựa vào mật độ quang, dựa vào diện tích vết sắc
ký qua phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao [23], sắc ký lỏng hiệu năng cao
[8].
- Phương pháp chuẩn độ thể tích bằng AgNO
3
[8] Chuyên luận nguyên liệu rotundin
DĐVN IV (phương pháp này chỉ áp dụng được cho mẫu tinh khiết )
- Phương pháp đo mật độ quang gồm các bước: Xử lý mẫu. Tiến hành sắc ký lớp
mỏng hệ Cloroform – Methanol (9:1) đối với mẫu thử, chuẩn rotundin. Xác định vết
có hệ số R
f
tương ứng với rotundin chuẩn ở bước sóng 366nm, cạo vết và phản hấp
phụ bằng Ethanol. Xác định mật độ quang của mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng tại
bước sóng 289 nm.Tính % rotundin có trong dược liệu.
- Phương pháp định lượng rotundin trong viên Sen vông- R bằng phương pháp đo
diện tích vết HPTCL[23]. Tóm tắt các bước như sau:
Xử lý mẫu.Tiến hành sắc lớp mỏng với hệ dung môi Chloroform: Aceton:
Diethylamin (10:10:2) song song với chuẩn rotundin ở nồng độ phù hợp. Phun thuốc
thử hiện màu Dragendoff lên bản mỏng. Bản mỏng sau khi hiện màu được đưa lên
máy quét ảnh để thu được hình ảnh các vết, đo diện tích (độ rộng và độ đậm) vết
bằng phần mềm photoshop. Lập tương quan giữa diện tích vết và logarit nồng độ
mẫu bằng phần mềm excel. Nồng độ mẫu thử được tính theo công thức:

10 (Với C
x
, C
o

21
H
25
NO
4
) của dung dịch chuẩn, tính hàm lượng rotundin(C
21
H
25
NO
4
)
trong dược liệu.
11

1.3.4. Hàm lượng rotundin trong một số loài Bình vôi
Năm 2000, Nguyễn Tiến Vững [30] đã xác định hàm lượng rotundin trong 3 loài
Bình vôi nghiên cứu bằng phương pháp đo quang.
Bảng 1.3. Kết quả định lượng rotundin (nghiên cứu của Nguyễn Tiến Vững)
Stt
Tên loài
Nơi thu hái
Hàm lượng rotundin (%)
1
S. glabra (Roxb.) Miers
Ninh Bình
0,59
2
S. kuinanensis H.S.Lo
Lạng Sơn

Tam Điệp, Ninh Bình
1,4
46,4
4
S. kwangsiensis
H.S.Lo
Cẩm Phả, Quảng Ninh
1,8
50,5
5
S. hainanensis H.S.Lo
Hà Nam - Ninh Bình
0,6
18,3

1.4. SINH LÝ NẨY MẦM CỦA HẠT VÀ ƯU NHƯỢC ĐIỂM VÀ MỘT SỐ
YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI NHÂN GIỐNG HỮU TÍNH
1.4.1. Sinh lý nẩy mầm của hạt [21]
1.4.1.1. Sự hút nước: Hút nước là quá trình ñầu tiên của sự nảy mầm, quá trình
này phụ thuộc vào 3 yếu tố: Thành phần các chất có trong hạt, khả năng thấm của
vỏ hạt, lượng nước hữu hiệu và hoạt động của enzyme ngay sau khi hút nước đã
tạo ra thay đổi và quá trình trao đổi chất xảy ra.
12

1.4.1.2. Phá vỡ các mô dự trữ: bằng các phản ứng hoá học phá vỡ các mô dự trữ
và tổng hợp vật chất mới được chứng minh bằng các pha hoạt động của enzim bao
gồm tổng hợp các enzim phân giải chất dự trữ như α -amylase, ribonuleases, endo
- β gluconase và photphatase.
1.4.1.3. Khởi đầu sinh trưởng của phôi: Trong thời gian đầu của sự nảy mầm có
đặc điểm là giảm khối lượng chất khô của nội nhũ và đồng thời tăng trọng lượng

khi gieo xong.
1.4.2. Ưu nhược điểm của quá trình nhân giống hữu tính [2], [3], [4], [5], [22],
[25, [26];
Ưu điểm:
- Kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện.
- Cây có bộ rễ phát triển mạnh, tuổi thọ thường cao hơn các phương pháp nhân
giống khác.
- Cây nhân giống từ hạt sinh trưởng khỏe, tính chống chịu với ngoại cảnh cao
- Hệ số nhân giống cao.
- Chí phí sản xuất thấp hơn so với các phương pháp khác.
Nhược điểm:
Nhiều biến dị, ví dụ như cây mẹ tốt nhưng cây con có thể xấu. Những cây con
nhân giống từ một cây mẹ nhưng lại rất khác nhau, sản lượng và chất lượng không
giống nhau.
Một số lưu ý trong quá trình nhân giống cây con từ hạt
- Kiểm tra sức nảy mầm của hạt trước khi gieo: Phương pháp thực hiện là tùy
từng loại hạt giống khác nhau mà chúng ta có thể lấy từ vài chục hạt đến hàng
trăm hạt từ các vị trí khác nhau đại diện cho lô hạt để gieo thử. Nếu tỉ lệ nảy mầm
dưới 50% thì cần có các biện pháp xử lý để nâng cao tỷ lệ nảy mầm của lô hạt. Do
biết tỉ lệ nảy mầm có thể điều chỉnh lượng hạt cần gieo
1.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng tới quá trình nhân giống hữu tính
1.4.3.1. Ảnh hưởng của chất lượng hạt giống
Hạt giống phải có chất lượng tốt thì tỉ lệ nảy mẩm sẽ cao (điều kiện cần).
14

1.4.3.2. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý hạt [3], [4], [5], [6], [33]
Trong thực tế thường sử dụng 3 phương pháp xử lý sau:
- Phương pháp vật lý:
Phương pháp này thường được áp dụng phổ biến. Nhiệt độ cao làm cho hạt nứt nẻ
hoặc mềm ra, nước và không khí dễ thấm qua vỏ hạt, quá trình sinh lý dược xúc