BỘ YTÌ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÂ NỘI
ĐỖ ĐỈNH HẢI
XẤC BỊNH HÀM LIIDNe TẠP ACID SUCCINIC
KHI ĐỊNH Linme ARTESUNAT NBUYÊN LIỆU
BẰNG PHưUNG PHẮP HPLC
(KHỐA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHOĂ 2001- 2006)
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Trần Đức Hậu
Th.s Trần Thị Lan Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược
■ ■
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 2 - 5/2006.
/V
HẰ NỘI - T5/2006
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành
nhất tới những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn
thành khoá luận này:
PGS.TS.Trần Đức Hậu, Chủ nhiệm bộ môn Hoá dược.
Th.S.Trần Thị Lan Hương, Giảng viên bộ môn Hoá dược.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô, cán bộ của bộ
môn Hoá dược đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành khoá luận này.
Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, các cán bộ bộ môn Hoá
phân tích, Hoá vô cơ.
Cuối cùng xin cảm otti gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên,
khích lệ tôi trong thời gian qua.
Hà nội, tháng 5 năm 2006
Sinh viên : Đỗ Đình Hải
DHA
Dihydro artemisinin
Ds
Dược sỹ
HPLC High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
LOD Limit of detection
: Giới hạn phát hiện
LOQ Limit of quantification : Giới hạn định lượng
NXB
: Nhà xuất bản
PA
: Tinh khiết phân tích
ĐẶT VẤN ĐỂ
Sốt rét là một bệnh nguy hiểm mang tính xã hội. Điều đáng lo ngại là việc
điều trị sốt rét ngày càng trở nên khó khăn do ký sinh trùng sốt rét đã và đang
kháng với các loại thuốc điều trị sốt rét kinh điển như: Cloroquin, Mefloquin,
Primaquin [13].
Vào năm 1972, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được
artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng. Artemisinin có hiệu lực điều trị sốt rét
nhanh, mạnh trên các bệnh nhân bị sốt rét do nhiễm chủng p. falciparum
kháng thuốc và sốt rét thể não [7]. Tuy nhiên, artemisinin có hạn chế là: khả
năng hoà tan kém, tỷ lệ tái phát sau khi dùng còn cao. Để khắc phục những
hạn chế này người ta đã bán tổng hợp ra artesunat với ưu điểm có hoạt lực
điều trị mạnh hơn, lại dễ tan hơn artemisinin. Hiện nay aitesunat được sử dụng
rộng rãi và là một trong những niềm hy vọng lớn của con người trong cuộc
chiến chống lại sốt rét.
Cùng với sự gia tăng nhu cầu sử dụng artesunat, việc kiểm tra chất lượng
aitesunat trong nguyên liệu và thành phẩm là rất cần thiết.
aceton [2].
Điểm chảy: 142®c đến 145°c.
Góc quay cực riêng: = +2,5° đến +3,5° (dung dịch artesunat trong
dicloromethan).
Hỗn dịch 1% trong nước có pH từ 3,5 đến 4,5 [21].
1.1.2. Nguồn gốc, cách điều chế
+ Nguồn gốci Artemisinin phân lập từ cây Thanh hao hoa vàng có tác
dụng tốt trong điều trị sốt rét kể cả chủng đã kháng Cloroquin. Tuy vậy,
artemisinin khó tan và điều trị bằng artemisinin tái phát sớm mặc dù bệnh
nhân sạch ký sinh trùng trong máu.
Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bán tổng hợp ra các dẫn chất
của artemisinin, trong đó đáng chú ý là artesunat có tác dụng tốt, tan trong
dung dịch kiềm dùng để pha thuốc tiêm, điều trị bằng artesunat ít bị tái phát
và vì vậy được dùng phổ biến hơn cả.
+ Điều chế: Trên cơ sở phương pháp của các nhà khoa học Trung Quốc,
D. L. Klayman, p. Brossi và cộng sự, Đỗ Hữu Nghị và cộng sự tại trường Đại
học Dược Hà Nội đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp tổng hợp artesunat
qua hai giai đoạn với hiệu suất cao [12]:
Giai đoạn 1:
- Bán tổng hợp dihydroartemisinin (DHA): Khử hoá artemisinin thành
DHA bằng các chất khử khác nhau, thường dùng là natri borohydrid (NaBH4)
trong môi trường methanol, ở nhiệt độ thấp (0°c - 5°C).
NaBH.
MeOH
0-5®C
Artemisinin
Giai đoạn 2:
- Ester hoá DHA bằng acid succinic hoặc anhydrid succinic hoặc succinyl
clorid với sự có mặt của chất xúc tác (dimethylamino pyridin - DMAP, hay
hỗn hợp DMAP và dicyclohecxyl carbodiimid - DCC) được aitesunat.
- Tính chất: Bột kết tinh trắng.
Độ tan: 1 g acid succinic hoà tan được trong 13 ml nước lạnh; 1
ml nước sôi; 18,5 ml cồn; 6,3 ml methanol; 36 ml aceton; 20ml glycerol; 113
ml ether. Không tan trong benzen, carbon disulffit, dầu ether.
Điểm chảy; 185 - 187°c.
Có: pKai = 4,16; pKa2 = 5,61.
Dung dịch acid succinic 0,1 M CÓ pH = 2,7 [18].
1.2.2. Nguyên nhân gây ra tạp acid succinic trong artesunat
Acid succinic là một trong hai thành phần dùng tổng hợp nên artesunat,
mặt khác artesunat là ester của acid succinic và DHA nên nguyên nhân chính
gây ra tạp acid succinic trong artesunat nguyên liệu là:
- Tinh chế chưa tốt trong quá trình sản xuất.
- Do sự phân huỷ của artesunat trong quá trình bảo quản.
1.2.3. Một sô phương pháp xác định tạp chất liên quan trong thuốc
a. Làm phản ứng bán định lượng (hay áp dụng đối với tạp vô cơ):
Trong phương pháp này người ta thường dùng phản ứng tạo mầu hay tạo
tủa (đục) với tạp chất rồi so sánh mầu (hay độ đục) của dung dịch thử với mầu
(hay độ đục) của dung dịch mẫu - dung dịch này chứa một lượng tạp chất đó ở
giới hạn cho phép.
Tiến hành: chọn 2 ống nghiệm không mầu, cùng đường kính. Cho vào ống
thứ nhất dung dịch thử - dung dịch này pha theo sự hướng dẫn trong từng
chuyên luận của dược điển và ống thứ hai 10 ml dung dịch mẫu. Cho vào mỗi
ống mọi thuốc thử, trừ thuốc thử chính tạo tủa (hay mầu) với tạp chất. Cuối
cùng cho thuốc thử chính vào cả 2 ống. So sánh mầu (hay độ đục) của 2 ống.
Mầu (hay độ đục) của ống thử không được đậm hơn mầu (hay độ đục) của
ống mẫu [1], [3].
Phương pháp này đơn giản, song chỉ cho kết quả bán định lượng.
b. Đo quang:
Nguyên tắc là làm phản ứng mầu đặc trưng của tạp rồi đo độ hấp thụ của
dung dịch mẫu so với độ hấp thụ của dung dịch có chứa tạp đó ở mức tiêu
%Tạp
=
.100%
ỵs,.F,
/=1
- So sánh với chuẩn tạp (khi cần xác định giới hạn cho phép của tạp):
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn tạp có hàm lượng
bằng giới hạn quy định và ghi đáp ứng các pic. Diện tích pic tạp của dung dịch
thử tương ứng pic chuẩn tạp không được lớn hơn diện tích của pic chuẩn tạp.
- So sánh với chuẩn thử:
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn, dung dịch này được
pha từ dung dịch thử, có nồng độ so với dung dịch thử bằng giới hạn cho phép
của tạp. Diện tích của bất kỳ pic tạp nào trên sắc ký đồ của dung dịch thử
không được lớn hofn diện tích pic chính của dung dịch chuẩn [1], [2], [15\
Nhận xét: Các phương pháp trên khi không có hệ số đáp ứng đã coi hệ số
đáp ứng bằng 1, trường hợp này rất khó xảy ra.
Các phương pháp này chỉ dùng để xác định giới hạn cho phép của tạp.
1.3. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc
Phưoỉng pháp HPLC là một phương pháp phân tích hoá lý, dùng để tách và
định lượng các thành phần trong hỗn hçfp dựa trên ái lực khác nhau giữa các
chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hoà lẫn vào nhau: pha tĩnh (trong
cột hiệu năng cao) và pha động (dung môi rửa giải). Khi dung dịch của hỗn
8
hợp các chất cần phân tích được đưa vào cột, chúng sẽ được hấp phụ hoặc
phân bố vào pha tĩnh tuỳ thuộc bản chất của cột và của chất cần phân tích. Khi
ta bơm dung môi pha động qua bcfm với áp suất cao thì tuỳ thuộc vào ái lực
của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn
đến sự phân tách.
Các chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi bộ phận phát hiện gọi là
Là bộ phận phát hiện chất phân tích. Tuỳ theo bản chất của các chất cần
phân tích mà sử dụng detector thích hợp. Detector hay được sử dụng nhất là
detector hấp thụ u v - VIS.
g. Hệ điều khiển: Computer.
/. Bộ phận ghi tín hiệu: gồm có Recorder [1], [11].
1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh
hưởng
• Thời gian lưu (Íịị): tjỊ là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm
mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
• Thể tích lưu (Vịị): Vr là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển
chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ.
= Ír X Fc
(Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian).
tjỊ và Vr là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan, vì vậy các đại
lượng này phụ thuộc vào: Tính chất pha tĩnh, bản chất pha động, tốc độ dòng,
tính chất chất tan, nhiệt độ
• Thời gian chết (Íq): to là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi
pha tĩnh.
10
• Thời gian lưu thực ( t \ ): t \ = tR - íq.
• Hệ sô'phân bố K:
K = k.Cs/C,
Cs và là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số
phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất
tan do pha động vận chuyển khi nó qua cột.
K phụ thuộc vào: bản chất chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh,
nhiệt độ.
• Thừa số dung lượng K \’
Là một đại lượng dùng để mô tả tốc độ di chuyển của một chất.
k ' = =z ~ ^0 = Ỉ A . _ Ị
hay
N =
5,54
0,5
[15].
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính bằng công thức: H =:
N
Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị chiều
dài cột:
N =16
• Hệ số bất đối AF:
Lw„
ĨV
AF =
l a
Trong đó: Wji
2 0
là chiều rộng của pic được đo ở 1/20 chiều cao của pic
a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.
12
AF càng gần 1 thì peak càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả
tính diện tích peak càng chính xác.
Trong phép định lượng yêu cầu: 0,9<AF<2 [2], [15], [19^.
1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
a. Lựa chọn cột (pha tĩnh):
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự
tách của một hỗn hợp nhiều chất. Bản chất chính của sự tách sắc ký hấp phụ là
dựa trên tính chất hấp phụ bề mặt của pha tĩnh. Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ.
chế bằng cách alkyl hoá các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các
gốc alkyl -R của mạch carbon (C2, Cg, Cjg) hay các gốc carbon vòng (phenyl).
Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở
nên ít phân cực. Silica đã alkyl hoá được sử dụng trong sắc ký hấp phụ pha
đảo để phân tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion [6], [17\
b. Lựa chọn pha động cho HPLC:
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là yếu
tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là
nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỉ lệ nhất định.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình sắc
ký như: độ chọn lọc a, thời gian lưu Ir, hiệu lực tách của cột, độ phân giải
Rs, độ rộng của pic sắc ký .Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là
rất quan trọng.
Yêu cầu của một pha động:
• Phải trơ với pha tĩnh.
• Hoà tan được chất cần phân tích.
• Bền vững theo thời gian,
• Có độ tinh khiết cao.
• Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
14
• Phù hợp với detector.
• Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường.
Trong sắc ký pha thuận, pha động thường là các dung môi hữu cơ ít phân
cực (kỵ nước) như: n-hexan, n-heptan, benzen, cloroform, .Các pha động này
thưòfng được bão hoà nước.
Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực
như; nước, methanol, acetonitril hay hỗn hợp của chúng. Các dung môi này
có thể hoà tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ [6], [17].
Có 4 yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưcfng tới kết quả tách của một
hỗn hợp mẫu:
cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết nồng độ.
• Phương pháp chuẩn nội (intemal Standard method): Là phương pháp cho
thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp
ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc
ký. Chất chuẩn thứ hai gọi là chuẩn nội.
• Phương pháp chuẩn hoá diện tích pic (area normalisation):
Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều
thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng
diện tích của tất cả các pic thành phần.
Yêu cầu: Tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện.
Tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector.
Khi đó hàm lượng chất thử được tính như sau:
^,.100 _ ^,.100
+^y +5'r +•••
/=1
16
Tuy vậy trong sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp
ứng pic như nhau là rất khó. Khắc phục nhược điểm này, trong sắc ký lỏng
người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp
ứng ta chọn 1 thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các thành phần
khác có hệ số đáp ứng tính theo công thức sau: F = ^ .
s X - C c
Sg và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chuẩn gốc và thành phần
cần tính hệ số đáp ứng.
Q và Q là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ
số đáp ứng.
Fc là hệ số hiệu chỉnh của chuẩn, khi đó hàm lượng của thành phần X tính
theo công thức:
‘^.•^.•100 5 F 10 0
X X
tuyến tính từ các kết quả trên dạng y = ax + b (y là đáp ứng pic, X là nồng độ
dung dịch).
ở nồng độ thấp nhất tiến hành sắc ký 5 lần, ghi kết quả và tính độ lệch
chuẩn của các kết quả (S), giới hạn tín hiệu phát hiện sẽ là: y = 3S + b. Từ
phương trình hồi quy và phương trình tính giới hạn tín hiệu phát hiện tính ra
nồng độ giới hạn phát hiện là: = 3S/a và nồng độ giới hạn định lượng:
x,^= lOxiod/3 [16].
- Cách 3: Tiến hành sắc ký, ghi sắc ký đồ. Xác định độ nhiễu đường nền ở
vùng thời gian luìi của chất nghiên cứu từ sắc ký đồ của mẫu trắng. Giới hạn
tín hiệu định lượng bằng 10 lần độ nhiễu đường nền. Từ đó suy ra giới hạn
định lượng bằng cách so sánh giới hạn tín hiệu định lượng với đáp ứng của
dung dịch có nồng độ rất thấp [20].
18
PHẨN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, HOÁ CHÂT, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
- Artesunat nguyên liệu do trường ĐH Dược Hà Nội sản xuất.
- Acid succinic chuẩn do Trung Quốc sản xuất.
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
a. Thiết bị, dụng cụ:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Dionex với detector mảng diod PDA-
100.
- Máy pH meter 3305-Jenway.
- Máy lắc siêu âm SONOREX.
- Máy lọc chân không Satorius, màng lọc 0,45 ¡dX.
- Bơm tiêm, lọ đựng mẫu.
- Cân phân tích điện tử hiện số Mettler AB204; độ chính xác 0,1 mg.
- Các dụng cụ thuỷ tinh cần thiết dùng cho phân tích: bình định mức các
loại, ống đong, pipet các loại
= —2 .
n 7ti
s =
11
/ = 1
\ 2
n - 1
- Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): s . = 4- X 100
X
- Sai số chuẩn:
- Sai số tương đối:
-sjn
S-
ta(n-X)
X 100
20
Copyright: Tài liệu đại học ©