BỘ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
«A# *£# •£# «1#
#J% #J% #J% #1% #Ị% #J% rj% rj% rj% #J% #J%
VC THỊ THÃNG LONG
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN
NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
(KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2 0 0 2 - 2007)
Người hướng dẫn:
PGS. TS. Trần Đức Hậu
Th.s. Trần Thị Lan Hương
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: Tháng 8/2006 - 3/2007
HÀ NỘI - 2007
*■
£ Ờ Z @ c  M Ơ Q l
OW/Vfe
h ỉí, ehfr tòi hày, tẢ Imtíị tuêí Ổ4L &ău ếắa txà ehún thành
nhâí tẩi những, MỊẨỈỈti thầy, đã tận tình ehl bả&f hưồềtụ dẫn, ạỉúfL ĩtđ tối
haàễt thành Uhjổ€L luận nàự:
Q&. Q'wut <ĩ)ứ£ /Jôậuf @hủ nhiêm hă MjML 'TCócl dư&n.
<£. &V4WL & h i Ẩ U íi ỉ l ỉô u j ổ n jg ,f í ị i ủ n q , o i ềể L
t ó I t í ổ n 3 K ếífl
i L ư đ n .
£7í5/
eủềiự, deiềi ạửi Lòi eúm ổn, chảtL thành lởi eổia tlĩầiẬ eàf eáễí hà eiĩa
hà niMi 'SôẩcL dưđ& đă giúp, đẵý động, úỉeti tồi ỉiíìitti thành khjẩ€L luận ễtàự
Obưt itư&a eảnt (Ui &ự ạúfL đẵ eủa eúa thầy, eA, eún eún bẠ ễễtâềi '3ŨOÚ

2.3.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả. 18
PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ. 20
3.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin 20
bằng phương pháp HPLC.
3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký. 20
3.1.2. Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký. 20
3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thống. 24
3.1 .4. Xây dựng phương pháp định lượng. 26
3.1.5. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng 27
phương pháp mói xây dựng.
3.2. Đánh giá phương pháp định lượng. 28
3.2.1. Tính chính xác. 28
3.2.2. Tính tuyến tính. 29
3.2.3. Tính đúng. 30
3.2.4. Tính đặc hiệu. 32
3.3. Bàn luận và kết quả. 34
PHẦN 4: KẾT LUẬN ĐỂ x u ấ t 36
4.1. Kết luận. 36
4.2. Đề xuất. 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTCPDP
DĐVN III
HPLC
KTCL
NXB
PA
PTL
TW
VKN

ĐẶT VÂN ĐỂ
•
Lịch sử ngành kháng sinh được hình thành từ khi Alexander Fleming
tình cờ tìm ra Penicillin vào năm 1929. Qua một quá trình phát triển lâu dài
cùng với những thành tựu lớn lao trong cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật,
kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của y
học hiện đại. Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có
tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr(-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr(+) hiếu khí,
hiện đang được sử dụng rộng rãi và có mặt trên thị trường dược phẩm với
những dạng bào chế khác nhau: thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm Việc xác định
hàm lượng của Tobramycin trong các chế phẩm là rất cần thiết.
Cũng như những kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid,
Tobramycin không hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương
pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này
mất nhiều thời gian và độ chính xác không cao. Dược điển Anh áp dụng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ampe kế, thêm môi
trường kiềm sau cột còn dược điển Mỹ cũng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao nhưng tạo dẫn xuất trước cột. Nhìn chung cả hai phương pháp
này đều rất phức tạp, dùng trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền. Xuất phát từ
yêu cầu thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu và xây
dựng một quy trình định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC đơn
giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn. Trong khóa luận này, chúng tôi đã
tiến hành đề tài: " Nghiên cứu định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng
phương pháp HPLC M với mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Tobramycin nguyên liệu
bằng phương pháp HPLC.
2. Đánh giá phương pháp mới xây dựng với các chỉ tiêu của một
phương pháp định lượng.
1
PHẦN 1: TỔNG QUAN

protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận.
Điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối vói phần lớn
các chủng Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn cả Gentamycin.
Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn
nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch vói các tiểu phân 30S của
ribosom. [2], [9]
1.1.6 Chỉ định
Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tói tính mạng
đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn
huyết do vi khuẩn Gr(-).
Trong điều tri các bệnh nhiễm khuẩn nặng, Tobramycin được phối hợp
vói một kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng
toàn thân do Pseudomonas spp. gây ra, Tobramycin có thể dùng phối hợp vói
một kháng sinh nhóm beta-lactam chống Pseudomonas.
3
Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha -
Streptococcus gây ra có thể dùng Tobramycin phối hợp vói ampicilin hoặc
benzilpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2 ]
1.1.7 Chống chỉ định
Với người có tiền sử dị ứng vói các kháng sinh loại aminoglycosid,
người nghe kém và người có bệnh thận. [2 ]
1.1.8 Dạng bào chế và liều lượng
Tobramycin sulphat: dung dịch tiêm 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml
(trẻ em) IM, IV. Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ.
Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %.
Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm
P. aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [9]
1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN
1.2.1 Định lưọng Tobramycin bằng phương pháp vi sinh
1.2.1.1 Phương pháp 1 [13]

Glucose :l,0g
Cao thịt :l,5g
Thạch :15,0g
Nước cất : 100 ml
pH sau khi tiệt trùng :8,2 ± 0,2
- Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử
Cân chính xác khoảng 25,0 mg Tobramycin hòa tan trong dung dịch
đệm phosphat pH 8,0 để có nồng độ Tobramycin chính xác khoảng 10 IU/ml;
20IU/ml và 40 IU/ml.
- Tiến hành thử và tính toán kết quả theo phương pháp hoạt lực kháng
sinh-DĐVNIII.
1.2.2 Định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC
1.2.2.1 Phương pháp 1 [11]
- Cột styren - divinylbenzen copolymer (4,6 X 250 mm, 8|nm).
- Nhiệt độ cột: 55 °c.
- Pha động: Hỗn hợp pha trong nước đã loại C02 chứa: 52 g/ 1 natri
sulfat khan; 1,5 g/1 natri octansulfonat; 3 ml tetrahydrofuran và 50 ml/1 dung
dịch kali dihydrophosphat 0,2 M đã được chỉnh pH về 3,0 bằng acid H3 PO4 .
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút.
5
- Dung dịch tạo dẫn xuất sau cột: dungdịch-ữatrihyđroxyd 2% pha
trong nước đã loại C02. Tốc độ 0,3 ml/phút.
- Detector: Detector ampe kế hoặc các thiết bị tương tự.
- Thể tích tiêm 20 ỊLil.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: 0,1 mg/ml.
1.22.2 Phương pháp 2 [16], [18]
- Cột RP 18 (3,9 mm X 30 cm).
- Pha động: Hòa tan 2,0 g tris(hydroxymethyl)aminomethan trong
khoảng 800 ml nước, thêm vào dung dịch này 2 0 ml dung dịch acid sulfuric
IN, sau đó pha loãng bằng acetonitril tói 2000 ml, lắc đều.

Pha động A (%)
Pha động B (%)
0
1 0 0
0
1 0 0
1 0 0
- Tốc độ dòng 0,2 ml/phút.
- Detector: khối phổ.
- Thể tích tiêm: A\ủ.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,35 mg/ml trong dung dịch
NaCl 0,9 %.
1.2.2.5 Phương pháp 5 [13]
- Cột Ultrasphera RP 8 (4,6 X 250 mm, 5|j.m).
- Pha động: acetonitril - đệm phosphat 0,05 M pH 3,5 = 62:38 (đệm pH
0,05 M: hòa tan 6 , 8 g kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước), điềuchỉnh về
pH 3,5 bằng acid phosphoric.
- Tốc độ dòng: 2,5 ml/phút.
- Thuốc thử tạo dẫn chất: acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfomic.
- Detector u v : 340 nm.
7
- Thể tích tiêm: 20 ỊJÌ.
- Nồng độ dung dịch chuẩn và thử: khoảng 0,02 mg/ml trong đệm
phosphat pH 7,4.
- Dung dịch chuẩn và thử được tạo dẫn xuất với thuốc thử acid
2,4,6-trinitrobenzen sulfomic ở 70 °c.
* Nhân xét: Qua các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận
thấy:
- Định lượng bằng phương pháp vi sinh: Mất nhiều thòi gian và có độ
chính xác không cao

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao
gồm 6 bộ phận chính sau:
1.3.3.1 Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột tách. Bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(0 - 400 bar)
1.33.2 Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi
Bình chứa dung môi thường bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ. Dung
môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường màng lọc cỡ lỗ 0,45 |j.m ) và
đuổi khí hòa tan.
13.3.3 Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tích vào cột.
Có nhiều phương pháp tiêm mẫu khác nhau, đơn giản nhất là sử dụng
một van tiêm. Trong các hệ thống sắc ký hiện đại là hệ tiêm mẫu tự động.
Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi lọc loại tạp
qua màng lọc 0,45 n,m, còn mẫu rắn cần hòa tan trong 1 dung môi
thích hợp.
133.4 Cột sắc kỷ lỏng HPLC
Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ vói hóa chất, chịu được với áp
suất cao đến vài trăm bar.
9
- Chiều dài cột: 10, 15, hoặc 25 cm; thích hợp vói các tiểu phân pha tĩnh có
đường kính rất nhỏ (3, 5, 10 Ịim).
- Đường kính cột: 4 hoặc 4,6 mm.
Nói chung, cột HPLC có tuổi thọ khá dài nếu ta sử dụng đúng cách.
Nếu sử dụng không đúng cách tuổi thọ của cột sẽ giảm. Ví dụ dung môi có
tính chất acid mạnh hoặc base mạnh hoặc tiêm liên tiếp các mẫu sinh học hay
nguyên liệu bẩn thì tuổi thọ của cột sẽ bị giảm.
1.3.3.5 Detector trong HPLC
Là bộ phận phát hiện chất phân tích, tùy theo bản chất của chất cần

khoảng 2 - 5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau nếu chúng có giá
11
trị khác nhau. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện
phân tích sao cho: 1 < k' < 8
1.3.4.2 Độ chọn lọc a (selectivity - factor)
k '2 _ Ír2 to
k ’l tui-to
(k2 > k,') [7], [10]
a khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng, tối ưu từ 1,5 đến 2.
1.3.4.3 Độ phân giải (resolution)
Đặc trưng cho mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trên một điều kiện sắc
ký. Độ phân giải của 2 pic ở cạnh nhau được tính theo công thức:
R
fa-1ì
k fB ì
Wb+ Wa W,/2B+ W,/2A 4
a J
<l+k'B>
[7], [1 0 ]
Độ phân giải cơ bản đạt được khi R = 1,5
1.3.4.4 Hệ số bất đối AF
Cho biết mức độ cân đối của pic sắc ký, nó được tính theo công thức:
AF =
Wl/20
2a
[7], [1 0 ]
Trong đó:
W1/20: là chiều rộng của pic được đo ở 1 / 2 0 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường
cong phía trước tại vị trí 1 / 2 0 chiều cao của pic.

I
0 c h 3
1 I
— Si — 0 — Si — R
I I
0 c h 3
1
* R là nhóm phân cực (ưa nước): nhóm hydroxyl (-0H) hoặc các
alkylamin (-CH2 NH2), alkylnitril (-CH2 CN). Loại này sử dụng làm pha tĩnh
trong sắc ký pha thuận để phân tích các chất ít hoặc không phân cực.
* R là các nhóm ít phân cực: các nhóm octyl, octadecyl, phenyl được
chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các
gốc alkyl - R của mạch carbon (C2 , Cg, C18) hay các gốc carbon vòng (phenyl).
13
Do các nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở
nên ít phân cực. Silica đã alkyl hóa được sử dụng trong sắc ký pha đảo để phân
tích các chất phân cực, ít phân cực hay sắc ký cặp ion.
1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC [10], [19]
Pha động là dung môi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là
yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp. Pha động có thể là
nước, dung môi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.
Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình
sắc ký như độ chọn lọc a, thời gian lưu tR, hiệu lực tách của cột, độ phân giải
Rs, độ rộng của pic sắc ký Chính vì vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là
rất quan trọng.
Yêu cầu của pha động:
• Phải trơ với pha tĩnh.
• Hòa tan được chất cần phân tích.
• Bền vững theo thời gian.
• Có độ tinh khiết cao.

độ vừa, trung bình và cao.
* Đánh giá chiều cao pic: Khi pic có dạng không đổi thì chiều cao pic
(khoảng cách giữa đường nền và đỉnh pic) là một đại lượng tỷ lệ vói diện tích
pic và nó cũng có thể dùng để đánh giá phổ. Phương pháp chỉ áp dụng khi các
chỉ số k là hằng định.
* Với pic có đường nền bị nhiễu hoặc bị hẹp thì việc xác định chiều cao
pic sẽ dễ dàng và chính xác hơn việc xác định diện tích pic.
1.3.7 ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có ba ứng dụng chính:
1.3.7.1 Định tính và thử độ tinh khiết:
Thòi gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian lưu
của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ.
1.3.7.2 Sắc ký điều chế:
15
Qua qúa trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được hứng
riêng rồi cho bốc hơi dung môi thu lấy chất.
1.3.7.1 Định lượng:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng rất lớn trong định lượng chất trong
hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất.
Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó. Một số phương
pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:
> Phương pháp chuẩn ngoại (external Standard method)
Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và
mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so sánh
diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử vói pic của mẫu chuẩn đã
biết nồng độ.
> Phương ph áp chuẩn nội (internal Standard method)
Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ
hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và mẫu

2.2.2 Hóa chất
- Tobramycin: chất chuẩn - hàm lượng 98,6% do VKN - Bộ y tế sản xuất
- Thuốc thử X tạo dẫn chất.
- Muối kali dihydrophosphat (KH2 P04): PA.
- Acid phosphoric (H3PO4): PA
- Methanol dùng cho HPLC (Merck).
17
- Nước cất tinh khiết 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vồ cơ trường đại học
Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC
- Một vài hóa chất khác.
2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.3.1 Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật
- Tham khảo các phương pháp định lượng Tobramycin đã được công bố.
- Tham khảo các phương pháp định lượng Tobramycin bằng HPLC.
- Dựa vào cấu tạo phân tử, tính chất hóa lý của Tobramycin cũng như điều
kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định
lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC.
- Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương
pháp.
+ Khảo sát điều kiện tạo dẫn chất của Tobramycin với thuốc thử X
+ Khảo sát điều sắc ký: chọn cột, pha động, bước sóng, thể tích tiêm và
tốc độ dòng thích hợp để định lượng.
+ Xây dựng phương pháp định lượng, đánh giá tính thích hợp của hệ
thống và tiến hành định lượng Tobramycin nguyên liệu.
2.3.2 Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt:
- Tính chính xác.
- Tính tuyến tính.
- Tính đúng.
- Tính đặc hiệu.
2.3.3 Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả.