BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
—oỏo—
HÔ THUỲ MINH
¡V<flIIÊN CỨU RỄ CÂY MỨC HOA TKẨN«
(HOLARKUKNA ANTIDYSKÌVTIỈRICA WALL.)
HỌ TRÚC »ÀO (APOCTNACKẠẸỊíP
Ấ^loíop
Tliư-ViEN
'-Ỉ:
\C'
.So a
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Dược
sĩKHOÁ 2002- 2007
Người hướng dẫn: GS. TS. Phạm Thanh Kỳ
ThS. Phí Tùng Lâm
Nơi thực hiện: Bộ môn dược liệu
Trường Đại học Dược Hà Nội
Thời gian thực hiện: 02- 5 / 2007
HÀ NỘI, 5/2007
LÙI c ả m ƠH
Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp
đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường.
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn
GS.TS. Phạm Thanh Kỳ
ThS Phí Tùng Lâm
Những người đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình
thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới:
PGS.TS. Chu Đình Kính - Viện hoá học - Viện khoa học và công nghệ
2.2. Thực nghiệm và kết quả 10
MỤC LỤC
2.2.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hoá học 10
2.2.2. Chiết xuất các chất trong dược liệu 17
2.2.3. Định lượng cắn các phân đoạn 19
2.2.4. Định tính cắn c và cắn D bằng SKLM. 20
2.2.5. Phân lập Aavonoid và alcaloid bằng sắc ký cột 24
2.2.5.1. Phân lập Aavonoid. 24
2.2.5.2. Phân lập alcaloid. 26
2.2.6. Nhận dạng các chất HMjVà RM2 28
2 .2 .6 .1. Nhận dạng chất HM J. 28
2.2.6.2. Nhận dạng chất RM2. 29
2.3. Bàn luận về kết quả. 30
PHẦN 3. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT. 31
TÀI LIỆU THAM KHẢO.
PHU LUC.
Trang
Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ Mức 16
hoa trắng bằng phản ứng hoá học.
Bảng 2.2: Kết quả định tính các cắn A, B, c, D 19
Bảng 2.3: Hàm lượng các chất trong phân đoạn A, B, c, D 20
Bảng 2.4: Kết quả định tính flavonoid trong cắn c bằng SKLM. 21
Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM. 23
Bảng 2.6: Kết quả định tính HMj bằng SKLM. 25
Bảng 2.7: Bảng số liệu cộng hưởng từ hạt nhân của HMj 28
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 : Sơ đồ chiết suất các chất trong vỏ rễ Mức hoa trắng. 18
Hình 2.2: Ảnh sắc ký đồ cắn c khai triển ở hệ dung môi IV. 22
Hình 2.3: Ảnh sắc ký đồ cắn D khai triển ở hệ dung môi I. 23
SKLM:
Sắc ký lớp mỏng
Thuốc thử
UV:
Ultraviolet
1.2.3. Gôm[l], [16], [22]
Chất gôm màu nâu, vị đắng, có tỷ trọng 1,092; chỉ số acid 65,28; chỉ số
ester 106; chỉ số xà phòng 171,42 và chỉ số acetyl 150,52.
1.2.4. Glycosid. [1], [22].
Gần đây, nhóm tác giả ở Pháp đã phân lập được từ vỏ 3 glycosid:
Normitiphyllin, holarosin A và B.
1.2.5. Các chất vô cơ.
Tro từ gỗ mức hoa trắng giàu chất Kali gồm 17,5% chất tan có: K2CO3
(10,82%), KCl (4,2%), K2SO4 (2,48%) và chất tro không tan 80,24%. [1],
[16], [2 2 ].
1.3. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ VÀ CÔNG DỤNG.
1.3.1. Tác dụng dược lý [I],{17], [21],[22].
■ Alcaloid toàn phần của mức hoa trắng có tác dụng sau:
o Thí nghiệm trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng diệt Entamoeba
moskowskii.
o Thí nghiệm trên mèo, thuốc gây hạ huyết áp và ức chế tim, tác
dụng này yếu so với emetin.
o Liều lượng lớn của thuốc trên súc vật thí nghiệm gây co giật
trước khi chết.
■ Cao cồn chiết từ quả mức hoa trắng có tác dụng chống ung thư và ức
chế tế bào Carcinom epidermoid từ họng hầu trên môi trường nuôi
cấy.
■ Cao chiết từ quả có tác dụng hạ đường huyết trên chuột cống trắng.
■ Cao chiết bằng chloroform và methanol từ hạt có tác dụng kháng
khuẩn đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas
bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) đã tráng sẵn.
^ Phân lập bằng sắc ký cột, chất hấp phụ là Silicagel có kích thước hạt 40 -
60 |am (Merck) và kích thước 15-40 ỊLim (Merck)
^ Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ: phổ hồng ngoại
(IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(NMR).
❖ Phản ứng với PeCls 5%:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd. PeClg 5% thấy xuất
hiện màu xanh đen.
❖ Phản ứng với AICI3 3% trong cồn:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd. AICI3 3% trong cồn
thấy xuất hiện màu vàng ánh xanh
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có Aavonoid.
2.2.13. Định tính Saponin
❖ Hiện tượng tạo bọt:
Cho vào ống nghiệm to 0,5g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, đun sôi nhẹ,
lọc nóng. Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước. Lắc mạnh trong
5 phút theo chiều dọc ống nghiệm. Để yên, quan sát thấy cột bọt không bền
sau 15 phút.
❖ Quan sát hiện tượng phá huyết:
Cho Ig bột dược liệu vào 20ml dung dịch NaCl 0,9%, đun cách thuỷ trong
30 phút, lọc nóng lấy dịch lọc để làm thí nghiệm sau:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dung dịch máu 2%
Ống 1: thêm 2ml dịch lọc trên
Ống 2: thêm 2ml dung dịch NaCl 0,9%
Lắc đều cả 2 ống nghiệm. Quan sát thấy cả 2 ống nghiệm đều không có cắn.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Saponin.
2.2.1.4. Định tính Anthranoỉd:
❖ Phản ứng Borntrager;
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích lOOml, thêm 50 ml dd. H2SO4
❖ Phản ứng Legal;
Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd. Natri nitroprussiat 1%
và 2 giọt dd. NaOH 10%. Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Glycosid tim.
12
2.2.L6. Định tính Coumarin
Cho 3g bột dược liệu vào bình nón lOOml, thêm 30ml cồn 90®. Đun
cách thuỷ sôi 5 phút. Lọc nóng, dịch chiết thu được dùng làm phản ứng:
❖ Phản ứng mở, đóng vòng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống Iml dịch chiết:
• Ống 1: Thêm 0,5ml dd. NaOH 10%
• Óng 2: Để nguyên
Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội. Quan sát thấy:
• Ống 1; Trong
• Ống 2: Trong
Thêm vào cả 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml nước cất. Lắc đều, thấy;
• Ổng 1: Trong suốt
• Ống 2; Trong suốt
Phản ứng diazo hoá:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2 ml dd. NaOH 10%. Đun
cách thuỷ sôi 5 phút rồi để nguội. Thêm vài giọt TT. diazo mới pha, không
thấy xuất hiện màu đỏ gạch.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có Coumarin.
2.2,1.7. Định tính Tanỉn
Cho vào ống nghiệm Ig bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi
trực tiếp 5 phút. Lọc qua giấy lọc gấp nếp, Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm,
mỗi ống 1 ml dịch chiết.
❖ Phản ứng vối PcCIị:
• Ống 1: Thêm 2-3 giọt dd PeClg 5% thấy xuất hiện màu xanh
đen.
cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có hợp chất steroid.
14
2.2.1.13. Định tính caroten
Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết ether dầu hoả, bốc hơi cách thuỷ đến
cắn. Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn, không thấy ống nghiệm chuyển sang
màu xanh da trời.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ không có caroten.
2.2.1.14. Định tính polysaccharìd
Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm lOml nước cất, đun cách
thuỷ sôi 5 phút, lọc nóng. Cho vào 2 ống nghiệm:
• Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT. Lugol ( I2/K I)
• Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT. Lugol
Quan sát thấy ống 1 có màu đỏ đậm hơn ống 2.
Kết quả: Dịch chiết vỏ rễ có polysaccharid.
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong vỏ rễ mức hoa trắng được
tóm tắt ở bảng 2.1
Nhân xét: Qua các phản ứng định tính, chúng tôi thấy:
Trong vỏ rễ Mức hoa trắng có chứa: alcaloid, flavonoid, tanin, acid hữu
cơ, đường khử, steroid, polysaccharide. Trong đó: alcaloid và flavonoid là 2
nhóm chất chính. Do đó, hướng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào nhóm
flavonoid và alcaloid trong vỏ rễ cây Mức hoa trắng.
15
Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong vỏ rễ mức hoa
trắng bằng phản ứng hoá học
'1'1 Nhóm chất Phản ứng định tính
Kết quả Kết luận
1
Alcaloid
Pư với TT. Mayer
Không có
Hiện tượng phá huyết
-
5 Anthranoid
Pư Bomtrager
-
Không có
Vi thăng hoa
-
6 Coumarin
Pư mở đóng vòng lacton
-
Không có
Pư với TT. Diazo
-
7 Tanin
Pư với FeClj 5%
+++
Có
Pư với Pb(CH3COO)2 10%
+++
Pư với gelatin
1 %
+++
8 Acid hữu cơ
Pư với bột Na2 C0 3
+
Có
9 Acid amin
Pư với '11'. Ninhydrin 3% - Không có
18
Các cắn của bốn phân đoạn trên được định tính ílavonoid và alkaloid. Kết quả
được trình bày ở bảng 2 .2
Bảng 2.2: Kết quả định tính các cán A, B, c, D
STT Nhóm
chất
Phản ứng định tính
Cắn A CắnB
CắnC Cắn D
1
Flavonoid
Phản ứng Cyanidin
-
-
+++
-
Với NaOH
-
-
+++
-
Với NH3
- -
+++
-
2
Alcaloid
TT Dragendorff
-
+
Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: HjO (4: 1: 2, 5).
Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1).
Hệ VII: Ethylacetat: Qiloroform: Acid formic (5:5: 1).
Bản sắc ký được sấy nhẹ 15 phút cho bay hết hơi dung môi.
❖ Hiện màu: Amoniac đặc. Sau đó quan sát dưới ánh sáng thường và đèn
tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.
Khai triển sắc ký qua 7 hệ dung môi chúng tôi nhận thấy hệ IV tách tốt nhất.
Kết quả SKLM chạy ở hệ dung môi IV được trình bày ở bảng 2.4 và hình 2.2.
Bảng 2.4 Kết quả định tính flavonoid trong cán c bằng SKLM
Vết
R.
Độ đậm
Màu sắc
AS thường Hơi NH3
uv 366nm
VI 0, 55
+ Vàng xám
Vàng xám Nâu
V2
0 ,4 6
++++
Vàng nâu Vàng nâu Đen
V3
0,41
+
Vàng nhạt Vàng nhạt Nâu
V4 0, 34
+++
Vàng nâu
Vàng nâu Đen
22
Bảng 2.5: Kết quả định tính alcaloid trong cắn D bằng SKLM triển khai
vớỉ hệ dung môi I:
Vết
Màu khi phun ri'
Dragendorff
Rf
Độ đậm
VI
Vàng cam
0, 73
++++
V2 Vàng cam
0 , 68 ++
V3 Vàng cam
0, 63
++++
V4 Vàng cam
0, 58
++
V5 Vàng cam
0,42
+++
V6
Vàng cam
0, 37
+++
Nhận xét: Dịch chiết cắn D của vỏ rễ cây Mức hoa trắng 6 vết alcaloid, trong
đó có vết VI,V3 là lớn nhất, sau đó đến V5, V6 .
Hình 2.3: Sắc ký đồ cắn D khai triển ở hệ dung môi I
Hệ I: Chloroform: aceton: acid acetic (80: 20: 5).
Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Acid formic : HjO (5: 6 : 1, 5 :1).
Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: H2O (4: 1: 2, 5).
Lấy các tấm sắc ký ra, sấy nhẹ cho bay hết hoi dung môi, quan sát dưới
ánh sáng thường. Kết quả cho thấy HMi chỉ xuất hiện một vết màu vàng nâu.
Do đó có thể kết luận HMi tương đối tinh khiết. Kết quả triển khai SKLM ở 3
hệ dung môi khác nhau được trình bày ở bảng 2.6 và hình 2.4
Bảng 2.6 : Kết quả định tính HMj bằng SKLM
Chất thử
Hệ dung môi
Rf
HMi
H ệl
0 ,11
Hệ IV
0,45
Hệ V
0, 67
t
Hệ I Hệ IV Hệ V
Hình 2.4: Sắc ký đồ của HMi
khai triển ở 3 hệ dung môi khác nhau
HMi Ftp
Hình 2.5: Sắc ký đồ của
HMi, Ftp trong hệ IV
25
2.2.5.2. Phân lập alcaloỉd
• Chất nhồi cột là Silicagel có cỡ hạt 40 - 60 |am (Merck).
• Qiuẩn bị cột sắc ký:
Cột sắc ký có kích thước 2 cm X 50 cm. Lắp thẳng đứng cột trên giá.
Phân đoạn từ ống 12 đến 58 để bay hơi dung môi thu được chất bột kí hiệu
RMj.
2.2.6. Nhận dạng các chất HM l và RMl
2.2.6.1. Nhận dạng HM l
Để xác định cấu trúc của hợp chất HMj các loại phổ đã được sử dụng là:
+ Phổ tử ngoại (UV) đo trong Methanol có đỉnh hấp thụ cực đại X niax
294nm; 258nm và 227nm.
+ Phổ khối lượng được ghi trên thiết bị 5989 B-HP-MS cho kết quả HM| có
M'^=154amu ứng với công thức cộng C7ĨỈ6O4 tra thư viện phổ thu được kết quả
HM| là 3,4-dihydroxy-benzoic acid với độ trùng hợp là 91%.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho kết quả hoàn toàn phù hợp với kết quả
thư viện phổ cung cấp:
Phổ ^^C-NMR cho phép xác định HM] có 4 cacbon bậc 4 và 3 nhóm
-CH= trong đó cacbon bậc 4 có ỗ=167,276ppm rất đặc trưng cho cacbon
acid.
Phổ 'H-NMR bao gồm 3 pic đều đặc trưng cho proton nhân thơm và có
hằng số tương tác hoàn toàn phù hợp với cấu trúc đã được đưa từ phổ khối.
Kết hợp với phổ mô phỏng, số hiệu phổ NMR của hợp chất HM| được đưa ra
ở bảng 2.7
27
Copyright: Tài liệu đại học ©