BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
ĐÀO DUY HOÀNG BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TIÊU
CHUẨN HÓA DƯỢC LIỆU THƯỜNG
XUÂN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HÀ NỘI - 2014
1. TS. Trần Minh Ngọc
2. ThS. Thân Thị Kiều My
Bộ môn Dược liệu LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô
giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong thời gian năm năm tôi học tập tại trường.
Xin gửi lời cảm ơn đến toàn bộ thầy cô, anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn
dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi về điều
kiện cũng như kỹ thuật để tôi có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm
tại bộ môn.
Với tất cả lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin gửi tới:
ThS.Thân Thị Kiều My, ThS.Phạm Tuấn Anh, Bộ môn Dược liệu, Đại
học Dược Hà Nội và TS.Trần Minh Ngọc, Khoa Bào chế và chế biến Viện
Dược liệu là những thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành khóa luận.
Các thầy cô đã dành nhiều thời gian và tâm huyết tận tình chỉ bảo, quan tâm
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận. Các thầy cô còn là tấm gương về tác phong
làm việc và lối sống đạo đức cho tôi noi theo.
Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận.
Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa
luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các
thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2014
2.1.3. Thiết bị và máy móc sử dụng 15
2.2.
Nội dung nghiên cứu 16
2.2.1. Xác định thành phần hóa học trong lá thường xuân 16
2.2.2. Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm của dược liệu
thường xuân 16
2.3.
Phương pháp nghiên cứu 16
2.3.1. Xác định thành phần hóa học lá thường xuân 16
2.3.2. Khảo sát và xây dựng các chỉ tiêu kiểm nghiệm 16
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18
3.1.
Sơ bộ xác định thành phần hóa học lá thường xuân 18
3.2.
Khảo sát xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm dược liệu Thường
xuân 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký tự viết tắt Tên đầy đủ
SKLM Sắc ký lớp mỏng
TT Thuốc thử
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Nội dung Trang
1.1 Thành phần hóa học lá thường xuân 3
3.1 Định tính Alcaloid 18
3.2 Định tính coumarin 19
3.3 Định tính anthranoid 20
3.4 Định tính glycosid tim 21
3.5 Định tính flavonoid 22
3.6 Định tính tannin 23
3.7 Định tính saponin 24
3.8 Định tính tinh dầu và chất béo 25
3.9 Kết quả định tính chung 26
3.10 Kết quả đo độ ẩm 33
3.11 Kết quả đo tro toàn phần 34
3.12 Lượng chất chiết được bằng ethanol 35
Trong hệ thực vật đó, thường xuân (Hedera helix L., Araliaceae) đã được
các nhà khoa học trên thế giới chứng minh có nhiều tác dụng dược lý trong
điều trị các bệnh về hô hấp, nhiễm khuẩn, bảo vệ gan … và đã được phát triển
thành thuốc điều trị các chứng bệnh viêm đường hô hấp cấp và mạn tính
(Prospan).
Tuy vậy, ở Việt Nam, loài thường xuân (Hedera nepalensis var. sinensis
(Tobler) Rehder, Araliaceae) chủ yếu được dùng làm cây cảnh và chưa có
một nghiên cứu được công bố nào về thành phần hoá học, tác dụng dược lý,
cũng như ứng dụng làm thuốc chữa bệnh. Vì vậy, để góp phần sáng tỏ thành
phần hoá học và sử dụng cây thường xuân ở Việt Nam làm thuốc trong lĩnh
vực dược liệu và y học cổ truyền, tôi thực hiện nghiên cứu: “Bước đầu nghiên
cứu xác định thành phần hóa học và tiêu chuẩn hóa dược liệu thường xuân”
với 2 mục tiêu:
Xác định được các nhóm thành phần hóa học của dược liệu
thường xuân ở Việt Nam.
Tiêu chuẩn hóa dược liệu thường xuân.
2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Hedera
1.1.1. Vị trí phân loại chi Hedera
Theo các tài liệu [4], [6], [7], vị trí của chi Hedera trong hệ thống phân
loại thực vật dược như sau:
Ngành Ngọc lan Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan Magnoliopsida
Phân lớp Hoa Hồng Rosidae
Bộ Hoa tán Apiales
tham
khảo
Saponin
triterpen
Hederacosid C 5
[18]
Hederacosid B <
0,5
[18]
4
α-hederin 1,5-
2,5
[18]
[36]
β-hederin
[18]
Flavonoid
[37]
Astragalin
(kaempferol 3-O-
glucoside) [37]
Kaempferol 3-O-
rutinoside
0,28[37]
6
Coumarin Scopolin
(scopoletin 7-O-
glycoside) [18]
Polyacetylen Falcarinon 0,05[28]
Falcarinol 0,03
[28]
[37]
Neochlorogenic
[28]
7 3,5-O-dicaffeoyl-
quinic
0,5-
1
[28]
[37]
4,5-O-dicaffeoyl-
quinic
0,86
[18]
[28]
Stigmasterol
[18]
[28]
Sitosterol
[18]
[28]
Alkaloid Emetin
[29]
9
Vitamin
Vitamin E [18]
[28]
Vitamin A [18]
[28]
Vitamin C
[18]
[28]
Tinh dầu Germacrene B
Một nghiên cứu ở Đức trong hen phế quản ở trẻ em chứng minh rằng dịch
11
chiết lá thường xuân có tác dụng tốt với bệnh hen phế quản mạn tính ở trẻ
[20].
Nhiều nghiên cứu kết luận rằng dịch chiết lá thường xuân có hiệu quả để
điều trị nhiễm trùng đường hô hấp trên cấp tính. Sau 7 đến 10 ngày điều trị,
các triệu chứng như ho, khạc đờm được cải thiện hoặc chữa khỏi ở phần lớn
bệnh nhân [21], [26].
Trong một nghiên cứu hồi quy, sau 5-8 ngày, các triệu chứng ho cấp tính ở
50-75% trẻ em được cải thiện hoặc biến mất. Sau 1 tuần, khoảng 50% bệnh
nhân đã hết triệu chứng ho và khoảng hơn 90% bệnh nhân chứng ho đã được
cải thiện [15], [19], [21].
Tác dụng kháng viêm.
Cả saponin thô hay saponin đã được tinh chế trong dịch chiết thường xuân
đều có tác dụng kháng viêm cấp tính và mạn tính trên chuột. Indomethacin
được đem ra đối chiếu (89.2% kháng viêm cấp tính) trong khi saponin thô
trong dịch chiết dùng với liều 100-200 mg/kg có tác dụng kháng viêm cấp
tính 77%. Đối với thử nghiệm kháng viêm mạn tính, indomethacin có hiệu lực
66%, dịch chiết saponin đã được tinh chế 60% còn saponin thô là 49% [34].
Dịch chiết thường xuân với ethanol khi tiêm phúc mạc với liều 7,5ml/kg
cho thấy hoạt động kháng viêm bằng 88,89% so với diclofenac (thuốc có tác
dụng ức chế 94,44% phù nề chân do formalin). Phù nề chân do formalin có
nhiều điểm giống với viêm khớp nên dịch chiết ethanol của thường xuân có
thể có tiềm năng chống lại viêm khớp [33].
Tác dụng trên nhu động ruột
Các thí nghiệm trên chuột có kết quả: dùng α-hederin với nồng độ cao 25-
350µM gây ra thay đổi lớn trên hoạt động vận động tự nhiên của cơ trơn dạ
dày chuột. Phản ứng quan sát được là co cơ trơn, cường độ co phụ thuộc vào
nồng độ. Thí nghiệm với hederacosid C cho thấy nếu dùng với nồng độ đến
Hederacoside C cũng đã được báo cáo là có tác dụng kháng virus cúm
A2/Japan-305 ở nồng độ 100µg/ml [14].
Diệt giun sán
Phức hợp saponin (CS60: 60% hederasaponin C với hederasaponin B với
các phenolic), phức hợp saponin đã được tinh chế (CSP90: 90%
hederasaponin C với hederasaponin B mà không có các phenolic) và α-
hederin được đánh giá trong ống nghiệm sử dụng các loài sán lá gan Fatsiola
và Dicrocoelium spp. cũng như trên cơ thể trong cừu bị nhiễm Dicrocoelium.
Với thí nghiệm trên ống nghiệm, sau 24 giờ cả Fatsiola và Dicrocoelium đều
bị giết lần lượt bởi α-hederin ở nồng độ 5 và 1 µg/ml. Khi cừu nhiễm
Dicrocoelium được điều trị với CS60 và CSP90, trứng sán trong phân của cừu
biến mất sau 3 liều (1 liều 500 và 2 liều 800mg/kg), trong khi đó dùng α-
hederin với liều như trên quan sát thấy số lượng trứng sán giảm [25].
Hoat động ức chế trứng và giun trưởng thành (loài Haemonchus contortus)
đã được chứng minh có trong dich chiết nước và cồn của quả chín thường
xuân. ED50 để ức chế nở trứng tương ứng với dịch chiết nước và cồn là 0,12
và 0,17 mg/ml. Dịch chiết cồn trong thí nghiệm in vitro cho thấy khả năng
chống lại giun trưởng thành tốt hơn so với dịch chiết nước [13].
Ở thí nghiệm in vitro α-hederin và hederagenin cho thấy có khả năng ức
chế hoạt động của Trypanosoma brucei đặc biệt là α-hederin (MIC=25µg/ml).
Hederacosid C và D cho thấy không có tác dụng này ở nồng độ cao hơn
100mg/ml [35].
Chống lại leishmania
Trong dịch chiết chứa 60% hỗn hợp saponin (CS60), các bidesmosides
(hederacosid B,C,D), các monodesmoside α-,β-,δ-hederin và hederagenin, chỉ
có các monodesmoside và hederagenin có tác dụng trên Leishmania infantum
và L.troica [30].
14
2.1.1. Nguyên liệu
Dược liệu là lá cây thu hái vào tháng 4/2013 tại Sapa, Lào Cai. Mẫu cây
được xử lý, ép và lưu tại khoa Tài nguyên Dược liệu- Viện Dược liệu. Dựa
vào khóa phân loại, TS. Phạm Thanh Huyền, trưởng khoa tài nguyên dược
liệu đã giám định tên khoa học là Hedera nepalensis var. sinensis (Tobler)
Rehder, Araliaceae.
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích, gồm có:
o Các dung môi: methanol, cồn tuyệt đối, cồn 96
o
, cồn tuyệt đối, toluen,
EtOAc, …
o Hóa chất vô cơ: NaOH, FeCl
3
, HCl, Mg, acid acetic 5%, Javen …
o Thuốc nhuộm vi phẫu: Xanh methylen, đỏ son phèn.
o Cao tiêu chuẩn lá thường xuân (lô A231/018/A13, xuất xứ: Công ty
Naturex Pháp, Công ty nhập khẩu: Medistar Việt Nam)
Dụng cụ thí nghiệm:
o Pipet, ống nghiệm, bình cầu, cốc có mỏ, ống đong, phễu, ….
o Bộ dụng cụ chiết hồi lưu.
2.1.3. Thiết bị và máy móc sử dụng
Cân phân tích Mettler Toledo AB204-S9 (Thụy Sĩ).
Máy đo độ ẩm Sartorius.
Tủ sấy Memmert (Đức).
Kính hiển vi Leica (Đức).
Máy cắt vi phẫu cầm tay.
16
Máy ảnh Canon.
Đặc điểm vi phẫu: mẫu lá thường xuân được cắt vi phẫu bằng máy cắt
cầm tay, tẩy bằng Javen, nhuộm vi phẫu theo phương pháp nhuộm kép, quan
sát dưới kính hiển vi xác định đặc điểm vi phẫu [1], [4], [5].
Kiểm nghiệm bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Định tính dược liệu
thường xuân bằng SKLM theo phụ lục 5.4 trong Dược điển Việt Nam IV [3].
Độ ẩm
Dược liệu thường được quy định một giới hạn độ ẩm nhất định gọi là
độ ẩm an toàn, qua độ ẩm đó thì dược liệu dễ bị mốc, hư hỏng. Việc xây dựng
chỉ tiêu độ ẩm cho dược liệu là xác định giới hạn tối đa cho phép của một
dược liệu để nó có thể giữ được chất lượng trong quá trình bảo quản [2].
Xác định độ ẩm bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô hay
phương pháp sấy theo phụ lục 9.6 Dược điển Việt Nam IV [3].
Tro toàn phần
Tro toàn phần là lượng cắn vô cơ còn lại sau khi nung cháy hoàn toàn
một dược liệu. Cắn vô cơ có cấu tạo chủ yếu là các carbonat và oxyd kim loại
[2].
Tiến hành tro hóa hoàn toàn mẫu thử tại một điều kiện nung nhất định
trong 1g mẫu thử theo phụ lục 9.8 Dược điển Việt Nam IV [3].
Xác định chất chiết được trong dược liệu bằng phương pháp chiết nóng
với ethanol tuyệt đối theo phụ lục 12.10 Dược điển Việt Nam IV [3].
Định lượng saponin trong dược liệu bằng phương pháp cân
Copyright: Tài liệu đại học ©