BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THU HẰNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA NẤM
MEN PHÂN LẬP TỪ
HẠT KEFIR

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THU HẰNG
chân thành nhất tới cô giáo T – Giảng viên bộ môn Công nghiệp
Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và TS. Đàm Thanh Xuân, những người đã
luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên
cứu khoa học.

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy,
cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học
Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình hoàn
thành khóa luận này.

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy
cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập.
Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

18
19
19
2.3.9. Phƣ 20
20
2.3.11. 20
21
22
2.3.14. 22
CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 23
23
ấm men từ hạt kefir Hà Lan. 23
ều kiện hô hấ 25
3.1.3. ồn 29
3.1.4. ệt độ 30
3.2. Khảo sát một số đặ 32
3.2.1. Khả ẩn có hại 32
3.2.2. Khả năng chịu pH acid dạ dày 35
3.2.3. Khả năng cộng sinh với vi khuẩn lactic 36
40


Bacillus
B.
Escherichia
E.

KHV

DĐVN 4

MT1

MT2

MT3
Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ
(The American Type Culture Collection)
ATCC

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang
Bảng 1.1:
Các vi sinh vật có trong hạt kefir
7
Bảng 2.1:
Nguyên liệu, hóa chất

36

kefir
37
Bảng 3.10:
38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang
1.1:
H
4 5

-

24
h 3.2:


ĐẶT VẤN ĐỀ s
(FAO/WHO) năm 2002
sẽ cho sức khỏe củ chủ” [15]. t
trong
Baccillus S.
cerevisiae & S. boulardii

2. Nghiên cứu kefir c
2

CHƢƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Lịch sử dùng các sản phẩm sữa lên men
Sữa là chất bài tiết giàu dinh dƣỡng của động vật có vú. Giá trị dinh dƣỡng tự
nhiên của sữa đã đƣợc khuyến khích sử dụng cho con ngƣời ngay từ buổi đầu của
xã hội loài ngƣời. Điều này có thể bắt đầu từ khi các loài động vật đầu tiên đƣợc
thuần hóa. Các sản phẩm sữa lên men cũng đƣợc đề cập sớm trong tiếng Phạn và
các công trình Kito giáo. Ngày nay, ở vùng Cận Đông và Bắc Phi có rất nhiều thực
phẩm sữa lên men truyền thống, đó là những biến thể của sữa chua và pho mát [22].
Tầm quan trọng của sữa chua và pho mát trong văn hóa ẩm thực Hy Lạp
(1.500 năm trƣớc Công Nguyên) và Rome (750 năm trƣớc Công Nguyên) đã từng

men khác là có sự xuất hiện của một nhóm vi sinh vật trong hạt kefir, có thể thu hồi
đƣợc để lên men tiếp. Các vi sinh vật trong hạt kefir thƣờng tạo ra acid lactic, chất
ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây hỏng và các vi sinh vật gây bệnh [2]. Mặc
dù, trên thế giới hạt kefir đã phổ biến nhƣng ở Việt Nam còn ít đƣợc biết đến.
1.2 Hạt kefir
1.2.1 Nguồn gốc hạt kefir
Cách đây hàng nghìn năm, hạt kefir đƣợc biết đến nhƣ một thứ nấm dùng
chữa bệnh, xuất xứ từ cách nuôi riêng của các tu sĩ Ấn Tạng. Hạt kefir có thể làm
biến đổi sữa nhờ một hệ vi sinh vật phức tạp gồm nhiều loài vi khuẩn và nấm men
đƣợc chứng minh là rất có lợi cho sức khoẻ. Dân miền núi Caucasus thuộc nƣớc Xô
Viết cũ - nguyên quán của Kefir - đã bào chế nó từ sữa của các sinh vật khác nhau
và Kefir đƣợc lên men tự nhiên trong những túi da thú hoặc bồn bằng gỗ sồi. Việc
tiêu thụ thƣờng xuyên Kefir đã giúp họ tránh đƣợc bệnh ung thƣ, lao, dạ dày… và
họ thọ đến trung bình là 110 tuổi. Núi Caucasus là vùng duy nhất trên trái đất mà
con ngƣời giữ đƣợc sức khỏe ở lứa tuổi này.
Đến cuối thế kỉ 19, Kefir trở thành sản phẩm quen thuộc của ngƣời dân các
nƣớc Đông Âu (Nga, Ucraina, Balan, Czech, Hungari ) và các nƣớc vùng
Scandinavia. Đầu thế kỉ 20, Kefir đƣợc sản xuất với quy mô công nghiệp [14], [8].
Hiện nay, kefir đƣợc sản xuất với nhiều tên gọi: Kephir, Kiaphur, Kefer, Kepi hay

4

Kippi… [21].
1.2.2 Đặc điểm hạt kefir
Các hạt kefir có màu từ trắng đến vàng nhạt, hình dạng không ổn định và
thƣờng kết thành chùm với nhau với đƣờng kính trung bình 0,3÷3,5 cm. Hạt kefir
không tan trong nƣớc và hầu hết các dung môi. Khi thả vào sữa, hạt kefir thấm nƣớc
(sữa) và trở nên màu trắng đục [22], [13].
Quan sát hình dạng hạt kefir bằng mắt thƣờng cho thấy các hình dạng khác
nhau của hạt từ dạng tấm mỏng phẳng đến dạng cuốn, cuộn lại hay dạng giống hoa
–
– Polysaccharid
–
: [24].
Hạt kefir chứa một hỗn hợp vi sinh vật cộng sinh phức tạp gồm vi khuẩn lactic
(Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc và Streptococcus spp.), nấm men
(Kluyveromyces, Saccharomyces và Torula) và đôi khi còn tìm thấy cả vi khuẩn
acetic (Acetobacter), trong mạng lƣới của polysaccharid và protein [32].
Mạng lƣới là một phức hợp có 13% protein (tính theo trọng
lƣợng khô), 24% polysaccharide, cộng với mảnh vỡ tế bào và các thành phần chƣa
biết. Các polysaccharide chính là một chất hòa tan trong nƣớc đƣợc biết đến nhƣ
kefiran. Kefiran là một vật liệu gồm các sợi nhỏ vô định hình hợp thành để bao
quanh vi khuẩn, nấm men. Chúng cấu tạo bởi D-glucose liên kết D-galactose với tỉ
lệ cân đối, trong mỗi đơn vị lặp lại có nhánh thế ở vị trí 6-O của D-galactose. Các vi
khuẩn lactic lên men đồng hình (L. kefir, L. kefiranofaciens, Leu. mesenteroides, Lc.
lactis ssp. cremoris) đều có thể sản xuất kefiran; trong đó L. kefiranofaciens đƣợc
xác định là sản xuất polysaccharide chính, nằm sâu bên trong hạt, quyết định đến sự
hình thành của hạt. Quá trình sản xuất này đƣợc kích thích bởi CO, ethanol hoặc các
sản phẩm chuyển hóa chƣa biết của vi khuẩn lactic lên men đồng hình .
Hiện nay, kefiran đang đƣợc rất quan tâm bởi khả năng kháng khuẩn, kháng nấm,
chống ung thƣ [22].

6

Thành phần vi sinh vật của hạt kefir là khoảng 65-80% Lactobacilli, 10-15%
nấm men, 5-25% Lactococci và Leuconostoc spp. Ngƣợc lại, trong kefir, vi sinh vật
mà hạt kefir rụng ra một phần thì tỷ lệ này là khoảng 80% Lactococci và
Leuconostoc spp., 10-15% nấm men và 5-10% Lactobacilli [19].

7

Bảng 1.1: Các vi sinh vật có trong hạt kefir [8], [32], [19].
Vi khuẩn
Lactobacilli
L. acidophilus
o
L. brevis
e
L. casei
e
L. delbrueckii ssp. bulgaricus
o
L. delbrueckii ssp. delbrueckii

L. delbrueckii ssp. lactis
L. fementum
e
L. fructivorans
e

L. hilgardi
e

L. helveticus
o
L. kefiranofaciens ssp.kefiranofaciens
0
L. kefir
e

Leuc. mesenteroides ssp. mesenteroides
e
Acetobacter
Acetobacters aceti
Acetobacters racens
Nấm men
Kluyveromyces
Kl. lactis
l
Kl. marxianus ssp bulgaricus
Kl. marxianus ssp marxianus
Saccharomyces
S. cerevisiae
n
S. delbrueckii
n
S. unisporus
n

S. pastorianus
n

S. turicensis
n
S. exiguus
n

Candida

8

(t) / C. firmetaria (a)
Issatchenkia
I. orientalis
n
(t)/ C. krusei (a)

Yarrowia
Y. lipolytica
n
(t)/ C. lipolytica (a)

Dekkera

Dekkera anomala
l
(t)/ Brettanomyces anomalus
l
(a)
Galactomyces
Galactomyces geotrichum

(t)/ Geotricum candium (a)
Torulaspora
T. delbrueckii
n

Rhodosporidium
R. kratochvilovae
o: lên men đồng hình, e: lên men dị hình, l: lên men đƣợc đƣờng lactose, n: không lên men
đƣợc đƣờng lactose, t: giai đoạn sinh sản hữu tính, a: giai đoạn sinh sản vô tính.

cereus, Klebsiella pneumoniae và Candida albicans… Cơ chế chính để ức chế tác
nhân gây bệnh là do sự hiện diện của các acid hữu cơ trong hạt kefir (acid lactic,
acid axetic…) [19].
Tác dụng chống u và chống ung thƣ:
Kefir có tác dụng ức chế sự tăng trƣởng của tế bào ung thƣ và ngăn chặn một
số loại ung thƣ (đại tràng, vú) và giảm kích thƣớc khối u. Điều này đƣơc chứng
minh trên mô hình động vật, thông qua chế độ ăn bổ sung kefir cho thấy một số
thành công trong việc tăng apoptosis, giảm kích thƣớc khối u, ngăn ngừa quá trình
lipid peroxy và tăng glutathione trên chuột có đại tràng bất thƣờng. Tƣơng tự, chất
chiết xuất từ kefir có thể ngăn chặn sự phát triển của ung thƣ vú. Khả năng chống u
bƣớu của kefir có liên quan đến kefiran (ức chế ung thƣ Ehrlich và Sarcoma180)
đƣợc đề xuất rằng polysaccharide kích thích hệ miễn dịch thông qua hoạt động của

10

tế bào T. Một cơ chế khác đƣợc đề xuất là tăng tế bào giết tự nhiên, hoạt động đại
thực bào [18].
Giúp dung nạp lactose: Một số vi sinh vật trong kefir có khả năng phân giải
lactose thành đƣờng đơn (glucose, galactose) giúp cho những ngƣời không dung
nạp đƣợc lactose có thể sử dụng đƣợc sữa [18].
Giảm cholesterol: Một số nghiên cứu cho thấy giảm cholesterol huyết thanh và
phospolipids trên những con chuột có chế độ ăn uống cholesterol cao bổ sung kefir.
Vì thế, có lợi cho việc ngăn ngừa các sự xuất hiện của nhiều bệnh tim mạch nhƣ đau
tim và đột quỵ [18].
Ngoài ra, kefir có rất nhiều tác dụng khác nhƣ giảm cân, chống oxy hóa, giảm
stress, tăng hoạt động của não, cung cấp các vitamin, tăng cƣờng hoạt động miễn
dịch… [33].
1.3 Nấm men
1.3.1 Đặc điểm nuôi cấy
Nấm men có thể thuộc về hai lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn

, Mg
2+

cũng rất cần cho nuôi cấy nấm men. Thông thƣờng K
+
đƣợc bổ sung cùng các muối
phosphat hoặc sulfat, còn ion Mg
2+
và Ca
2+
thƣờng đủ trong nƣớc sinh hoạt. Các
nguyên tố vi lƣợng: Mn, Cu, Fe, Zn, Bo, Li… chỉ cần một lƣợng rất nhỏ.
- Các chất sinh trƣởng bao gồm các vitamin, bazơ purin và pyrimidin. Trong
công nghiệp, nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men, nƣớc chiết cám, dịch thủy
phân đậu tƣơng bằng enzym và đặc biệt là rỉ đƣờng. Nguồn cao ngô có thể đáp ứng
cả nhu cầu vitamin và acid amin [9].
Hô hấp
Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy tiện.Vì vậy, chúng có hai kiểu hô hấp kị
khí và hiếu khí tùy thuộc vào điều kiện oxy cung cấp cho quá trình trao đổi của
chúng. Trong điều kiện hô hấp kị khí, nấm men tạo ra ít năng lƣợng hơn so với hiếu
khí vì vậy để đảm bảo cung cấp năng lƣợng nấm men tiêu tốn nhiều cơ chất hơn [9].
Nhiệt độ:
Đa số nấm men có nhiệt độ thích hợp là 28÷32
o
C
0
C. Nhiệt độ không chỉ ảnh hƣởng đến cƣờng độ lên men và
sinh trƣởng của nấm men còn ảnh hƣởng tới sinh tổng hợp các sản phẩm. Nhiệt độ
càng cao càng dễ sinh và tích tụ các sản phẩ [9].
pH

rót bia sẽ tạo ra nhiều bọt [9], [4].
Sản xuất sinh khối
Sinh khối nấm men chứa nhiều vitamin B và các acid amin quan trọng. Vì vậy,
thực tế ngƣời ta sử dụng để: làm nở bột m trong công nghiệp
bánh m , làm nguồn protein-vitamin bổ sung cho thức ăn chăn nuôi… Nghiên cứu
làm bánh mỳ sử dụng hạt kefir nhƣ nấm men bánh m cho thấy: bánh mì đƣợc sản
xuất với kefir giữ lại độ ẩm hơn, độ axit thấp (pH 4,9-5,5) và giữ lại độ „tƣơi‟ của
chúng lâu hơn so với bánh mì làm từ nấm men bánh mì thông thƣờng [4], [30].
Ứng dụng nấm men trong lĩnh vực Y-Dƣợc

13

Nấm men dùng trong dƣợc phẩm gồm tế bào nấm men tƣơi hay đông khô.
P.
pastoris S. cerevisiae
.
Men bia giúp tăng hoạt tính của enzym trong ruột như disaccharidase,
saccharidase, maltase và lactase để giúp giảm các triệu chứng tiêu chảy; cũng giúp
tăng hoạt động của insulin rất có ích cho bệnh nhân tiểu đường do chứa nhiều
chromium [9]. Trong một nghiên cứ những người dùng mỗi
ngày 2 muỗng canh men bia trong 8 tuần có thể giúp làm hạ cholesterol trong máu
trung bình được 10% [5].
Một số loài nấm men nhƣ S. cerevisiae, S. boulardii đƣợc bổ sung vào các sản
phẩm probiotic. Đặc biệt là S. boulardii Biocare, Bio-
flora, Florastor, Normargut, Usapha Bio…. So với vi khuẩn việc bổ sung nấm men
có những ƣu điểm sau:
- Có khả năng đề kháng kháng sinh và sulfamid (ngoại trừ kháng sinh kháng
nấm).
- Có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn (men tiêu hóa sống).
- Có khả năng tiết ra protease tiêu giải độc tố của Clostridium difficile, vi

Ở Việt Nam, nghiên cứu về hạt kefir nói chung và nấ
(2006)
cho t 30
0
C [8]. 15 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị
2.1.1. Vi sinh vật sử dụng
ấm men tách từ h –
Chủ B. subtilis – ATCC6633 E. coli – ATCC25922
: S. cerevisiae –
L. acidophilus– ATCC4653
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất sử dụng
Bảng 2.1: Nguyên liệu, hóa chất
Tên nguyên li Glucose
Việt Nam

 Fehling A, Fehling B, K
2
Cr
2
O
7
0,5N, Na
2
S
2
O
3
0,1N & HCl pH
1,2

2
SO
4
25%, Ba(OH)
2
10%
2.1.3. Môi trường

(MT2)
Glucose
: 8,0 g
Glucose
: 5,0 g

: 0,5 g

2
O
: 0,1 g
KH
2
PO
4
: 0,2 g
KH
2
PO
4

: 0,2 g

100ml

: 2,3 g
Môi trường thạch thường (MT3)

100ml
Pepton
: 1,0 g Thạch bột
: 2,3 g Cao thịt

ật
Đức Máy khuấy từ

Bếp cách thủy
Trung Q
Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ trang…
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Phâ
- nấm men từ hạt kefir Hà Lan.

17

-
2.2.2. Nghiên cứu một số đặc tính probioti
-
B. subtilis & E. coli.
- acid .
- lactic.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
ấy giống đƣợc tiến hành trong tủ cấy vô trùng. Tủ cấy đƣợc tiệt
trùng trƣớc khi sử dụng bằng cách lau sạch bằng cồn 70
o
và bật đèn UV trong 20
phút.
2.3.1. Phương pháp
MT2
0