BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’-
BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ
MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN TIẾN HIỆP

TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(4’-
BROMOBEZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ
MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƢƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1 TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÁC DẪN CHẤT HYDANTOIN 2
1.1.1 Tác dụng chống co giật 2
1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 3
1.1.3 Tác dụng chống ung thư 4
1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP TỔNG HỢP 5-(4'-
BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH ….9
1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin .10
1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich…………………………….13
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, DUNG MÔI 15
2.2 THIẾT BỊ THÍ NGHIỆM 16
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.3.1 Phương pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn chất
base Mannich. 16
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc 17 2.2.3 Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư. 17
CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1 TỔNG HỢP HÓA HỌC 20
3.1.1 Tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin (H

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
13
C- NMR
: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13
1
H- NMR
: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
A549
: Tế bào ung thư phổi ở người
Ac
2
O
: Anhydrid acetic
AcOH
: Acid acetic
DMF
: Dimethylformamid
EGFR
: Epidermal growth factor receptor
(thụ thể của yếu tố tăng trưởng biểu mô)
EtOH
: Ethanol
ESI
: Phương pháp phun mù điện tử
Hep- G2
: Tế bào ung thư gan ở người
HMBC
: Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết
(Heteronuclear Multiple Bond Connectivity)
HSQC

6
)
29
Bảng 3.2
Số liệu phổ IR và phổ
1
H-NMR của các chất tổng hợp được
(H
0
-H
6
)
30
Bảng 3.3
Số liệu phổ 13C-NMR của các chất tổng hợp được (H
0
-H
6
)
31
Bảng 3.4
Số liệu phổ ESI_MS của chất H
0
và các dẫn chất base Mannich
(H
1
-H
6
)
32


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
HÌNH

TRANG
Hình 4.1.1. Phổ tương tác HSQC của chất H
0 40
Hình 4.2.1.Phổ tương tác HMBC của chất H
0

41
Hình 4.6.1. Phổ HSQC của hợp chất H
6 43
Hình 4.6.2 Phổ HMBC của hợp chất H
6
44

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc chiến chống lại bệnh tật, con người không ngừng tìm tòi, nghiên

( chất được phát hiện trong túi dịch niệu (the allantoin fluid) của bò cái), đó
là nguồn gốc tên hydantoin. Sau đó, năm 1864, A.Bayer [30] tổng hơp được
hydantoin với nguyên liệu đầu là bromoacetylure. Tuy nhiên cấu trúc vòng
của hydantoin chỉ được xác dịnh bởi Strecker vào năm 1873 [31].
N
H
NH
O
O
4
1
2
3
5

Hydantoin
Bản thân hydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên nhiều công
trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của
hydantoin có tác dụng phong phú và đa dạng như thuốc chống động kinh,
kháng khuẩn, chống ung thư [1], [3], [4], [8], [11], Các dẫn xuất thế ở vị trí
N
1
, N
3
, đặc biệt thế 2 lần ở vị trí C
5
đã được nghiên cứu và cho thấy tác dụng
sinh học đáng chú ý
1.1.1 Tác dụng chống co giật
Dẫn chất hydantoin được dùng nhiều nhất trong điều trị là 5,5-

N
NH
O
O
2

Một dẫn chất của nitrofurantoin thế ở N-3 với nhóm hydroxymethyl là
Nifurtoinol [3-hydroxymethyl-1-(5-nitrofurfurylidenamino)hydantoin] (3)
cũng có tác dụng như Nitrofurantoin và được áp dụng trong điều trị [17].
O
N
O
O
O
2
N
OH
3

Một số dẫn chất base Mannich ở N-3 của Nitrofurantoin (4) đã được tổng hợp
và thử nghiệm có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm tốt, trong đó có chất
đang được dùng làm thuốc tương tự như Nitrofurantoin nhưng bệnh nhân dễ
4

dung nạp hơn với biệt dược là Nifurfolin (1-(5’nitro-2-furfurylidenamino)-3-
morpholinomethylhydantoin) (5) [17]

O
O
2


Dẫn chất khác cũng có tác dụng kháng khuẩn, hiện được sử dụng trong điều
trị nhiễm khuẩn đường tiết niệu là Furazidin (1-{[3-(5-nitro-2-
furyl)allyliden]amino}hydantoin (6) [17].
HN
N
O
O
N
O
NO
2
6

1.1.3 Tác dụng chống ung thư
Một số dẫn chất hydantoin đã được ứng dụng trong điều trị ung thư như
là Nilutamid (7).
O
2
N
F
F
F
N
NH
CH
3
CH
3
O

O
O
9

Nhiều dãy chất 5-arylidenhydantoin đã được tổng hợp và thử nghiệm hoạt
tính chống ung thư ở nước ngoài cũng như ở Việt Nam.
Năm 2003, các tác giả Đinh Thị Thanh Hải, Nguyễn Quang Đạt, Lê Mai
Hương [6] cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng hai dòng tế bào ung thư ở
người (tế bào ung thư biểu mô (KB) và tế bào ung thư màng tử cung (FL))
của dãy chất 5-(5’-nitro-2’-furfurliden)hydantoin và các dẫn chất base
Mannich của nó. Kết quả là đã tìm được hai chất là 5-(5-nitro-2’-
furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (10) và 3-piperidinomethyl-5-(5’-nitro-2’-
furfuryliden)imidazolidin-2,4-dion (11) có hoạt tính kháng tế bào ung thư rất
mạnh (giá trị IC
50
là 0,2-1,04 (µg/ml) đối với dòng tế bào FL và 0,6-1,15
(µg/ml) đối với dòng tế bào KB).
N
H
H
N
O
O
O
NO
2
10

N
CH

HO
N
H
N
O
O
12

Các tác giả đã giả thiết cơ chế tác dụng kép của dãy chất này là do liên kết đôi
liên hợp ở ngoài vòng đã tạo cho nhân hydantoin có khả năng tác dụng là
tương tác với vị trí hoạt động của EGFR và alkyl hóa các chất ái nhân sinh
học. Giả thuyết này được ủng hộ bởi hoạt tính gây độc tế bào ung thư đã biết
của nhiều hợp chất thiên nhiên và tổng hợp có chứa nhóm carbonyl α,β-không
no [14].
Năm 2009, M.Mudit, M.Khanfar đã công bố công trình nghiên cứu về
phát minh, thiết kế và tổng hợp các dẫn chất 5-benzylidenhydantoin có hoạt
tính chống ung thư di căn lấy cảm hứng từ hợp chất thiên nhiên ở biển [21].
Từ loài bọt biển Hemimycale Arabica (Mycalidae) ở biển Hồng Hải, các tác
giả đã phân lập được 3 chất đã biết là (Z)-5-(4-hydroxybenzyliden)hydantoin
7

(13), 5-(4-hydroxybenzyl)hydantoin (14), (Z)-5-(6-bromo-1H-indol-3-
yl)methylenhydantoin (15).
NH
HN
O
O
HO
13
NH


Tiếp đó các tác giả đã tổng hợp 39 dẫn chất 5-benzylidenhydantoin, trong đó
có 8 chất mới. Thử nghiệm hoạt tính chống ung thư cho thấy chất (13) tự
nhiên và chất tổng hợp (Z)-5-(4-ethylthio)benzylidenhydantoin (16) có hoạt
tính mạnh ức chế sự tăng trưởng và sự xâm lấn của tế bào ung thư tuyến tiền
liệt trên invitro. Về mối liên quan cấu trúc –tác dụng của dãy chất này, các tác
giả có nhận xét là yếu tố lập thể ảnh hưởng đến tác dụng nhiều hơn yếu tố
điện tử và các chất có nhóm thế ở vị trí para của nhóm benzyliden mà có chứa
các nguyên tử oxy, nitơ hoặc lưu huỳnh có hoạt tính cao. Các hợp chất này có
tính chất nhận hydro, vì thế có thể có tương tác liên kết hydro ở vị trí para
NH
HN
O
O
S
16

Năm 2010, tác giả Vũ Trần Anh [1] đã nghiên cứu tổng hợp và thử hoạt
tính của các dẫn xuất hydantoin 17→25, 17(a-d)-25(a-d). Kết quả đã tổng
hợp được 43 dẫn chất của hydantoin trong đó có 9 dẫn xuất của 5-
arylidenhydantoin và 34 dẫn chất base Mannich của các dẫn xuất 5-
arylidenhydantoin. Tác giả đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 43 chất
tổng hợp được đối với 2 dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư gan
Hep-G2 và tế bào ung thư phổi LU. Kết quả cho thấy trong số 43 chất tổng
8

hợp được có 4 dẫn chất 5-arylidenhydantoin và 9 dẫn chất base Mannich của
chúng có hoạt tính kháng tế bào ung thư gan người Hep-G2
(IC
50

; 4'-OH; 4'-F
2' -Cl; 4'-Cl; 3'-NO
2
; 4' -NO
2
CH
N
H
N
O
O
R
1
2
3
4
5
6
1'
2'3'
4'
5'
6'
CH
2
NR
1
R
2
17(a-d) - 25(a-d)

(d)

Năm 2012, tác giả Đỗ Thị Thu Hằng [7] đã tổng hợp và thử họat tính kháng
tế bào ung thư của 15 dẫn chất 5-halogenoarylidenhydantoin và base Mannich
18(a-d)-20(a-d). Kết quả cho thấy 11 chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư
đại tràng HTC116 với IC
50
=10,17-19,23µg/ml.
9

1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
R = F (18) ; Cl (19) ; Br (20).
18(a-d) - 20(a-d)
N
R
1
R
2
N O

NH
O
O
R
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
CH
N
H
N
O
O
R
CH
2
NR
1
R
2


BROMOBENZYLIDEN)HYDANTOIN VÀ CÁC BASE MANNICH
Hydantoin (imidazolidin-2,4-dion) có công thức cấu tạo như sau:
10

N
H
NH
O
O
4
1
2
3
5

Từ cấu trúc phân tử hydantoin cho thấy nhiều khả năng phản ứng chuyển hóa
để tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau của hydantoin.
1.2.1 Phản ứng tổng hợp 5-arylidenhydantoin
Sơ đồ phản ứng:
N
H
NH
O
O
RCHO
1
2
3
4
5

với natri acetat khan, anhydrid acetic. Các aldehyd thơm đã được sử dụng là
benzaldehyd, 2-hydroxybenzaldehyd, furfural, vanillin,…
N
H
NH
O
O
Ar-CHO
1
2
3
4
5
N
H
NH
O
O
1
2
3
4
5
Ar
+
-H
2
O
AcOH, AcONa


Cl
2
. Khuấy hỗn
hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng, sau đó cất loại CH
2
Cl
2
, dùng vi sóng tần số
2405Hz, công suất 1250W tác động vào trong 2 phút.
RCHO
N
H
NH
+
O
O
Natri acetat/oxyd nhôm
vi sóng, 2 phút
N
H
NH
O
O
H
R
O
H

 Về cơ chế phản ứng ngƣng tụ
Phản ứng ngưng tụ giữa hydantoin và aldehyd thơm là phản ứng ngưng
tụ kiểu aldol xảy ra theo cơ chế sau [2]:
- Giai đoạn cộng hợp:
Nhóm methylen ở vị trí 5 của hydantoin rất hoạt động, nguyên tử H ở đây dễ
dàng tách khỏi carbon (khi có xúc tác base) và anion (II) được tạo thành là
một tác nhân ái nhân mạnh:
N
H
NH
O
O
+
B
HC
N
H
NH
O
O
+
BH

Anion (II) tấn công vào carbon mang điện tích dương phần C
δ(+)
của nhóm
carbonyl của aldehyd tạo sản phẩm cộng hợp (IV):
HC
N
H

HCAr
O
(IV)
BH
N
H
NH
O
O
H
HCAr
OH
(V)
+
B
+
13

- Giai đoạn ngƣng tụ loại nƣớc:

1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich
a) Định nghĩa phản ứng Mannich.
Phản ứng Mannich là phản ứng aminomethyl hóa các hợp chất hữu cơ có
nguyên tử H linh động bằng tác dụng của formaldehyd (hoặc các aldehyd
khác) và các amin bậc 1 hoặc amin bậc 2 (hoặc NH
3
) tạo ra dẫn chất có nhóm

b) Cơ chế phản ứng Mannich: phản ứng xảy ra qua hai giai đoạn:
-Giai đoạn 1: Amin phản ứng với fomaldehyd trong sự có mặt của acid, tạo
thành một chất trung gian, chất này lọai nước tạo thành tác nhân ái điện tử:
N
R
1
R
2
H

+
H
2
C OH
NH
R
1
R
2
CH
2
OH
+
N
R
1
R
2
CH
2

+
H
2
O
+
HH
N
H
NH
CH
Ar
O
O
OH
2
H
14

- Giai đoạn 2: Cation aminomethyl phản ứng với hợp chất có hydro linh
động.
+ Trường hợp hợp chất có hydro linh động không có khả năng tạo enol hóa
(như trường hợp hydro linh động ở các liên kết N-H, S-H, Se-H, P-H hoặc ở
liên kết C-H ở nhân indol, pyrol …) thì cation aminomethyl tấn công vào
nguyên tử mang hydro linh động tạo sản phẩm base Mannich:
+
N
R
1
R
2

R
2
R
1
H
2
C
+
C
OH
C
N
R
2
R
1
H
2
C
-
H
N
R
2
R
1
H
2
C
C

Merck
≥98%
5
N-methylpiperazin
Merck
≥98%
6
P-toluidin
Merck
≥98%
7
Pyrrolidin
Merck
≥98%
8
P-anisidin
Merck
≥98%
11
Cloroform
Trung Quốc
≥99%
12
Dimethylformamid
Trung Quốc
≥99.5%
13
Ethyl acetat
Trung Quốc
≥99.5%

- Máy khuấy từ IKA-RCT (Đức).
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ).
- Phổ hồng ngoại (IR) ghi trên máy Perkin Elmer, phòng Hóa Vật liệu,
Khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia
Hà Nội
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (
1
H-NMR,
13
C-NMR, HQSC, HMBC) ghi
trên máy AVANCE, Bruker AV500 tại Viện hóa học, Viện khoa học và
công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng (MS) ghi theo phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS)
trên máy LC-MSD-Trap-SL, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phƣơng pháp tổng hợp 5-(4’-bromobenzyliden)hydantoin và dẫn
chất base Mannich.
- Sử dụng các phương pháp thực nghiệm trong hóa hữu cơ để tổng hợp các
chất dự kiến.
- Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế sản phẩm thu được.
- Dùng SKLM để theo dõi phản ứng và sơ bộ xác định độ tinh khiết.
17

2.3.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc
Các phương pháp phổ (IR,
1
H-NMR,
13
C-NMR, HQSC, HMBC, MS)