BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH HIỀN ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ SAO CHÉP hMAM mRNA,
SURVIVIN mRNA TỪ TẾ BÀO
UNG THƯ VÚ
Chuyên ngành : Hóa sinh
Mã số : 62720112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC

HÀ NộI - 2014

1. Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh Phúc, Lê
Quang Huấn (2012), Nghiên cứu phát hiện Survivin mRNA,
hMAM mRNA từ các tế bào ung thư trong máu,Tạp chí Y học Việt
Nam, tháng 8- số 2/2012, trang 5-12.
2. Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh Phúc, Lê
Quang Huấn (2012), Nghiên cứu sự sao chép (Transcription)
gen Survivin từ các tế bào ung thư vú lưu hành trong máu
(2012),Tạp chí Y học thực hành số 846-2012, trang 204-208.
3. Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh
Phúc, Lê Quang Huấn, Nghiên cứu phát hiện hMAM
mRNA từ các tế bào ung thư vú trong máu (2013), Tạp
chí ung thư học Việt Nam, số 1-2013, trang 443-450.

ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Lý do chọn đề tài
Ung thư vú là loại ung thư hay gặp trên thế giới, đứng hàng đầu
ung thư ở nữ giới. Theo cơ IARC, ung thư vú chiếm 21% tổng số các
loại ung thư ở phụ nữ trên thế giới. Hàng năm trên toàn thế giới có
khoảng 1,15 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và
465 000 ca tử vong. Theo các nhà ung thư học, ung thư vú nếu được
phát hiện sớm, điều trị kịp thời thì tỷ lệ sống trên 5 năm cao hơn một
cách rõ rệt.Từ hơn hai thập niên gần đây công nghệ sinh học, đặc biệt

được nghiên cứu ở Việt Nam trong những năm gần đây và đã thu được
nhiều thành công. Tuy nhiên nghiên cứu về sự sao chép bất thường các
gen ung thư từ tế bào ung thư trong máu còn rất mới ở Việt Nam và
trên thế giới. Nghiên cứu dựa trên sự sao chép bất thường của gen
hMAM và survivin ở dòng tế bào ung thư để phát hiện tế bào ung thư
trong mô, trong máu bệnh nhân ung thư vú. Nghiên cứu đã xây dựng
được quy trình phát hiện, đường chuẩn xác định số bản sao gen hMAM
và survivin từ dòng tế bào ung thư vú nuôi cấy. Bằng kỹ thuật RT-
PCR nghiên cứu đã xác định được tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM
mRNA, Survivin mRNA ở mô và máu bệnh nhân ung thư vú, trong mô
và máu bệnh nhân u xơ vú, đồng thời làm sáng tỏ mối liên hệ giữa sao
chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô và máu bệnh nhân ung thư
vú với các yếu tố lâm sàng, mô bệnh học liên quan đến ung thư vú.
Luận án đã chứng minh được mức độ sao chép hMAM mRNA,
survivin mRNA ở mô ung thư cao hơn mô u xơ, mức độ sao chép các
gen này trong mô ung thư khác biệt không có ý nghĩa thống kê với
trong máu ung thư trên cùng lượng RNA tổng số đưa vào. Kết quả mở
ra triển vọng có thể phát hiện TBUTM từ giai đoạn sớm góp phần
chẩn đoán, theo dõi điều trị ung thư vú.
4. Cấu trúc luận án:
- Luận án được trình bày trong 120 trang chính (không kể tài
liệu tham khảo và phần phụ lục). Luận án được chia làm 7 phần:
+ Đặt vấn đề: 2 trang
+ Chương 1: Tổng quan tài liệu 31 trang
+ Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 15 trang
+ Chương 3: Kết quả nghiên cứu 38 trang
+ Chương 4: Bàn luận 32 trang
+ Kết luận: 1 trang
+ Kiến nghị: 1 trang
Luận án gồm 18 bảng, 1 sơ đồ và 33 hình, sử dụng 108 tài liệu

1.1.2. Chẩn đoán ung thư vú
Hiện tại, ung thư vú được chẩn đoán xác định dựa vào:
+ Lâm sàng: sờ thấy khối u ranh giới tương đối rõ.
+ Cận lâm sàng:
Chẩn đoán hình ảnh
Chụp XQ thường, chụp vú (Mammography), Siêu âm, PET/CT và
PET/ MRI, ghi hình miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoscintigrapy- RIS).
Giải phẫu bệnh học ứng dụng trong chẩn đoán ung thư vú
Có nhiều phương pháp chẩn đoán ung thư vú nhưng kết quả mô
bệnh học vẫn được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán xác định
ung thư vú.
Hóa sinh học và hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán ung thư vú
Dấu ấn ung thư (turmor marker) là một nhóm các chất (enym, hormon, receptor, protein ) được các tế bào khối u trực tiếp sản xuất
hoặc do các tế bào bình thường sản xuất do tác động kích ứng của các
tế bào ung thư, các chất này đi vào vòng tuần hoàn và có thể được sử
dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư.
1.2. TBUTM
1.2.1. Đặc điểm TBUTM
TBUTM được phát hiện trong máu của bệnh nhân ung thư được
coi là dấu hiệu phát tán của bệnh. Các tế bào này mang đặc tính của tế
bào ung thư nguyên phát, mang một số gen đặc trưng khối u mà người
bình thường không thấy biểu hiện. Khi di chuyển trong máu các tế bào
này tồn tại ở dạng không biệt hoá, nhưng nó sẽ phân chia khi đến một
tổ chức thích hợp dưới sự hiện diện của các tác nhân đặc thù. Theo
quan niệm trước đây di căn ung thư vú xảy ra ở giai đoạn muộn khi có
khối u nguyên phát rõ ràng, nhưng trong những năm gần đây các nhà
khoa học đã sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh được quá

 Human mammaglobin (hMAM)
Mammaglobinlà thành viên của họ uteroglobin, lần đầu tiên
được mô tả năm 1996 bởi Watson và Fleming. Cho đến nay người
ta đã phát hiện 23 thành viên thuộc siêu họ ung thư uteroglobin,
trong đó 9 thành viên được phát hiện ở người. Người ta quan tâm
tới 2 thành viên mammaglobin là MammaglobinB mã hóa bởi gen
SCGB2A1 (secretoglobinB2A1), biểu hiện cao ở ung thư buồng
trứng. MammaglobinA (thường gọi là hMAM) được mã hóa bởi một
gen SCGB2A2, biểu hiện cao ở ung thư vú.SCGB2A2 nằm trên
nhiễm sắc thể 11q12.2 và tổng hợp nên glycoprotein gồm 93aa, có
TLPT 10,5kDa.SCGB2A2 được phát hiện lần đầu tiên ở tiền liệt
tuyến của chuột và sự xuất hiện của nhóm protein này có liên quan
đến hormon steroid.SCGB2A2 là 1 đoạn gen gồm 3 exon (119bp,
188bp và 199bp) và 2 intron (603 bp and 1888 bp).
Mặc dù vai trò gây bệnh ung thư vú của hMAM vẫn chưa được
rõ ràng nhưng có hai giả thuyết mà người ta thấy là hMAM có liên
quan đến ung thư vú: (i) người ta đã phát hiện sự có mặt của hMAM
trên các mẫu mô được chẩn đoán chắc chắn là ung thư vú bằng kỹ
thuật Northern blot và RT-PCR, không thấy trên các mẫu mô vú lành
tính. (ii) hMAM được biểu hiện ở nhiều dòng tế bào ung thư vú.
hMAM chiếm tỷ lệ dương tính ở 5/10 dòng tế bào ung thư vú, 21% ở
mô ung thư vú nguyên phát, 62% ở mô ung thư vú có di căn xa. Cơ
chế gây ung thư của gen hMAMliên quan đến thay đổi tế bào biểu mô
tuyến vú, kích thích tăng trưởng, tăng tỷ lệ phân bào, nó đặc hiệu cho
ung thư dạng biểu mô.
1.3. Nghiên cứu phát hiện tế bào ung thư vú bằng kỹ thuật sinh
học phân tử ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, sinh học phân tử đã được áp dụng để
phát hiện tế bào ung thư và đã thu được thành công đáng kể. Đầu tiên


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu và sử lý số liệu
- Mô tả cắt ngang
- Thống kê dựa vào phần mềm SPSS 16.0
2.2.2. Địa điểm, thiết bị nghiên cứu
-Bệnh nhân được lựa chọn từ khoa ngoại vú bệnh viện K
- Hoá chất trang thiết bị nghiên cứu phục vụ cho phân tích gen: Thực hiện tại phòng thí nghiệm của Phòng Công nghệ Tế bào Động
vật Viện Công nghệ sinh học, bộ môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà
Nội.
- Quy trình nghiên cứu

Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu Máu

(ly trc khi iu tr)

Mô

(Ly ngay khi

Kt lun
Ch
ọ
n do
̀
ng
tê
́

ba
̀
o UTV

(BT474, MDA-MB23-1,
KPL4, MCF7)

Xây dựng đường chuẩn Realtime PCR
Số bản sao thu được từ sản phẩm PCR được tính như sau:
X(g)/µl DNA/[Chiều dài đoạn RNA× 2×340]×6.022×10
23
=Y
bản sao/ µl. Trong đó: 340 là khối lượng phân tử của một nucleotide
6.022×10
23

hiện sản phẩm. Nhân bản bằng mồi survivin cho kết quả dòng tế bào
MDA-MB231, KPL4, MCF7 xuất hiện băng điện di kích thước
khoảng 170bp, dòng tế bào BT474 không thấy xuất hiện sản phẩm.
Để khẳng định đoạn gen nhân bản được, phải giải trình tự so sánh
với đoạn gen được công bố tại ngân hàng gen.
3.1.2. Giải trình tự sản phẩm PCR gen hMAM, survivin đã khuếch đại
 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR gen hMAM
Sản phẩm PCR với mồi gen hMAM F/R được giải trình tự trực
tiếp trên máy xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant (Applied
Biosystems)
Hình 3.2: Hình ảnh so sánh kết quả giải trình tự bản sao gen
hMAM nhân bản được với trình tự hMAM mRNA công bố tại ngân
hàng gen
Nhận xét: Kết quả giải trình tự bản sao gen hMAM, so sánh với
các trình tự gen đã đăng trên Ngân hàng Gen Quốc tế có sự trùng lặp
Hình 3.1: Hình nh in di
sn phm PCR DNA ca
hMAM, survivin, GADPH 
dòng t bào ung th vú
Dòng t bào MDA-MB231,
KPL4, MCF7, BT474,M: thang
DNA chun =1kb
100% với các trình tự đã đăng trên Genbank mã số: AY893203,
AY888136, U33147 …

22

51,2

Giai đo
ạn bệnh

I 8 18,6
II 19 44,2
III 11 25,6
IV

5

11.6

Kích thư
ớc u

T1 10 23,3
T2 17 39,5
T3 13 30,2
T4

3

7,0

Bảng 3.2: So sánh RNA tổng số ở nhóm ung thư vú và u xơ vú
Nhóm bệnh n
Máu (ng/µl)

(
X
± SD)

Mô (ng/µl)

(
X
± SD)

ung thư vú (1)

43

110,6±21,3

240,6±64,9

u xơ vú (2)

21

103,0±16,0

220,8±64,7


hMAM (+) Survivin (+)
Tuổi
≤ 50
>50
Tổng

21
22
43

16/21(76,2%)
20/22(90,9%)
p=0,19

16/21 (76,%)
16/22 (72,7%)
p=0,7
Kích thước u
T
1

T
2

T
3
và T
4

Tổng

p=0,29

28/38 (73,7%)
4/5 (80,0%)
p=0,76
Di căn h
ạch

Không di căn hạch
Có di căn hạch

13
30

10/13 (76,9%)
26/30(86,7%)

8/13(61,5%)
24/30(80,0%) Tổng 43 p=0,4 p=0,2
Giai đoạn bệnh
I
II
III và IV
Tổng

8
19

24/29 (82,8%)
4/8 (50,0%)
4/6 (66,7%)
p=0,15
Biến đổi CA 15-3
Không tăng
Có tăng
Tổng

33
10
43

29/33(84,4%)
7/10 (70,0%)
p=0,5

26/33(87,8%)
6/10(60,0%)
p=0,2
Nhận xét: Tỷ lệ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở
mô ung thư khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở nhóm trên và dưới
50 tuổi (p>0,05), ở các kích thước u, giai đoạn bệnh khác nhau, ở
nhóm có di căn và chưa phát hiện thấy di căn (p>0,05), không khác
biệt ở các thể mô bệnh học khác nhau, ở những bệnh nhân có tăng
CA15-3 và nhóm không tăng (p>0,05)
3.2.3. Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
trong máu bệnh nhân ung thư vú và máu bệnh nhân u xơ vú.

Hình 3.4: Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin

21
22
43

10/21(47,6%)
13/22(59,1%)
p=0,45

6/21(28,6%)
13/22(59,1%)
p=0,051
Kích thư
ớc u

T
1

T
2

T
3
và T
4

Tổng

10
17
16

4/5(80,0%)
p=0,08
H
ạch

không
có
T
ổng13
30
435/13 (38,5%)
18/30 (60,0%)
p=0,193/13(23,1%)
16//30(53,3%)
p=0,06

Giai đo
ạn bệnh

I
II

16/29 (55,2%)
3/8(37,5%)
4/6((66,7%)
p=0,52

16/29(55,2%)
2/8(25,0%)
1/6(16,7%)
p=0,1
Bi
ến đổi CA 15
-
3

Không tăng
Có tăng
Tổng

33
10
43

16/33(48,5%)
7/10(70,0%)
p=0,23

16/33(48,5%)
3/10(30,0%)
p=0,9
Nhận xét:Không có sự khác biệt về tỷ lệ sao chép hMAM

của hMAM mRNA sau khi có kết quả chu kỳ ngưỡng.
Hình 3.6: Real-time PCR hMAM cDNA xác định ngưỡng phát hiện
trên dòng tế bào ung thư vú BT474
Nhận xét: Đường chuẩn được tạo bằng đo CP ở 5 ống phản
ứng. Ống 1x là ống cDNA hMAM được tạo từ 20.000 tế bào BT474,
tương đương 10
5
bản sao. Ở mức pha loãng 100 lần, tương đương 200
tế bào ung thư vú thì phát hiện được, với CP là 33,14 và số bản sao
893, thấp hơn ngưỡng này được coi là không phát hiện được.
 Đườ
ng chuẩn và ngưỡng phát hiện survivin mRNA từ tế bào
ung thư vú MCF7
Ngưỡng phát hiện và đường chuẩn survivin được thiết lập từ
20.000 tế bào MCF7 Hình 3.7: Real-time PCR survivin cDNA xác định ngưỡng phát hiện
trên dòng tế bào ung thư vú MCF7
Nhận xét: Ở mức pha loãng 100 tương đương 200 tế bào là
ngưỡng thấp nhất phát hiện sự sao chép survivin.Ngưỡng Cp phát
hiện survivin cDNA nhân bản được là 26,14, tương đương 1.08E4
bản sao.
Bảng 3.5: Mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô
ung thư vú và mô u xơ
U xơ vú 21 18.52 389.00
Total 64 P<0,001

Nhận xét: So sánh bản sao hMAM trong mô
Thứ hạng trung bình của nhóm ung thư vú: 40,9, thứ hạng trung
bình của nhóm u xơ vú: 15,21. Sự sao chép hMAM mRNA ở mô ung
thư vú cao hơn mô u xơ vú có ý nghĩa thống kê (p<0,001).
So sánh bản sao survivin trong mô
Thứ hạng trung bình của nhóm ung thư vú: 39,33, thứ hạng
trung bình của nhóm u xơ vú: 18,52, sự sao chép survivin mRNA ở mô
ung thư vú cao hơn mô u xơ vú có ý nghĩa thống kê (p<0,001).
3.3.3. So sánh mức độ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
trong máu và trong mô bệnh nhân ung thư vú Bảng 3.7: So sánh mức độ sao chép hMAM mRNA ở mô và máu
bệnh nhân ung thư vú Bản sao
survivin
trong mô- Bản
sao survivin trong máu
Bản sao
hMAM
trong mô- Bả
n sao
hMAM trong máu
n Mean Rank
Sum of

(p)

hMAM mRNA
43 0,321 0,036
Survivin mRNA
43

0,479

0,001

Nhận xét: Sử dụng phân tích hồi quy tuyến tính đơn biến trong
đó bản sao ở mô ung thư là biến độc lập, bản sao ở máu bệnh nhân ung
thư vú là biến phụ thuộc. Kết quả cho thấy mức ý nghĩa thống kê
p<0,05, hệ số tương quan (r) giữa sự sao chép ở mô và máu của gen
hMAM và survivin nằm trong khoảng (0,3-0,5) tương quan thuận ở mức trung bình
3.3.4. Diễn tiến sự sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA theo giai đoạn
bệnh Hình 3.8: Diễn tiến sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
trong máu, môtheo các giai đoạn bệnh
Nhận xét: Trong 4 giai đoạn ung thư vú, giai đoạn 2 số bản
sao cả hMAM và Survivin đều lớn nhất sau đó giảm dần ở giai đoạn
3 và 4. Có sự tương đồng về sự tăng sao chép ở mô và ở máu. Khi ở
mô có sự tăng bản sao hMAM mRNA, survivin mRNA thì cũng có
sự tăng tương ứng của các bản sao trong máu.

thước u từ nhỏ đến lớn, phù hợp với thực tế lâm sàng và với các kết
quả trong nước về giai đoạn bệnh phần nào dựng được bức tranh
toàn cảnh về bệnh ung thư vú đảm bảo tính khoa học của nghiên cứu
thực nghiệm.
4.2.2. RNA tổng số, tổng hợp cDNA.
So sánh nồng độ RNA thu được ở bệnh nhân ung thư vú và u xơ
vú cho thấy lượng RNA tổng số ở mô (bao gồm mô ung thư và mô u xơ
vú) nhiều hơn trong máu (bao gồm máu ung thư vú và máu bệnh nhân u
xơ vú). Kết quả này phù hợp với thực tế ở mô là tổ chức đặc, số lượng tế
bào thu được nhiều hơn trong máu. Tuy nhiên không có sự khác biệt
(p>0,05) về lượng RNA tổng số trong máu ung thư so với máu bệnh
nhân u xơ vú, mô ung thư và mô u xơ vú. Như vậy bệnh nhân ung thư
vú mặc dù có hiện tượng tăng sao chép hMAM mRNA và survivin
mRNA những trên tổng thể các RNA không có sự khác biệt với bệnh
nhân u xơ vú. Vì sự khuếch đại gen hMAM và survivin từ các nguồn
không giống nhau: 30 gr mô và 250 µl máu được tách bạch cầu, nên cần
phải chuẩn hóa đầu vào sao cho giống nhau giữa mô và máu để thuận
tiện cho việc so sánh kết quả. Để thực hiện được sự chuẩn hóa này, sau
khi đo OD để biết khối lượng RNA tổng số trong 1µl sẽ hiệu chỉnh bằng
cách pha loãng hoặc bổ xung thêm sao cho có khoảng 100ng RNA tổng
số trong 20µl ống phản ứng cDNA
4.2.3. Tỷ lệ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA trong mô ung
thư vú và mối liên quan với các chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng trong bệnh ung thư vú.
Trong số 43 mẫu mô ung thư vú nghiên cứu: có 36/43 trường
hợp (chiếm tỷ lệ 83,7%) phát hiện được sự sao chép của hMAM
mRNA. Kết quả này cũng gần tương đương với các nghiên cứu trước,
tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA ở mô ung thư vú theo Rocella và cộng

sự sao chép hMAM mRNA chiếm 53,5%. Trong số 21 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú, không phát hiện được mẫu nào có bản sao hMAM
mRNA. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Cheng, Shen,
Rocella. So sánh với kêt quả nghiên cứu của Rocella tỷ lệ biểu hiện
hMAM mRNA ở máu ngoại vi là 12%, không thấy biểu hiện hMAM ở
máu bệnh nhân u vú lành tính và người khỏe mạnh. Theo nghiên cứu
của Cheng Y (2014), hMAM được phát hiện ở trong máu bệnh nhân
ung thư vú là 75,4%, không phát hiện thấy ở ung thư biểu mô khác,
bệnh vú lành tính, cũng như người khỏe mạnh. Tỷ lệ phát hiện hMAM
mRNA trong máu liên quan đến giai đoạn bệnh (p=0,01). Tỷ lệ phát
hiện hMAM mRNA trong máu ở bệnh nhân ung thư vú có kích thước
dưới 2cm là 30%. Có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA
trong máu theo kích thước u (p=0,02), di căn xa (p=0,027).Theo
nghiên cứu của Lee tỷ lệ phát hiện hMAM mRNA trong máu giai đoạn
I,II là 23,4%, giai đoạn III,IV là 82,9%, tỷ lệ biểu hiện hMAM mRNA
trong máu liên quan đến di căn hạch, di căn xa, các thụ thể nội tiết.Kết
quả phát hiện survivin mRNA trong máu là 19 trường hợp chiếm tỷ lệ
44,2%. Không phát hiện thấy bản sao survivin mRNA trong máu bệnh
nhân u vú lành tính. Theo kết quả nghiên cứu của Yie và cộng sự, tỷ lệ
phát hiện survivin mRNA trong máu là 50,7%, không phát hiện thấy ở
người khỏe mạnh. Sau khi nghiên cứu trên 76 bệnh nhân ung thư vú
Shin-Ichi và cộng sự đã đưa ra kết luận survivin mRNA ở giai đoạn I
là 16,1%, giai đoạn II là 33,3%, giai đoạn III là 88,8%, có sự liên quan
giữa tỷ lệ phát hiện survivin trong máu với giai đoạn bệnh (p<0,001).
Survivin mRNA trong máu còn liên quan đến kích thước u, di căn
hạch. Kết quả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ sao chép survivin mRNA
trong máu bệnh nhân ung thư vú giai đoạn I là 25%, giai đoạn II là
31,6%, giai đoạn III và IV là 68,8%, sự liên quan giữa survivin mRNA

4.3.2. Sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA ở mô ung thư vú
và mô u xơ vú
Kết quả cho thấy số bản sao hMAM mRNA được khuếch đại ở
mô ung thư vú: 5,031E5±2,5888E6; mô u xơ vú 164±543. Tương tự số
bản sao của survivin mRNA được khuếch đại ở mô ung thư vú
8,278E4±174629; mô u xơ 3733±11537. Vì số bản sao không tuân
theo quy luật chuẩn, để kiểm định sự khác biệt về mức độ sao chép của
mô ung thư vú so với mô u xơ vú phải sử dụng kiểm định phi tham số
Mann-Whitneycho kiểm định các trung vị. Kết quả cho thấy sự sao
chép hMAM mRNA, survivin mRNA ở mô ung thư vú cao hơn mô u
xơ vú có ý nghĩa thống kê với p<0,001. Năm 2004, Shi và cộng sự đã
chứng minh được hMAM được phát hiện ở mô ung thư vú, mô vú lành
tính, không phát hiện thấy ở mô lành tính khác, mức độ biểu hiện của
hMAM ở mô ung thư vú tăng gấp 10 lần so với mô u vú lành tính, sự
tăng cường sao chép này liên quan đến tăng 345 bp đầu tiên của
promotor mã hóa.O’ Brien cho rằng hMAM mRNA ở mô ung thư vú
cao gấp 10 đến 20 lần mô vú bình thường, hiếm khi ở các mô bình thường khác. Mặc dù có sự sao chép ở mô u xơ nhưng mức độ sao
chép rất thấp. Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu trước,
hMAM mRNA, survivin mRNA tăng rất cao ở mô ung thư vú và dòng
tế bào ung thư vú .
4.3.3. So sánh mức độ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
trong máu và trong mô bệnh nhân ung thư vú
Sử dụng kiểm địnhWilcoxon Signed Ranks Test cho kết quả
không có sự khác biệt về số lượng bản sao hMAM mRNA và survivin
mRNA ở mô ung thư vú và máu ung thư vú với p>0,05. Mối tương
quan giữa mức độ sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA ở
trong máu bệnh nhân ung thư vú với mô ung thư vú là mối tương

1. Sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ mô ung thư vú
-Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
trong mô ung thư vú lần lượt là 36/43 (chiếm tỷ lệ 83,7%), 32/43 (chiếm
tỷ lệ 74,4%).
- Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA
trong mô u xơ vú lần lượt là: 2/21(chiếm tỷ lệ 9,5%), 3/21 (chiếm tỷ lệ
14,3%).
- Mức độ sao chép hMAM mRNA và Survivin mRNA ở mô ung
thư vú cao hơn mô u xơ vú (p<0,05).
- Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
ở mô ung thư vú không liên quan đến tuổi, kích thước u, tình trạng
hạch, giai đoạn bệnh, tình trạng di căn xa, các thể mô bệnh học, sự
biến đổi CA15-3 (p>0,05).
2. Sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung
thư vú lưu hành trong máu.
- Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA
trong máu ung thư vú lần lượt là: 23/43 (chiếm tỷ lệ 53,5%), 19/43
(chiếm tỷ lệ 44,2%).
- Không phát hiện được sự sao chép hMAM mRNA và
survivin mRNA trong máu bệnh nhân u xơ vú.
- Tỷ lệ phát hiện sự sao chép hMAM mRNA và survivin mRNA
ở máu liên quan đến kích thước u, giai đoạn bệnh (p<0,05).
- Mức độ sao chép của hMAM mRNA và survivin mRNA không
có sự khác biệt giữa máu và mô ung thư vú (p>0,05).

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nghiên cứu sự sao chép hMAM mRNA và survivin
mRNA với cỡ mẫu lớn hơn độ nhạy, độ đặc hiệu trong chẩn đoán sớm
và theo dõi điều trị, để có thể ứng dụng các gen này trong chẩn đoán,
Ha Noi – 2014
THE DISSERTATION IS COMPLETED AT
HANOI MEDICAL UNIVERSITY
Scientific guidance: 1. Ass Prof.PhD. Pham Thien Ngoc
2. Ass Prof.PhD. Tran Van Thuan Reviewer 1:

Reviewer 2:

Reviewer 3: The dissertation will be presented to the Board of Ph.D dissertation at
University level at Hanoi Medical University.
At date month year

The dissertation can be found at:
- National Library of Vietnam
- Library of Hanoi Medical University
- Library of Vietnam Medical Information.

CTC breast cancer.
3. Scientific and practical significance of the subject
An important characteristic of invasive cancer is spreading, cell
extravasation, migration and metastasis by mitosis. The CTC has been
2

an important role in breast cancer. CTC valid diagnosis, prognosis,
predict distant metastasis. Gene expression changes depend on the
characteristics of the tumor and CTC can distinguish normal cells.
The molecular biology techniques, detect abnormal transcription
of the gene in breast cancer tissues studied in Vietnam in recent years
and has gained much success. However, studies abnormal transcription
of the gene from the CTC is very new in Vietnam and around the world.
Research based on the abnormal transcription of hMAM and survivin in
cancer cells line to detect cancer cells in the tissue, the blood of breast
cancer patients. Research has established processes to detect and stand
curve determined the copy numbers of hMAM and survivin gene from
the breast cancer cell line cultures. By RT-PCR techniques were studied
to determine the detection rate of hMAM mRNA, survivin mRNA
transcription in tissues and blood of breast cancer, the blood and tissue
of benign breast tumors, that clarifying the relationship between hMAM
mRNA, survivin mRNA in tissues and peripheral blood of breast cancer
patients with clinical factors, histopathology. Our data were
demonstrated hMAM mRNA, survivin mRNA level in cancer tissue is
higher than fibrosis tissue.
4. Thesis structure:
- The thesis is presented in the 120 pages (not including
references and appendices). The thesis is divided into 7 sections:
+ Introduction: 2 pages
+ Chapter 1: Overview 31 pages

+ The lymphatic route:
+ The blood route:
 Breast Cancer Stages
TNM system
Below is a ranking system of the AJCC stage (2004), most of
national applying this system
1.1.2. Diagnosis Breast Cancer
Currently, diagnosis of breast cancer is determined based on:
4

Clinical: palpable tumor boundaries are relatively clear.
Imaging Diagnostic
X ray, Mammography, Ultrasound, PET/CT and PET/MRI,
recording radioimmunoassay (Radioimmunoscintigrapy- RIS).
Pathology
There are many methods for breast cancer diagnosis but
histopathological results are still considered the gold standard for
definitive diagnosis of breast cancer.
Biochemistry
Tumor marker is a group of substances (enzyme, hormones,
receptors, proteins ) are tumor cells directly produced by the cells or
normal production due to irritation of the cancer cells, these substances
circulating and can be used to diagnose and monitor cancer treatment.
1.2. CTC
1.2.1. CTC features
CTC was detected in the blood of cancer patients are considered
signs disease spread. These cells are the characteristics of primary
cancer cells, bearing a specific genes tumor that are not normally found
expression. When moving blood cells exist in undifferentiated form, but
it will split as to an appropriate organization in the presence of the

23 members of the uteroglobin superfamily cancer, including 9 members
detected in humans. Interested two members: B mammaglobin is
encoded by SCGB2A1 (secretoglobinB2A1), highly expressed in ovarian
cancer. MammaglobinA (hMAM) is encoded by a gene SCGB2A2,
highly expressed in breast cancer. SCGB2A2 located on 11q12.2
chromosome and the synthesis of glycoproteins, including 93aa, there
TLPT 10,5kDa. SCGB2A2 first detected in prostate rat and the
emergence of this group of proteins related to steroid hormones.
SCGB2A2 gene consists of 3 exons (119bp, 188bp and 199bp) and two
introns (603 bp and 1888 bp).
Although the hMAM role in the breast cancer cause still unclear
but there are two theories that people see is hMAM related to breast
cancer: (i) it has detected the hMAM on the tissue samples are diagnosed
with breast cancer is certainly by Northern blot technique and RT-PCR,
not found in benign breast tissue samples. (ii) hMAM is expressed in
many breast cancer cell lines. hMAM positive proportion in 5/10 breast
cancer cell lines, 21% in primary breast cancer tissue, 62% in breast
6

cancer tissue metastases. Also hMAM be considered related to breast
cancer because of its close relationship to breast biology and
uteroglobin, a role in regulating progesterone. The mechanism of cancer
causing genes hMAM unknown, but we see it related to changes
mammary epithelial cells, stimulate growth, increase the rate of cell
division, it is specific for the epithelial cancer tissue.
1.3. The study found breast cancer cells using molecular biology
techniques in Vietnam
In recent years, molecular biology has been used to detect cancer
cells and have gained significant success. That is the first study of Ta
Thanh Van et al, research about the copy of the HIP gene in breast

- Research Proces
SUMMARY CHART RESEARCH PROCESS


- copies number hMAM,
Survivin

1.
Evaluation hMAM mRNA,
survivin mRNA transcription
from breast cancer tissue.
2. Evaluation hMAM mRNA,
survivin mRNA trancription
from CTC.

Conclusion

C
ancer cell line

(BT474, MDA-MB23-1, KPL4, MCF7)
8

2.2.3. Steps
Standardized technical procedures on the breast cancer cell lines and
then applied on the sample studied. Specific procedures are as follows:
2.2.3.1. Sampling
2.2.3.2. Primer design
2.2.3.3. Process cultured breast cancer cell lines
2.2.3.4. Techniques total RNA extraction from breast cancer cell lines,
blood and tissue studies
2.2.3.5. Determine the concentration and purity of RNA samples by
Nano drop 1000.
2.2.3.6. RT-PCR synthesis cDNA

survivin gene in breast cancer cell lines
3.1.1. Results RT-PCR detection hMAM mRNA and survivin mRNA
in cell lines

Reviewers: After cloning of hMAM, survivin cDNA by PCR in four
breast cancer cell lines, electrophoretic results showed KPL4 cell line,
MCF7, BT474 appears clear electrophoretic band of about 202bp,
MDA-MB231 cell lines. Cloning survivin results MDA-MB231, KPL4,
MCF7 appearance electrical tape around 170bp, BT474 cell line did not
show. To confirm gene fragment was cloned, sequenced to compare
with published Gene Bank
3.1.2. Sequencing hMAM, survivin were amplified
Results sequencing hMAM gene amplified primers hMAM F / R
directly sequenced on automated sequencing ABI 3100 Avant (Applied
Biosystem Reviewers: Sequencing results hMAM gene, similarity 100% with
the gene sequence was published in Gene Bank identification numbers:
AY893203, AY888136, U33147.
.

Figure 3.1:
Images electrophoresis of
PCR hMAM, survivin, GAPDH cDNA in
breast cancer cell lines

Figure 3.2: comparing the
sequences hMAM gene copies
with that in the gene bank

T2 17 39,5
T3 13 30,2
T4 3 7,0
Distant metastasis
M0 38 88,4
M1 5 11,6
Lymph node
N0 13 30,2
N1 17 39,6
N2 13 30,2
Histopathology type
Ductal 29 67.5
lobular 8 18,6
mucous 6 13,9
CA15-3 (32 U/ml)
≤ 32 33 76.7
>32 10 23.3
11

Reviewers: The breast cancer patients were divided into 2 age
groups, over and lower 50 age ratio is 48.8% and 51.2%. Researchers
have collected enough disease stage, which is the highest stage II 44.2%.
There is have the size from T1 to T4 tumors, which account for 23.3%
T1, 13 patients had no lymph node occupancy rate 30.2%. On
histopathological, mainly ductal rate 67.4 %. Among 43 breast cancer
patients studied, 33 patients did not have increased CA15-3 rate 76.7%.
3.2.2.2. Total RNA extracted
Table 3.2: Comparison of total RNA in the group of breast cancer
and fibroids breast
Patient n

Characteristics No. of cases (n) hMAM (+) Survivin (+)
Age (year)
≤ 50
>50
total

21
22
43

16/21(76.2%)
20/22(90.9%)
p=0.19

16/21 (76.%)
16/22 (72.7%)
p=0.7
Tumor size
T1
T2
T3 và T4
total

10
17
16
43

9/10 (90.0%)
13/17 (76.5%)

43

10/13 (76.9%)
26/30(86.7%)
p=0.4

8/13(61.5%)
24/30(80.0%)
p=0.2
Glade of cancer
I
II
III và IV
total

8
19
16
43

7/8(87.5%)
15/19(78.9%)
14/16(87.5%)
p=0.75

4/8(50.0%)
14/19(73.7%)
14/16(87.5%)
p=0.13
Histopathology

p=0.5

26/33(87.8%)
6/10(60.0%)
p=0.2
13

Reviewers: data were examined using Chi-square. Positive hMAM
mRNA, survivin mRNA ratio in cancer tissue no difference in the
groups was statistically significant over and under 50 years of age
(p>0.05), in the tumor size, disease stage different, in the metastatic
group and found no metastasis (p>0.05), not different in various
histopathology, in patients with increased CA15-3 and the group did not
increase (p> 0.05).
3.2.3. RT-PCR detection transcription of hMAM mRNA, survivin
mRNA in breast cancer peripheral blood and breast fibroid
patient's blood. Figure3.4: Detection hMAM mRNA, survivin mRNA rate
transcription in breast cancer blood and breast fibrois blood
Reviewers: hMAM mRNA, surviving mRNA was positively
detected in 23 cases (53.5%), 19 cases (44.2%) breast cancer blood, no
detection hMAM mRNA, survivin mRNA copies in breast fibrosis blood
Table 3.4 Survivin, hMAM expression in breast cancer blood and
clinicopathologicalal factor
14

10
17
16
43

3/10 (30.0%)
7/17 (41.2%)
13/16 (81.2%)
p= 0.02

2/10(20.0%)
6/17(35.3%)
11/16(68.8%)
p=0.03
Distant metastasis
M0
M1
total

38
5
43

18/38 (47.4%)
5/5(100%)
p= 0.027

15/38(39.5%)
4/5(80.0%)
p=0.08

p=0.01

2/8(25.0%)
6/19(31.6%)
11/16(68.8)
p=0.04
Histopathology type
Ductal
Lobular
mucous

29
8
6
43

16/29 (55.2%)
3/8(37.5%)
4/6((66.7%)
p=0.52

16/29(55.2%)
2/8(25.0%)
1/6(16.7%)
p=0.1
CA15-3 (32 U/ml)
≤ 32
>32

33

Dilution ratios 10/100/1.000/10.000 put into the reaction tube. Figure 3.6: Real-time PCR hMAM cDNA was determined the
detection level in BT474 cell lines
Reviewers: Calibration was made by measuring CP at 5 tube
Figure 3.5: Realtime PCR hMAM
cDNA for determine baseline in
BT474 cell lines

16

reaction. 1x tube hMAM cDNA was generated from 20.000 BT474 cells,
equivalent to 105 copies. At a dilution of 100 times, the equivalent of
200 breast cancer cells are detected, the CP is 33.14 and copy number is
893.
 Calibration and detection threshold surviving mRNA from
MCF7 breast cancer cells line

Figure 3.7: Real-time PCR surviving cDNA was determined the
detection level in MCF7 cell lines
Reviewers: Based on calculation software has identified copy number
amplification of the reaction tube, diluted at 100 times, equivalent to 200
cells was minimum threshold detection transcription survivin cDNA,
that is 26.14 Cp, the equivalent 1.08E4 copie.
Table 3.5: The level hMAM mRNA, survivin mRNA copies in breast
cancer tissue and fibrosis tissue
copy numbers n
hMAM mRNA
(

patient n Mean Rank Sum of Ranks
breast cancer 43 39.33 1691.00
breast fibrosis

21 18.52 389.00
Total 64 p<0,001
Reviewers: hMAM mRNA transcription in breast cancer tissue more
than breast fibrosis tissue significantly statistics (p<0.01). Survivin
mRNA transcription in breast cancer tissue more than breast fibrosis
tissue significantly statistics (p<0.01) .
3.3.3. Comparison copy numbers hMAM mRNA, survivin mRNA in
breast cancer tissue and breast cancer blood.
Table 3.7: Comparison copies number of hMAM mRNA in breast
cancer tissue and breast cancer blood

Survivin
mRNA copies in tissue -
Survivin mRNA copies in blood

hMAM
mRNA copies in tissue-
hMAM mRNA copies in blood

n Mean Rank
Sum of
Ranks
n
Mean Rank
Sum of
Ranks

3.3.4. Progression transcription hMAM mRNA, survivin mRNA
follow disease staged Figure 3.8 Progression transcription hMAM mRNA, survivin mRNA
in blood, tissue of breast cancer patients according to the the disease
stage
Reviewers: There are 4 breast cancer stages, in 2e stage the
copies hMAM and survivin are the biggest then descending in 3e and 4e
stages. There are similarities in the increase in the tissue and the blood.
CHAPTER 4: DISCUSSION
4.1. Construction procedures to detect copy hMAM gene and
survivin gene in breast cancer cell lines
The cell line is considered as the backbone for the study of cancer.
On electrophoresis results Figure 3.1, KPL4 cell line, MCF7, BT474
positive prime hMAM R/F, around 202bp size, MDA-MB231 cell lines
19

did not show the product. PCR products with primers positioned survivin
showed MDA-MB231, MCF7, KPL4 is clear band about 170 bp in size,
this size should survivin gene amplification. Thus survivin gene is also
reproduced in three quarters of breast cancer cell lines studied. Confirm
sequencing PCR products were cloned using primers hMAM and
survivin. From chromas sequencing results compared with the design of
the genome and comparison with gene sequences were published in gene
banks using BLAST or FASTA software. Results of nucleotide
sequencing of PCR products demonstrated after using primers hMAM
F/R and survivin F/R is highly homologous genes with the published
gene bank
4.2. RT-PCR detection hMAM mRNA, survivin mRNA transcription