BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN CÔNG TRƯỜNG
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 4-
AMINO-4H-1,2,4-TRIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN CÔNG TRƯỜNG
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH
SINH HỌC MỘT SỐ DẪN CHẤT 4-
AMINO-4H-1,2,4-TRIAZOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
suốt thời gian thực hiện khóa luận!
Hà Nội, ngày 6/6/2013
Sinh viên
Nguyễn Công Trường MỤC LỤC Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ CÁI VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chương 1 TỔNG QUAN
1.1.Tác dụng sinh học của các dẫn chất Triazol 1
1.1.1.Tác dụng kháng khuẩn 1
1.1.2.Tác dụng kháng nấm 3
1.1.3.Tác dụng kháng tế bào ung thư 7
3.1.2.2. Tổng hợp 4-(4’-fluoro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (III) 29
3.1.2.3. Tổng hợp 4-(4’-cloro-benzyliden amino)
-4H-1,2,4-triazol (IV) 30
3.1.2.4. Tổng hợp 4-(3’-nitro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (V) 31
3.1.2.5. Tổng hợp 4-(2’-hydroxy-benzyliden amino)
-4H-1,2,4-triazol (VI) 32
3.1.2.6. Tổng hợp 4-(4’-nitro-benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (VII) 32
3.1.2.7. Tổng hợp 4-(benzyliden amino)-4H-1,2,4-triazol (VIII) 34
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc 35
3.2.1. Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được 35
3.2.2. Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được 36
3.2.2.1. Phân tích phổ hồng ngoại IR 36
3.2.2.2. Phân tích phổ khối lượng MS 37
3.2.2.3. Phân tích phổ cộng hưởng từ proton
1
H-NMR và phổ cộng hưởng từ
hạt nhân
13
C-NMR 38
3.3. Thử tác dụng sinh học 39
3.3.1. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người 39
3.3.2. Thử tác dụng kháng nấm 39
3.4. Bàn luận 40
3.4.1. Về tổng hợp hóa học 40
3.4.2. Về xác định cấu trúc 41
3.4.2.1. Về phổ hồng ngoại (IR) 42
3.4.2.2. Về phổ khối lượng (MS) 43
3.4.2.3. Về phổ cộng hưởng từ proton (
1
H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt
MIC: Nồng độ ức chế tối thiểu
MS : Phổ khối lượng
NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(nuclear magnetic resonance spectroscopy)
OVCAR-8 : Tế bào ung thư buồng trứng
PTL : Phân tử lượng (khối lượng phân tử)
SKLM: Sắc ký lớp mỏng
VSV : Vi sinh vật
UV : Phổ tử ngoại ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ xa xưa đến nay thuốc luôn chiếm một vị trí quan trọng trong vấn đề
chăm sóc sức khỏe con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật
và công nghệ, bên cạnh các thuốc có nguồn gốc thiên nhiên và vi sinh, thuốc
có nguồn gốc tổng hợp hóa dược ngày càng đóng một vai trò quan trọng và
chiếm một lượng lớn trong tổng số các thuốc được sử dụng.
Trong lĩnh vực tổng hợp thuốc, để nhanh chóng tạo ra được các thuốc
mới, các nhà nghiên cứu thường dựa trên cấu trúc của các chất đang được sử
dụng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng dược lý có và triển vọng cao để tạo
ra các chất mới dự đoán có tác dụng tốt hơn, ít độc hơn và có hiệu quả hơn
trong điều trị.
Trong những năm gần đây, triazol và các dẫn chất là một dãy chất hữu cơ
đã được nghiên cứu một cách có hệ thống về mặt hóa học cũng như tác dụng
Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất triazol đã được nhiều nhà khoa
học quan tâm nghiên cứu.
Đầu tiên, phải kể đến công bố của B.M. Volynskii cùng các cộng sự [17]
vào năm 1971, đã phát hiện 2 dẫn chất của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với 5-
nitro-furfural có tác dụng kháng khuẩn là furazonal và furacylin:
N
N
N
N
C
H
O
N
O
2
F
u
r
a
z
o
n
a
l
N
N
N
N
C
H
H
2
2
Các dẫn chất của 4-amino-3H-1,2,3-triazol cũng có tác dụng sinh học
như kháng khuẩn, kháng nấm. Kết quả này được P. L. Perrarinl [17] phát hiện
năm 1975 và năm 1978 đó là các chất:
N
N
NH
R
H
N
N
N
C
H
3
R
:
C
6
H
5
,
O
Năm 1994, F. Ozkanli và cộng sự [36] đã phát hiện một số dẫn chất của
1-H-1,2,4-triazol acetamid có tác dụng kháng khuẩn khá mạnh đối với các
chủng vi khuẩn: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Escherichia coli và một số vi nấm: C.albicans, C.parapsilosis, C.pseudotro-
picalis và C.stellatoided.
Tác dụng kháng khuẩn của các dẫn chất 3-[4H-(1,2,4)-triazolyl]-2-aryl-
1,3-thiazolidin-4-on cũng đã được H. S. Patel công bố trong nghiên cứu năm
2008 [37].
Theo đó các dẫn chất tổng hợp được thử nghiệm trên 2 chủng vi khuẩn
Gr(+) (B.subtilis, S.aureus) và 3 chủng vi khuẩn Gram (-) (K.promioe, S.typhi
và E.coli). Kết quả cho thấy một số chất thử nghiệm thể hiện hoạt tính kháng
khuẩn tốt hơn chất đối chứng tetracyclin.
N
N
N
C
SC
N
H
R
O
Năm 2009, A. Demirbas và các cộng sự [20] đã tổng hợp và thử tác dụng
kháng khuẩn của các dẫn chất 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol.
Kết thúc công trình nghiên cứu này, các tác giả đã chỉ ra rằng các dẫn
chất của 1,3,4-thiadiazol-2-ylmethyl-1,2,4-triazol có tác dụng rất tốt trên các
vi khuẩn như: Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas
aeruginosa, Enterococcus, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus.
R
:
N
OThêm vào đó, cũng vào năm 2009, D. Neslihan và cộng sự [21] đã tổng
hợp 1,2,4-triazol base manich và base Schiff của chất này, thử hoạt tính sinh
học của các chất tổng hợp được trên một số chủng vi khuẩn.
N
N
N
N
S
C
H
2
C
O
N
H
N
C
HR
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy các dẫn chất 1,2,4-triazol tổng hợp
được có tác dụng kháng các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Yersinia
pseudotuberculosis, pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis,
staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Candida tropicalis.
Để góp phần tìm kiếm thêm các hoạt chất có tính kháng khuẩn cao và
C
O
H
C
H
2
F
F
N
N
N
C
H
2
N
N
N
Nhiễm nấm do
Crypyococcus và
Aspergillus.
2
Itraconazol
N
N
N
C
H
2
C
O
H
C
H
C
H
3
N
N
F
F
F
N
N
N
C
H
2
Nhiễm nấm do
Crypyococcus và
Aspergillus
4
Posaconazol
N
N
N
H
2
O
N N
N
NN
O
C
H
C
H
3
C
H
2
C
H
3
Nhiếm nấm do
Cryptococcus và
Aspegillus
5
Năm 1979, 16 dẫn chất 1H-1,2,4-triazol được Ran Heeres và các cộng sự
[28] tổng hợp và thử tác dụng chống nấm.
N
N
N
H
2
C
X
R
C
H
2
Trong đó R là các dẫn chất chứa vòng thơm như naphthyl, biphenylyl, 5-
chloro-pyrid-2-yl hoặc nhóm phenyl có các vị trí được thay thế bởi F, Cl, I,
CF
3
, hoặc C
1
-C
4
alkoxy và X có thể là F, Br, Cl hoặc OH. Kết quả cho thấy
hầu hết các chất các tác giả tổng hợp được đều có tác dụng ức chế Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergilus fumigatus, Coccidioides,
Paracoccidioides, Histoplasma, Blastomyces.
Kết quả của nghiên cứu trên đã góp phần tìm ra dẫn chất fluconazol, hoạt
chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị nấm Crypyococcus và
Aspergillus.
6
N
N
N
R
1
4
a
l
k
y
l
R
2
:
H
,
C
1
-
C
4
a
l
k
y
l
R
3
:
H
Al
C
l
3
N
H
N
N
NE
t
3
,
E
t
O
A
c
F
F
N
N
N
O
F
F
N
N
N
O
l
Năm 1991, 1994, 1998, Stephen J. Ray và cộng sự [45], [46], [47] đã
tổng hợp và công bố tác dụng kháng nấm của một loạt dẫn chất 1H-1,2,4-
triazol.
Từ kết quả của những công bố này các tác giả đã tiếp tục sàng lọc, thử
tác dụng sinh học và độc tính, cuối cùng đã lựa chọn được voriconazol đưa
vào sử dụng trong điều trị nấm Candida abicans, Crypotococcus neoformans,
Aspergillus furmigatus (công thức cấu tạo của voriconazol xem bảng 1.1).
Năm 2001, Toshiyuki Konosu và cộng sự [30] đã tổng hợp các dẫn chất
dioxin-triazol và tiến hành thử tác dụng chống nấm của các chất tổng hợp
được. Hầu hết các dẫn chất này có tác dụng kháng nấm cao với MIC ≤1µg/ml.
C
C
H
H
O
O
H
H
C
C
H
1
1
,
,
2
2
,
,
3
3
7
N
N
N
H
N
S
C
H
2
C
O
H
N
R
Sau những nghiên cứu trên, vào năm 2008, S. Emami và cộng sự [22] đã
B
r
R
:
C
H
3
O
,
C
l
Năm 2009, R.R. Soman và cộng sự [33] đã tiến hành thêm một nghiên
cứu tổng hợp và thử tác dụng chống nấm của một số chất thuộc nhóm các dẫn
chất 1,2,4-triazol. Với R là các aryl, các chất tổng hợp được đều có tác dụng chống nấm C.
albicans và A.niger tại các nồng độ 50µg/ml và 100µg/ml.
Có thể thấy rằng: các azol đã bổ sung một lượng lớn vào danh mục các
thuốc chống nấm vì có độc tính thấp hơn amphotericin B, có tác dụng trên
nhiều loại nấm khác nhau và có các tính chất dược động học ưu việt.
Cơ chế tác dụng [2], [18], [24]: Các thuốc chống nấm azole đều hoạt
động theo cơ chế tác dụng chung là ức chế enzym cytocrom P
450
của nấm, các
enzym này cần thiết để demethyl hóa các 14-α-methylsterol thành ergosterol.
Ergosterol là sterol chủ yếu của màng tế bào nấm, khi ergosterol không được
eostrogen dương tính
.
2
Letrozol
C
N
N
N
N
N
C
Tiền phẫu thuật và trị liệu
trong ung thư vú di căn ở
nữ giới đã mãn kinh nhưng
vẫn đáp ứng với receptor
eostrogen hoặc progesteron
dương tính.
Guanazol có CTCT như sau:N
N
H
N
H
2
Để chứng minh tác dụng kháng tế bào ung thư của các dẫn chất triazol,
đầu tiên phải kể đến công bố của M. A. Hahn, R . H. Adanson vào năm 1972
[17] về guanazol (3,5-diamino-1H-1,2,4-triazol) có tác dụng kháng tế bào ung
thư. Hoạt chất này hiện nay đang được sử dụng trong điều trị bệnh tăng bạch
cầu.
Năm 1990, Phillip. N. Edward và Michael. S. Large [39] đã tổng hợp và thử
tác dụng sinh học ức chế enzym acromastase ứng dụng trong điều trị ung thư
vú của một số dẫn chất 1H-1,2,4-triazol.
9 Kết quả cho thấy các chất thử nghiệm có tác dụng ở nồng độ ≤ 10mg/ml.
Trong số các chất này đáng chú ý có hợp chất anastrozol, hiện nay đang được
sử dụng trong điều trị bệnh ung thư vú ở nữ giới.
Anastrozol được tổng hợp theo sơ đồ sau:
B
r
B
r
K
C
N
,
n-
M
e
I
,
DM
F
N
a
H
,
2
h
N
C
C
N
N
C
C
N
B
r
(
P
h
C
O
)
h
N
N
N
(
A
n
as
t
r
o
z
o
l
)
Nối tiếp những thành quả nghiên cứu trên, cũng vào năm 1990, các nhà
khoa học Robert M. Bowman và cộng sự [41] đã tổng hợp và thử tác dụng
kháng enzym acromastase của một số dẫn chất 1,2,4-triazol.
N N
N
C
R
1
R
2
C
N
Nghiên cứu này góp phần tìm ra dẫn chất letrozol, là một thuốc hiện nay
15
h
t
-
B
u
O
K
,
DMF
N
C
F
C
N
N
N
N
N
C
L
e
t
r
o
z
o
l
H
3
13 25 13
N
N
P
h
N
N
N
P
h
S
R
H
3
C
O
R:
C
H
C
H
2
C
H
2
O
H
:
Một nghiên cứu khác vào năm 2010 của Paul .A.M. Wood và cộng sự
[38] đã tổng hợp và thử tác dụng ức chế acromatase- sulfatase của một số dẫn
chất
4-amino-4H-1,2,4-triazol. Kết quả một số chất thể hiện hoạt tính ức chế
acromatase và sulfatase ở mức độ nanomol. Các dẫn chất 4-amino-4H-1,2,4-
triazol này làm phong phú thêm số lượng các dẫn chất triazol có tác dụng
chống ung thư.
N
N
N
N
C
N
Mười sáu dẫn chất của triazol, năm 2012, đã được nhóm nghiên cứu của
Eman M. Flefel [23] và cộng sự tổng hợp thử tác dụng sinh học kháng vi sinh
vật, kháng ung thư, kết quả cho thấy 5 dẫn chất được tổng hợp có tác dụng
chống khối u tử cung và tế bào ung thư vú với IC
50
(2,72-5,85µg/ml). Một nghiên cứu khác năm 2012 của G.C. Ramaprasad [40] đã thu được
kết quả đáng quan tâm khi thử hoạt tính của một số dẫn chất 1,2,4-triazol trên
các dòng tế bào ung thư HT29, K293, MDA231. Kết quả thu được:
H
H
O
Ribavirin là một nucleosid kháng virus phổ rộng, chống virus cúm B khá
mạnh, kháng virus hợp bào đường hô hấp (RSV), nó cũng có một số tác dụng
với các loại virus khác như: herpes, thủy đậu, viêm gan, sởi.
• Tác dụng khác:
Ngoài các tác dụng đáng kể trên người ta còn thấy các dẫn chất triazol
còn có một số tác dụng có thể ứng dụng trong điều trị như tác dụng chống sốt
rét, chống trầm cảm. Sau đây là một số chất đã được công bố công bố [11],
[17]. 12
H
COO
H
+
NH
2
NH
2
.
H
2
O
H
CO
NHNH
C, đây là phương pháp khá đơn giản và thuận lợi. Về sau
nhiều nhà tổng hợp hữu cơ đã nghiên cứu sâu hơn về phương pháp tổng hợp
4-amino-4H-1,2,4-triazol.
E.C. Horning [26] đã thực hiện phản ứng này qua 2 giai đoạn từ
ethylformiat và hydrazin hydrat, các phản ứng diễn ra như sau:
H
C
O
OC
2
H
5
+ NH
2
NH
2
.
H
2
O
H
CO
N
H
2
N
t
0
E
t
O
H
,
t
0
c
M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42] đã thực hiện phản ứng tổng hợp 4-
amino-4H-1,2,4-triazol từ acid formic và hydrazin hydrat. Phản ứng xảy ra
theo hai giai đoạn nhưng thực hiện liên tiếp trong 1 quá trình: Thông qua các phương pháp trên, chúng tôi nhận thấy để tổng hợp 4-
amino-4H-1,2,4-triazol có thể tiến hành theo hai phương pháp bao gồm
N
N
H
N
H
2
N
C
A
r
C
H
O +
NH
2
A
r
1
A
r
C
H
N
A
r
1
+
H
2
O
Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân (A
N
) vào nhóm carbonyl của aldehyd
thơm và đồng thời tách loại một phân tử nước, tác nhân ái nhân là H
A
r
1
H
H
:
C
O
H
A
r
H
N
A
r
1
H
Giai đoạn 2: Phản ứng tách loại một phân tử nước theo cơ chế tách loại
E
1
.
Cơ chế như sau:
C
O
H
A
r
H
N A
-
H
+
C
A
r
N A
r
1
H
Như vậy khả năng và tốc độ của phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu
tố:
14
Ο
O
δ
+
δ
−
+ Sự phân cực của liên kết đôi carbonyl (C=O) của aldehyd (-CHO). Các
nhóm thế hút điện tử (có hiệu ứng -M, -I) làm tăng tốc độ phản ứng vì làm
tăng sự phân cực liên kết C=O.
+ Tính ái nhân của phân tử amin. Các amin có tính base càng lớn thì tốc
độ phản ứng càng tăng.
• Phản ứng không cần xúc tác.
Phản ứng của các hợp chất carbonyl rất hoạt động và các nucleophin
cũng rất hoạt động thì phản ứng không cần xúc tác acid hay base. Cơ chế
O
H
C
A
r
H
O
H
NH
2
A
r
1
+
C
O
H
A
r
H
N
A
r
1
H
H
C
O
H
A
Nhưng khi dùng tác nhân ái nhân có khả năng bị proton hóa như amin thì pH
15
để phản ứng có vận tốc cực đại phụ thuộc vào bản chất nhóm carbonyl và
nucleophin. Khi đó có thể tồn tại 2 cân bằng sau:
N
H
2
A
r
1
+
H
N
H
3
A
r
1
C
A
r
H
O
C
A
r
H
O
H
1.3.2. Tổng hợp các dẫn chất azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol
Nhiều nhà nghiên cứu trong nước và nước ngoài đã đi sâu nghiên cứu
phương pháp tổng hợp các azomethin của 4-amino-4H-1,2,4-triazol.
• Nước ngoài
S. Ruhemann [43] đã thực hiện phản ứng tổng hợp hợp các azomethin
của 4-amino-4H-1,2,4-triazol với các aldehyd thơm trong dung môi EtOH ở
nhiệt độ phòng với xúc tác piperidin:
C
H
O
A
r
+
N
N
N
H
2
N
N
N
N
N
H
C
A
r
Pi
p
e
M.V. Rubtsov; A.G. Baichikov [42] đã thực hiện phản ứng tổng hợp chế
phẩm furazonal trong môi trường nước ở 15
o
C với sự có mặt của acid
sulfuric. Phản ứng xảy ra qua 2 giai đoạn sau:
- Thủy phân 5-nitrofurfuraldiacetat với xúc tác acid sulfuric để tạo 5-
nitrofurfural.
- Ngưng tụ 5- nitrofurfural với 4-amino-4H-1,2,4-triazol trong môi trường
nước với xúc tác sulfuric, ở nhiệt độ 15
o
C.
• Tại
Việt Nam
Năm 1983 Nguyễn Văn Yên, Nguyễn Quang Đạt [13] thực hiện phản
ứng tổng hợp các azomethin giữa 4-amino-4H-1,2,4-triazol và các aldehyd
thơm, Isatin trong dung môi EtOH, trong các điều kiện thử nghiệm ở nhiệt độ
phòng và đun cách thủy với xúc tác là piperidin. Kết quả cho thấy khi tiến
C
A
r
+
N
N
N
H
O
O
2
N
C
H
(
OCOC
H
3
)
2
H
2
O
H
2
SO
4
O
O
2
N
C
H
O
+
2
C
SO
4
15
0
C
Copyright: Tài liệu đại học ©