Bộ YTẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI
PHẠM THỊ HOA
TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC
• • •
CỦA INDIRUBIN VÀ DẪN CHẤT
KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Hải Nam
2. DS. Nghiêm Thị Minh
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hoá dược
\CL
HÀ NỘI - 2010
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến: TS.
Nguyễn Hải Nam, DS. Nghiêm Thị Minh, DS. Trần Phương Thảo - Bộ môn
Hoả Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thày đã trực tiếp
hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho tôi trong quà trình thực hiện và hoàn thành
khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xỉn chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thày, các cô, các em kỹ
thuật viên Bộ môn Hoá Dược đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoả
luận này.
Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ
rất nhiệt tình của các cán bộ Phòng Thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học
Dược Hà Nội; Phòng Sinh học - Viện Hoả học các hợp chất tự nhiên; Phòng
Phân tích phổ - Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
cùng toàn thể các thày cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện. Tôi
xin chân thành cảm ơn.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đĩnh và bạn bè - những người
luôn sát cánh, động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập.
3.1.1. Tổng hợp hoá học 13
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 17
3.1.3. Xác định cấu trúc 19
3.2. Thử tác dụng sinh học
26
3.2.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 26
3.2.2. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người
30
3.3. Bàn luận 33
3.3.1. Tổng họp hoá học và xác định cấu trúc 33
3.3.2. Tác dụng sinh học 35
KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1. Một số phương pháp tổng họp indirubin. 7
Bảng 2 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của indirubin và dẫn chất 17
Bảng 3: Giá trị Rf với hệ dung môi khai triển n-hexan/aceton (2:1) và 18
t°nc của 6 chất I-VI
Bảng 4; số liệu phân tích phổ IR (em'*) 20
Bảng 5: số liệu phổ EI-MS của 6 chất tổng hợp được 22
Bảng 6: số liệu p h â n tích phổ *H-NMR 25
Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 29
Bảng 8 : Kết quả thử độc tính tế bào của các chất I, II, IV 32
DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ
Trang
Sơ đồ 1 : Tổng họp indirubin theo phương pháp Baeyer 5
Mass Spectrometry
(Phổ khối lượng)
Khối lượng phân tử
Tế bào ung thư vú đã di căn của người
Deoxypodophyllotoxin
(Chất chuẩn dương tính)
Minimal Inhibitory Concentration
(Nồng độ ức chế tối thiểu)
Vi sinh vật
Sắc ký lóp mỏng
ĐẶT VẤN ĐỂ
Khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người
càng trở nên phức tạp và nhu cầu chăm sóc sức khoẻ cũng ngày càng tăng lên.
Nếu đơn thuần chỉ dựa vào những thuốc lâu đời có nguồn gốc từ dược liệu
hay tổng họp vi sinh thì chưa đủ để đáp ứng được nhu cầu đó. Ngày nay, việc
nghiên cứu tìm ra thuốc mới và đưa vào sử dụng trên lâm sàng là thành tựu
của nhiều ngành khoa học như bào chế, hoá dược, vi sinh, dược lâm
sàng trong đó tổng hợp hoá dược đóng vai trò rất quan trọng. Được hình
thành và phát triển trên cơ sở kĩ thuật tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hoá dược đã
trở thành một ngành khoa học chuyên biệt chuyên nghiên cứu tìm ra các loại
thuốc mới phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh cho con người. Các thuốc
có nguồn gốc tổng hợp hoá dược đóng vai trò không thể thiếu trong cuộc sống
và chiếm một số lượng rất lớn.
Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể
ứng dụng trong điều trị, các nhà tổng hợp hoá dược thường dựa vào cấu trúc
của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học
triển vọng để tổng họp hoặc bán tổng họp tạo ra nhiều thuốc mới.
Một số công trình nghiên cứu cho thấy indirubin và các dẫn chất có tác
dụng sinh học rất đáng quan tâm như; kháng các dòng tế bào gây bệnh ung
thư ở người, kháng nấm, kháng khuẩn
dependent kinase) [9,13] - enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình
phân chia của chu kỳ tế bào qua liên kết tạo phức với các cyclin [19]. (Các
cyclin là một họ các protein kiểm soát sự phát triển của tế bào trong chu kỳ tế
bào). Ngoài ra các CDK còn điều khiển các quá trình sao mã.
Năm 1999, Leclerc và cộng sự khám phá ra tác dụng ức chế GSK-3
(glycogen synthase kinase 3) của dẫn xuất indirubin. Đồng thời, khi nghiên
cứu độc lập, Meijer và cộng sự cũng phát hiện hoạt tính này ở các dẫn xuất
thế indirubin. (GSK-3 là một loại protein kinase của serin/threonin phổ biến
trong não, tham gia vào quá trình điều chỉnh lượng glycogen nhờ vai trò của
insulin [5] và liên quan tới một số quá trình sinh học khác như quá trình phát
triển của tế bào sống và của mô tế bào. Các GSK giữ vai trò thiết yếu đối với
enzym trong sự chuyển hoá glycogen và điều khiển nhiều hoạt động khác
nhau của té bào.
Năm 2001, Adachi và các cộng sự đã phát hiện ra hoạt tính AhR (aryl
hydrocacbon receptor) ở indirubin. AhR là một phối tử bHLB/PAS - tác nhân
chứa nhân tố phiên mã, điều khiển các gen khác nhau [20]. AhR có thể liên
kết và hoạt hoá nhiều quá trình hoá học khác nhau. AhR là đích để phát triển
các phối tử trong hoá trị liệu và một vài dạng của tế bào ung thư như tế bào
ung thư vú MCF-7.
Năm 2005, Nam và các cộng sự phát hiện thấy các hoạt tính Src tyrosin
kinase và Stat3 (signal transducer and activator of transctiption 3) [20].
Protein Stat (signal transducer and activator of transctiption-tin hiệu chuyển
đổi và hoạt hoá trong quá trình phiên mã) có vai trò quan trọng đối với sự
phát triển của các tế bào khối u [20]. Stat3-họp phần của họ stat, là nhân tố có
vai trò quan trọng trong sự chuyển pha Gl-S của chu kỳ tế bào, thúc đẩy quá
trình phân bào và phát triển của tế bào [21]. Protein Stat3 có vai trò đặc biệt
đối với sự phát sinh, phát triển bệnh ung thư, hoạt tính này sẽ trở thành một
liệu pháp nhắm trúng đích khi điều trị bệnh ung thư. Hiện nay, khoảng 30%
lượng thuốc trong công nghiệp dược phẩm nhằm tới đích là các protein
kinase [4]
trong dung môi H2O2 30%. Vào năm 1931, Spencer cải tiến phương pháp của
Vorländer bằng cách thay H2O2 bằng FeCls [14].
Từ đó đến năm 1966, đã có rất nhiều cải tiến trong phương pháp tổng
hợp indirubin. Tuy nhiên phương pháp của Baeyer được Rusell và Kaupp cải
tiến bằng cách thay indoxyl bằng indoxylacetat, thay dung môi C2H5OH bằng
dung môi C H 3 O H [14]. Phương pháp cải tiến này cho hiệu suất đối với các
dẫn xuất thế của indirubin có thể đạt được từ 25-98% [12]. Hiện nay phương
pháp này đang được sử dụng rộng rãi để tổng hợp indirubin và dẫn chất.
CH,OH
NazCOj
o
Indoxylacetat Isatin Indirubin
Sơ đồ 2: Tổng họp indirubin theo phương pháp Rusell và Kaupp
Bảng 1. Một số phương pháp tổng hợp indirubin.
Chất tham gia phản ứng
Môi trường/
Xúc tác
TP L ^ ?
Tác giả
Indoxyl
C2H5OH
NajCOs
Baeyer
1881
Isatin
2-clo-3H-indol-3-on
- Pyridin
- Toluen
Oxidol
- Wahl và
Ov
7 ^
- CH3OH
Rusell và
>
%
- NaaCOs
Kaupp, 1969
H
ơ
H
Indoxylaceta
Isatin
1.2.1. Tổng hợp một số dẫn chất isatin:
Các phản ứng thế ái điện tử vào nhân benzen của isatin thường xảy ra ở
vị trí 5 hoặc 7, các phản ứng thường gặp như thế brom, nitro [6]
Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin theo sơ đồ sau:
Ọ
Br9/H7 0 ,HC1
Isatin 5-bromoisatin
Sơ đồ 3: Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin
Các dẫn chất với các nhóm thể khác của isatin như: 5-cloro, 5-fluoro, 7-
cloroi satin được tổng hợp từ các anilin tương ứng và cloralhydrat theo
phương pháp Sandmeyer công bố năm 1919 [17].
NH, - H.
+ Cl3CCH(OH)2 + NH2OH.HCI
H
NOH
H
2
2.1.1. Nguyên vật liệu:
a) Hóa chất chính:
- 3-indoxyl acetat
- isatin
- các dẫn chất isatin:
+ 5-bromoisatin
+ 5-cloroisatin
+ 7-cloroisatin
+ 5-fluoroisatin
+ 5-methoxyisatin
b) Dung môi và các hóa chất khác:
- Methanol - Aceton
- Dimethylformamid - Dicloromethan (DCM)
- n - h e x a n - N a t r i c a r b o n a t ( N a a C O s )
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
- Bình cầu đáy tròn dung tích 50ml có nút mài, máy khuấy từ gia nhiệt,
sinh hàn hồi lưu, máy cất quay chân không, tủ lạnh, tủ sấy, pipet, bình chiết,
11
phễu thủy tinh, giấy lọc, cân phân tích, cân kỹ thuật, bình chạy sắc ký lớp
mỏng (SKLM), cột sắc ký.
- SKLM tiến hành trên bản mỏng silicagel Merck 70-230 mesh.
- Nhiệt độ nóng chảy (t°„c) được xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng
chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
- Phổ hồng ngoại (IR) được ghi trên máy Perkin Elmer, sử dụng kỹ
thuật viên nén KBr, ghi ở vùng 4000-500 em'' tại phòng thí nghiệm trung tâm
trường Đại học Dược Hà Nội.
- Phổ khối lượng (MS) được ghi bằng máy khối phổ HP 5989B-MS của
Viện hóa học Việt Nam.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được ghi bằng máy Bruker AV-
500, dùng CDCI3 làm dung môi. Độ chuyển dịch hóa học (ô) được biểu thị
Sau khi tham khảo các tài liệu và dựa vào điều kiện thí nghiệm, các hóa
chất cho phép, chúng tôi đã tiến hành tổng hợp dẫn chất của indirubin dựa
trên cơ sở phản ứng ngưng tụ giữa 3-indoxyl acetat với các dẫn chất isatin
khác nhau. Sơ đồ phản ứng chung tạo các chất từ I đến VI như sau:
R
H
=0 +
Ọ C O C H 3
NasCOs
MeOH
R
4’
0
7'
H // '
0
d/c indirubin
d/c isatin 3-indoxylacetat
Sơ đồ 6: Tổng họp các dẫn chất của indirubin.
Trong đó:
I
II
III
R = H
R = 5-Br
R = 5-Cl
IV R = 7-Cl
V R=5-F
VI R= 5-OCH3
Dưới đây là các phản ứng cụ thể tổng họp các dẫn chất từ I đến VI.
N
- 0 +
H
MeOH
5-bromoisatin
3-indoxylacetat
15
Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất I, nhưng với các hóa chất
là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,678g (3 mmol) 5-bromoisatin thu
được 0,9519g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hĩnh ìdm, màu nâu tím.
T^nc > 260°c. Hiệu suất phản ứng: 93%. IR (KBr, cm'^): bảng 3 (trang 20); EI-
MS (70 eV, m/z): 342 (M^). ^HNMR (DMSO-dẻ): ỏ [ppm]: bảng 5 (trang 25).
3.1.1.3. Tổng hợp 5-cloroindirubin (III)
o +
OCOCH3
\ NasCOạ
MeOH
5-cloroisatin
3-inđoxylacetat 5-cloroindirubin
Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất /, nhưng với các hóa chất
là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,543g (3 mmol) 5-cloroisatin thu được
0,7994g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hình Um, màu nâu tím. T^nc >
260°c. Hiệu suất phản ứng: 90%. IR (KBr, cm'^): bảng 4 (ừang 20); EI-MS (70
eV, m/z): 296 ‘HNMR (DMSO-dỹ): ô [ppm]: bảng 6 (trang 25).
3.1.1.4. Tống hợp 7-cloroindirubin (IV)
OCOCH3
N32C03
o +
C1
7-cloroisatin
MeOH
5-methoxyisatin
3-indoxylacetat
5-methoxyindirubin
17
Tiến hành thực hiện phản ứng tương tự chất I, nhưng với các hóa chất
là 0,525g (3 mmol) 3-indoxyl acetat và 0,53Ig (3 mmol) 5-methoxyisatin thu
được 0,7974g sản phẩm tinh khiết dưới dạng: tinh thể hình kim, màu nâu đậm.
'fnc > 260®c. Hiệu suất phản ứng: 91%. IR (KBr, cnĩ’): bảng 4 (trang 20); EI-
MS (70 eV, mJz): 292 (M^); 'HNMR (DMSO-dö): ỏ [ppm]\ bảng 6 (trang 25).
Như vậy, trong thời gian cho phép chúng tôi đã tổng hợp được 6 chất.
Công thức cấu tạo (CTCT), hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của các chất
tổng hợp được được tóm tắt trong bảng 2.
Bảng 2 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của indirubin và dẫn chất
0
R
A
\ 2'
\ >
■N
H
0
Chất R
CTPT KLPT
Màu
Hiệu suất (%)
I
H
C16ĨỈ10N2O2
262,07
Nâu đậm 91
3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Chúng tôi đã kiểm tra độ tinh khiết các chất tổng họp được bằng SKLM
và đo nhiệt độ nóng chảy (t°nc) của các chất.
- SKLM được tiến hành trên bản nhôm tráng sẵn silicagel Merck 70-
230 mesh, quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm. Dung môi hòa
18
tan: dimethylformamid. Dung môi triển khai: 6 chất đều được khảo sát với 3
hệ dung môi triển khai: n-hexan:aceton (2:1); n-hexan:aceton (3:1) và
DCMiMeOH (15:1). Kết quả thu được trên các sắc ký đồ đối với từng hệ
dung môi khai triển đều thấy một vết rõ, gọn khi soi dưới ánh sáng đèn tử
ngoại.
- Đo nhiệt độ nóng chảy: 6 chất (I-VĨ) sau khi được tinh chế bằng sắc
ký cột và kết tinh đều có dạng tinh thể rắn được đo nhiệt độ nóng chảy bằng
máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện (Electrothermal digital).
Nhiệt độ nóng chảy và giá trị Rf của các chất với hệ dung môi triển khai
n-hexan/aceton (2:1) được tóm tắt trong bảng 3.
Bảng 3: Giá trị Rf với hệ dung môi khai triển n-hexan/aceton (2:1) và t®nc
của 6 chất I-VI
Chất
CTCT
’■ " ĩ
Hệ dung môi
triển khai
Rf
t\c (V)
I
R = H
n-hexan:aceton (2
1)
và có khoảng dao động hẹp từ l-3°c. Như vậy, có thể kết luận các chất mà
chúng tôi tổng hợp được là tinh khiết.
Copyright: Tài liệu đại học ©