BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HỒNG ANH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP KHẢO
SÁT HÀM LƯỢNG AZITHROMYCIN
TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG

mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập và thực hiện khóa
luận tại trường.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn gia đình, bạn bè và những người luôn
động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực
hiện khóa luận này.
Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2014
Sinh viên
Lê Thị Hồng Anh

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1 TỔNG QUAN VỀ MACROLID 3
1.1.1 Cấu trúc 3
1.1.2 Đặc điểm lý hóa tính 5
1.1.3 Phổ tác dụng 5
1.2 TỔNG QUAN VỀ AZITHROMYCIN 6
1.2.1 Công thức cấu tạo 6
1.2.2 Tính chất 6
1.2.3 Dược động học 7
1.2.4 Cơ chế và tác dụng dược lý 7
1.2.5 Tác dụng không mong muốn 8
1.2.6 Chỉ định 8
1.2.7 Liều dùng và cách dùng 8
1.2.8 Dạng bào chế 8
1.2.9 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng AZI 9
1.3 QUANG PHỔ HUỲNH QUANG 10
1.3.1 Sự phát quang 10
3.3.2 Kết quả 39
3.4 BÀN LUẬN 40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
4.1 KẾT LUẬN 42
4.2 ĐỀ XUẤT 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AZI Azithromycin
KS Kháng sinh
UV Ultraviolet (tử ngoại)
LC-MS
Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid Chromatography-Mass

DANH MỤC BẢNG BIỂU
STT

Tên bảng biểu

Trang

1 Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm macrolid 4
2 Bảng 3.1: Cường độ huỳnh quang thu được khi thay đổi
nồng độ Ce(IV)
25
3 Bảng 3.2: Cường độ huỳnh quang thu được khi thay đổi
nồng độ acid H
2
SO
4
26
4 Bảng 3.3: Cường độ huỳnh quang thu được khi thay đổi
nhiệt độ phản ứng
28
5 Bảng 3.4: Cường độ huỳnh quang thu được khi thay đổi thời
gian phản ứng
30
6 Bảng 3.5: Kết quả xây dựng đường chuẩn 32
7 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 34
8 Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 35
10 Bảng 3.8: Cường độ huỳnh quang thu được trong ngày đầu
tiên
36
11 Bảng 3.9: Cường độ huỳnh quang thu được trong ngày thứ

5 Hình 3.2: Phổ thu được khi cố định λ
em
23
6 Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ Ce(IV) tới cường độ huỳnh
quang

25
7 Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ acid H
2
SO
4
tới cường độ
huỳnh quang

27
8 Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng tới cường độ
huỳnh quang
28
9 Hình 3.6: Ảnh hưởng của thời gian phản ứng tới cường độ
huỳnh quang.

30
10 Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của cường độ huỳnh
quang vào nồng độ chất chuẩn.
32

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trước đầu thế kỷ 20, các cách trị nhiễm trùng chủ yếu dựa trên các

quang phổ huỳnh quang.
* Thẩm định phương pháp xây dựng được.
* Ứng dụng phương pháp xây dựng được để định lượng azithromycin
trong một số mẫu thuốc lưu hành tại Hà Nội.

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ MACROLID [7]
1.1.1 Cấu trúc
Các Macrolid là những kháng sinh có cấu trúc heterosid mà phần genin
là một vòng lacton có chứa nhiều nguyên tử ( thường từ 12-17 hoặc nhiều hơn)
và được chia thành 2 nhóm chính: Nhóm kháng khuẩn và nhóm kháng nấm hay
còn gọi là các polyen.
Nhóm macrolid kháng khuẩn bao gồm các macrolid có cấu trúc vòng
lacton ( chứa từ 12-17 cấu tử - còn gọi là vòng esther) có chứa 1 hay nhiều
đường (deoxy sugar), ( thường là cladinose và desosamin).


Nhóm kháng nấm (cấu trúc polyen): Có tài liệu xếp nystatin và
amphotericin B vào nhóm kháng sinh đại lacton ( chứa 26-38 carbon) có tác
dụng chống nấm. Trong nhiều năm, amphotericin B là kháng sinh chống nấm
toàn thân có hiệu quả cao tuy có độc tính cao. Nystatin thường được sử dụng
để điều trị bệnh do Candida albicans ở da, niêm mạc ( miệng, đường tiêu hóa,
âm đạo) và không có tác dụng khi nhiễm nấm toàn thân vì không hấp thu qua
đường tiêu hóa.
Bảng 1.1: Một số kháng sinh nhóm macrolid
Tên Năm phát
hiện
Chủng sinh kháng sinh
Nhóm kháng khuẩn

Erythromycin 1952 Str.erythreus
Oleandomycin 1954 Str.antibioticus
Azithromycin 1980 Bán tổng hợp
5

Clarithromycin 197? Bán tổng hợp
Roxithromycin 1987 Bán tổng hợp
Spiramycin 1955 Str.ambefaciens
Leucomycin 1953 Str.kitasatoensis
Josamycin 1964 Streptomyces sp.
Tylosin 1961 Str.fradie
Terithromycin 1998 Bán tổng hợp
Nhóm kháng nấm

Nystatin 1955 Str.noursei
Amphotericin B 1957 Str.nodosus


38
H
72
N
2
O
12.

- Khối lượng phân tử: 748,98.
- Tên khoa học: 10-deoxo-11-methyl-11-azaerythromycinA.
1.2.2 Tính chất [5], [6]
* Tính chất vật lý:
- Dạng bột, màu trắng ( hoặc trắng ngà), không mùi, vị đắng.
- Không tan trong nước, dễ tan trong dung môi hữu cơ như: Ethanol,
metanol, aceton, diethyl ether, cloroform và dung dịch acid hydrocloric loãng.
- Năng suất quay cực là từ -45
0
tới -49
0
(dung dịch 20mg/ml ethanol).
7

* Tính chất hóa học:
- Tính base: Do các osamin (đường amin) gây ra, pKa=8,74.
- Tạo muối dễ tan trong nước với các acid vô cơ và hữu cơ.
- Phản ứng màu: Với các acid như HCl, H
2
SO
4.
1.2.3 Dược động học [5]

đường hô hấp dưới ( viêm phổi, viêm phế quản, các nhiễm khuẩn da và mô
mềm, viêm tai giữa), nhiễm khuẩn đường hô hấp trên (viêm xoang, viêm họng,
viêm amidan), nhiễm khuẩn đường sinh dục chưa biến chứng do Chlamydia
trachomatis, Neisseria gonorrhoeae…không đa kháng.
1.2.7 Liều dùng và cách dùng [5]
- Dùng 1 lần mỗi ngày, uống trước ăn 1 giờ hoặc sau ăn 2 giờ.
-Người lớn: Ngày đầu tiên uống 1 liều 500mg và dùng tiếp 4 ngày nữa
với liều dùng 250mg/ngày.
- Trẻ em: Liều gợi ý cho trẻ uống ngày đầu là 10mg/kg thể trọng, và 4
ngày tiếp theo là 5mg/kg thể trọng, mỗi ngày uống một lần.
1.2.8 Dạng bào chế [5]
- Viên nang AZI dihydrat tương đương AZI 250 mg và 500 mg.
- Bột pha hỗn dịch uống AZI dihydrat tương đương 200 mg AZI/5 ml,
lọ bột đông khô pha tiêm 500mg.
- Viên nén và viên nén bao phim tương đương AZI 125 mg, 250 mg, 500
mg; Viên nén phân tán tương đương AZI 100 mg.
9

1.2.9 Một số phương pháp nghiên cứu định lượng AZI
1.2.9.1 Kỹ thuật HPLC

Tài
liệu
Cột sắc ký Pha động Detector Tốc độ dòng
[4] Cột thép không
gỉ (250
x4.6mm ) nhồi
pha tĩnh B
(5µm)
Hỗn hợp

[12] Zorbax SB CN
(150x4,6mm;
5m)
Na
2
HPO
4
50mM-
NaH
2
PO
4
50mM
-MeCN-MeOH
pH 6,5-7,5
Điện hóa 1 ml/phút

1.2.9.2 Phương pháp vi sinh: [13]
Xác định hoạt lực của azithromycin trong dung dịch ophthalmic
(Azithromycin ophthalmic được sử dụng điều trị nhiễm trùng mắt do vi khuẩn).
Pha loãng dung dịch azithromycin ophthalmic bằng đệm kali phosphat
pH 8 tới nồng độ thích hợp. Định lượng trên môi trường thạch với chủng vi
khuẩn chỉ thị là Bacillus subtilis ATCC 9372.
10

1.3 QUANG PHỔ HUỲNH QUANG

1.3.1 Sự phát quang [2], [10]
Sự phát quang được chia thành 2 loại là huỳnh quang và lân quang. Khi
phân tử hấp thụ các bức xạ kích thích ( tử ngoại hoặc khả kiến) và chuyển từ

, alkyl, aryl,… làm tăng hiệu
suất huỳnh quang. Ngược lại những nhóm hút điện tử như: -NO
2
, -COOH, Cl
-
,
Br
-
,… lại làm giảm hiệu suất huỳnh quang.
1.3.2 Quang phổ huỳnh quang [3]
Phổ huỳnh quang là phương pháp phổ phát xạ phân tử. Sau khi hấp thụ
năng lượng của bức xạ tử ngoại, khả kiến hoặc các bức xạ điện từ khác ( bức
xạ kích thích), phân tử bị kích thích sẽ trở lại trạng thái cơ bản và giải phóng
năng lượng dưới dạng bức xạ, được gọi là bức xạ huỳnh quang.
Cường độ huỳnh quang F của một dung dịch pha loãng tỉ lệ thuận với
nồng độ C (mol/l) của chất phát quang trong điều kiện xác định khi cường độ
và bước sóng của bức xạ kích thích là hằng số.
F= K . I
0
.  . ∅. C . L
Ở đây:
12

K: Hằng số.
I
0
: Cường độ của bức xạ kích thích.
∅ : Hiệu suất huỳnh quang = Số photon phát xạ : Số photon hấp thụ.
(0 < ∅ <1)
: Hệ số hấp thụ mol của chất ở bước sóng kích thích.

* So sánh với dung dịch chuẩn
Xác định cường độ huỳnh quang của dung dịch thử, dung dịch chuẩn và
các mẫu trắng tương ứng của chúng.
Tính toán nồng độ của dung dịch thử:
C
X
= C
S
.
OSS
OX
II
II


X

Ở đây:
C
X
: Nồng độ của dung dịch thử.
C
S:
Nồng độ của dung dịch chuẩn.
I
X
: Trị số đo được của dung dịch thử.
I
S
: Trị số đo được của dung dịch chuẩn.

đường chuẩn với trục nồng độ là giá trị nồng độ của dung dịch cần định lượng.
* Một số kỹ thuật khác
- Kỹ thuật quét đồng bộ phổ huỳnh quang (Synchronus).
- Kỹ thuật phổ đạo hàm.
15

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Để xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng AZI, tôi thực hiện
nghiên cứu trên các đối tượng sau:
- Azithromycin chuẩn
- Chế phẩm chứa AZI trên thị trường: ( viên nang)
Tên chế
phẩm
Hàm
lượng
Công ty sản xuất Số đăng
ký
Số lô sản
xuất

- Thuốc thử, dung môi:
* Cồn tuyệt đối loại tinh khiết, Merck, Đức (HPLC).
* Acid sulfuric, Merck, Đức (HPLC).
* Ceri amoni sulphat bột, (M=404.3) Merck, Đức (HPLC).
* Nước cất 2 lần.
16

2.2.2 Thiết bị - dụng cụ
- Cân phân tích Sartorius ( Đức ) sai số 0.1 mg.
- Máy siêu âm Harvonic.
-Máy quang phổ huỳnh quang Cary Eclipse Fluorescence
Spectrophotometer, Agilent.
- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet, ống nghiệm, cốc có mỏ, phễu
thủy tinh, đũa thủy tinh,…
2.3 PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu
AZI là một chất không phát huỳnh quang do đó để tiến hành định lượng
AZI bằng phương pháp huỳnh quang, chúng tôi tiến hành làm phản ứng tạo
chất phát huỳnh quang. Cụ thể như sau: Dung dịch Ce(IV) phản ứng với AZI
tạo thành Ce(III), Ce(III) tạo thành cho huỳnh quang ở λ
ex
254nm và λ
em
374
nm:
Cơ chế oxy hóa của AZI với Ce
+4
: [16]
R1 R1
N R3 - 1e N