BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP VIỆN NĂM 2014 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI SINH VẬT CÓ KHẢ
NĂNG SINH PROTEIN G ỨNG DỤNG TRONG TÁCH CHIẾT IgG
LÀM NGUYÊN LIỆU CHẾ TẠO SINH PHẨM CHẨN ĐOÁN MIỄN
DỊCH HỌC BỆNH CHO VẬT NUÔI

MÃ SỐ: V2014 - 17
Thuộc nhóm ngành khoa học: Công nghệ Sinh học
Chủ nhiệm đề tài: Ths. Nguyễn Thị Thu Hiền
MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
3.1 Phương pháp vi sinh 22
3.1.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Streptococcus sp 22
3.1.2 Các phương pháp sinh hóa. 23
3.2. Phương pháp hóa sinh 25
3.2.1 Quy trình tách chiết, tinh sạch protein G từ vi khuẩn Streptococcus sp 25
3.2.2. Phương pháp thu nhận protein G thô từ Streptococus sp 26
3.2.3. Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Bradforfd 26
3.2.4. Phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G-50 27
3.2.5. Phương pháp SDS-PAGE 28
3.3. Phương pháp Elisa gián tiếp kiểm tra khả năng gắn kết kháng thể
động vật của Protein G 31
PHẦN II: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 32
1. Kết quả phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus sp 32
1.1. Kết quả sàng lọc các chủng vi khuẩn có hình cầu, gram dương 32
1.2. Đặc điểm hình thái tế bào và đặc tính sinh lí, sinh hoá của các chủng
vi khuẩn Streptococcus sp phân lập được 34
2. Kết quả tách chiết và làm sạch protein G từ 7 chủng Streptococcus sp 38
2.1. So sánh hiệu quả kết tủa Protein G bằng aceton và (NH
4
)
2
SO
4
bão
hoà 60% 39
2.2. Kết quả làm sạch Protein thu nhận từ chủng Streptococcus sp S
8.1.1
bằng sắc kí lọc gel 42

TSA : Tryticase Soy Agar
V.P : Voges-Proskauer
DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 So sánh khả năng gắn kết kháng thể đơn dòng và đa dòng ở động vật có vú
của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA 8
Bảng 1.2 Hiệu suất thu hồi IgG tinh sạch sử dụng protein G Sepharose Fast
Flow 10
Bảng 1.3 Đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp 12
Bảng 2.1: Kết quả phân lập 24 chủng vi khuẩn hình cầu, Gram dương 32
Bảng 2.2: Kết quả thử nghiệm sinh hóa trên 24 chủng vi khuẩn đã sàng lọc 36
Bảng 2.3: Kết quả dựng đường chuẩn BSA 40
Bảng 2.4: Kết quả thu hồi Protein G theo hai phương pháp kết tủa bằng
aceton và (NH
4
)
2
SO
4
bão hoà 60% 41
Bảng 2.5. Giá trị OD với các nồng độ khác nhau của kháng thể đa dòng (Pab)
phủ
giếng
47

IgG (Immunoglobulin G) là lớp kháng thể chính trong máu và dịch ngoại
bào, có chức năng kiểm soát và bảo vệ cơ thể với hiện tượng nhiễm trùng.
IgG có thể tạo liên kết với tác nhân gây bệnh như: virus, vi khuẩn, nấm thông
qua các phương thức: i) ngưng kết và opsonin hóa từ đó thu hút tế bào thực
bào, kích thích quá trình thực bào; ii) hoạt hóa hệ thống bổ thể theo con
đường cổ điển tạo dòng thác bổ thể để loại bỏ tác nhân gây bệnh; iii) trung
hòa độc tố; iv) gây độc trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC) và
phân giải protein nội bào qua kháng thể trung gian. Lớp kháng thể này bắt đầu
xuất hiện 24-48 giờ sau kích thích kháng nguyên, có khả năng nhận biết đặc
hiệu kháng nguyên kích thícTrong chẩn đoán bệnh ở người, động vật, thậm
chí trên cả thực vật, IgG được xác định là công cụ phát hiện tác nhân gây
bệnh với độ đặc hiệu cao, đưa ra kết quả chẩn đoán nhanh, có thể thực hiện
trên số lượng mẫu lớn vì vậy lớp kháng thể này thường được sử dụng trong
hầu hết các chẩn đoán sàng lọc trong giám sát dịch bệnh. Trong các sinh
phẩm chẩn đoán miễn dịch học như ELISA, IFAT, Western blot, hóa mô
miễn dịch, ngưng kết, miễn dịch so màu… IgG được sử dụng là yếu tố chuẩn
để phát hiện kháng nguyên (tác nhân gây bệnh) hoặc là kháng thể cộng hợp để
phát hiện phức hợp kháng nguyên-kháng thể. Hiện tại, trên thế giới có hàng
ngàn loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học, trong thành phần tất cả các
sinh phẩm này đều sử dụng IgG. Ở Việt Nam, IgG được sử dụng trong các hệ
thống chẩn đoán miễn dịch học đã được thiết lập để xác định bệnh trên người
như HIV, viên gan B, ung thư, Trên động vật, IgG được sử dụng trong phản
ứng ELISA giám sát huyết thanh học các bệnh: cúm gia cầm, tai xanh ở lợn,
thậm chí xác định type virus gây lở mồm long móng trên trâu bò,… Trên thực
vật, IgG được sử dụng để phát hiện bệnh làng lùn, lùn xoắn lá ở lúa, bệnh
Greening ở cây có múi, bệnh ở khoa tây xoăn lá, nhăn lá, khảm lá ở cây khoai
2
tây do Potato Leaf Roll Virus (PLRV) và Potato Virus X, Y (PVX,
PVY)…Tuy nhiên, hầu như các hệ thống chẩn đoán miễn dịch học được thiết
lập trong nước chưa được thương mại hóa với lý do chính là chưa có hệ thống

kháng thể IgG của một số động vật.
- Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn con.
III. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Để đạt được mục tiêu nghiên cứu trên phải tiến hành một số chuyên đề
cụ thể sau:
Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn được vi sinh vật có khả năng sinh
protein G
Nội dung 2: Tinh sạch và tách chiết được protein G
Nội dung3:. Đánh giá độ gắn kết của protein G với IgG của một số
động vật nuôi (thỏ, gà).
Nội dung 4: Nghiên cứu ứng dụng IgG trong chẩn đoán bệnh tiêu chảy
ở lợn con.
IV. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Đại cương về protein G
Protein G là yếu tố cấu tạo thành tế bào của vi khuẩn Streptococci
chủng G, có khả năng gắn kết với IgG tại các mảnh Fc và Fab. Protein G tự
nhiên có hai vùng gắn kết với các Ig và các vùng gắn kết với albumin cũng
như bề mặt tế bào. Protein G được phát hiện nhờ vào thí nghiệm của Martin
Rodbell năm 1971 về sự kích hoạt cAMP bởi glucagon. Nhờ thí nghiệm này
Martin Rodbell đã phát hiện ra sự hiện diện của GTP là rất quan trọng trong
phản ứng này. Ông gọi đây là protein điều hòa guanine nucleotide.
Với bản chất là một dị phân tử nằm trong màng tế bào chất, protein G
gắn kết với các nucleotit Guanine là GDP và GTP. Được cấu tạo từ ba loại
tiểu đơn vị khác nhau, protein G có dạng heterotrime gắn kết với bề mặt bên
4
trong của màng plasma và các thụ thể nhận biết xuyên màng của các
hormone, được gọi là các thụ thể gắn kết với protein G.
1.1. Cấu trúc của Protein G
Protein G được gồm 3 thành phần: tiểu đơn vị α có KLPT ~39–45
kDa, tiểu đơn vị β có KLPT ~37 kDa và tiểu đơn vị γ có KLPT ~8 kDa

G
α11
, G
α16
.
- G
αi
là protein ức chế adenylate cyclase, qua đó làm giảm nồng độ
cAMP trong tế bào. G
αi
bị hoạt hóa bởi thụ thể của somatostatin. Bao gồm
G
αi-1,
G
αi-2
, G
αi-3
và G
α0
(chiếm ưu thế là các tiểu đơn vị α thần kinh); G
αt
, G
αt2
(các tiểu đơn vị α võng mạc) và G
αz
. Tất cả các thành viên của nhóm này,
ngoại trừ αz có thể bị biến đổi bởi chất độc pertussis.
- Loại thứ tư đó là G
α12
, G

Cấu trúc của protein G Streptococcal gồm có 83 chuỗi axit amin và
được chia thành 2 vùng chính là B1 và B2. Vùng B1 bao gồm 56 chuỗi, vùng
B2 gồm 13 chuỗi, kèm theo là 14 chuỗi axit amin còn lại. Các axit amin thuộc
vùng B1 và B2 lặp lại tại 6 vị trí: Ile6 – Val, Leu7 – Ile, Glu19 – Lys, Ala24 –
Glu, Val29 – Ala và Glu42 – Val. Cấu trúc không gian của vùng B1 bao gồm
4 cấu trúc gấp nếp β và 1 cấu trúc xoắn α, trong khi cấu trúc không gian vùng
B2 bao gồm chủ yếu là cấu trúc gấp nếp β. Nhờ có cấu trúc 2 chuỗi B1 và B2,
người ta đã tìm hiểu được cơ chế gắn của IgG với protein G. Nhằm mục đích
tìm hiểu cặp axit amin nào là yếu tố quan trọng trong gắn kết với IgG, người
ta đã tiến hành so sánh vị trí của 6 cặp axit amin giữa 2 vùng B1, B2 và tìm ra
axit amin không tham gia đến quá trình gắn là Leu7. Quá trình gắn của
protein G với mảnh Fc của IgG có sử dụng mảnh peptid tách ra từ vùng gắn
kết với IgG của protein G, kết hợp với 11 cặp axit amin bao quanh tạo thành
7
cấu trúc xoắn α. Một trong những axit amin không có tính bảo thủ giữa vùng
B1 và B2 là Glu42 – Val có thể là nguyên nhân sự thay đổi ái lực gắn IgG
giữa hai vùng B1, B2. Những nghiên cứu này cho thấy, protein G gắn kết với
mảnh Fab của IgG yếu hơn so với mảnh Fc.
1.3. Ứng dụng của Protein G
Protein G được hai nhà khoa học Alfred G. Gilman và Martin Rodbell
tìm ra và giải thích vai trò của chúng trong quá trình truyền tin bên trong tế
bào và nhờ đó được trao giải Nobel Y học 1994. Qua các nghiên cứu và phát
hiện, protein G được xem là chất trung gian rất quan trọng giúp truyền dẫn
các tín hiệu hóa học.
Ngoài ra, việc cố định protein G từ các chủng vi khuẩn đã được sử
dụng trong nhiều năm để làm sạch kháng thể từ một loạt các loài (Hjelm et
al., 1972).Dựa vào tính chọn lọc cao và ổn định, protein G đã được dùng phổ
biến để tinh chế kháng thể từ một loạt các nguồn mẫu, bao gồm huyết thanh,
dịch nổi tế bào,… Kháng thể động vật có vú được phân thành các loại chính:
IgA, IgD, IgE, IgG và IgM. IgG là lớp chủ yếu của kháng thể trong huyết

8
đem lại hiệu quả tốt hơn so với dùng protein A tinh sạch IgG Mặc dù đều
được sử dụng làm vật liệu tinh sạch IgG nhưng protein G và protein A khác
nhau ở vị trí gắn kết với IgG, nguyên do bởi khả năng gắn kết đặc hiệu của
bản thân từng loại IgG. Protein G không chỉ có khả năng gắn kết mạnh với
kháng thể đa dòng IgG, ví dụ kháng thể của bò sữa, cừu và ngựa…mà còn
gắn kết được với kháng thể đa dòng IgG của chuột, IgG
3
của người…
Bảng 1.1 So sánh khả năng gắn kết kháng thể đơn dòng và đa dòng
ở động vật có vú của protein G và protein A sử dụng phản ứng ELISA
9
1.4. Tình hình nghiên cứu protein G trong nước và quốc tế.
Các nghiên cứu về protein G trong nước còn rất ít, trong khi đó trên thế
giới, các nghiên cứu về khả năng gắn kết với IgG của protein G khá là phổ
biến. Theo Langone, 1982, các protein gắn kết liên tục với vùng Fc của IgG
thì nằm trên bề mặt của các chủng Staphylococci và Streptococci. Protein A
từ chủng Staphylococcus aureus được biết đến với khả năng gắn kết IgG đã
được khai thác trong nhiều phương pháp hóa miễn dịch (Goding, 1978;
Langone, 1982). Protein G là phân tử protein của nhóm G và C Streptococcus
và được gắn kết với IgG của phần lớn các loài khác (Akerstrom et al., 1985;
Guss et al., 1986; Reis et al., 1986). Ngược lại với protein A từ
Staphylococcus aureus, thì protein G từ chủng G148 Strep có khả năng gắn
kết được với bốn lớp con của IgG người, trong khi protein A không có khả
năng găn kết với IgG
3
(Guss et al., 1986). Tuy nhiên, protein A có ái lực với

hemolytic và γ-hemolytic. Dựa vào các kiểu tan máu này, người ta chia
Streptococcus sp ra thành nhiều nhóm, như:
- α-hemolytic: gồm có phế cầu và nhóm viridans;
- β-hemolytic: gồm có các nhóm A, B, C, G, F, H và D
11
Cho đến nay, nhiều liên cầu khuẩn thuộc D đã được phân loại và đặt
trong chi Enterococcus.
2.1. Đặc điểm hình thái và sinh lý sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus sp
2.1.1. Đặc điểm hình thái
Streptococcus sp là chi vi khuẩn có dạng hình cầu hoặc hình trứng, có
kích thước đường kính nhỏ hơn 2µm. Chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi
hạt, với độ dài ngắn không đều nhau (từ 2-10 vi khuẩn hoặc có thể dài hơn),
cũng có khi chúng đứng riêng lẻ hoặc thành từng cặp. Streptococcus sp bắt
màu gram dương (+), chúng không có khả năng sinh bào tử, không có khả
năng di động , một số dòng có khả năng tạo vỏ nhày [20]

Hình 1.2 Hình thái vi khuẩn Streptococcus sp
(A)- Ảnh Streptococcus sp bắt màu Gram dương
(B)- Ảnh chuỗi các vi khuẩn Streptococcus sp
2.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hóa.
Vi khuẩn Streptococcus sp là một loại vi khuẩn dễ bị tiêu diệt bởi nhiều
chất sát trùng như: phenol, iod, hypochloride, axit phenic 3-5% diệt vi khuẩn
trong vòng 3-15 phút, formol 1% diệt vi khuẩn trong vòng 60 phút. Vi khuẩn
còn bị diệt bởi cồn 70% trong vòng 30 phút.
Đặc điểm sinh hóa là một chỉ tiêu rất quan trọng để phân lập một loài vi
khuẩn cụ thể. Đặc điểm sinh hóa dựa trên khả năng sử dụng một số hợp chất,
A

B
12

13
cầu nhóm B được xác định bởi thử nghiệm CAMP (viết tắt của Christie,
Atkins và Munch-peterson). Liên cầu nhóm B sản xuất một chuỗi peptide hay
chất CAMP có hoạt động phối hợp với hemolysin gây tan máu β được sinh ra
bởi một số chủng Staphylococcus aureus, tạo ra hiệu quả tan máu tăng lên rõ
rệt. Sau khi nuôi cấy và ủ, kết quả tác dụng là vùng tan máu có dạng β, tức là
hình thành vòng tan máu có màu trong suốt xung quanh khuẩn lạc.Những liên
cầu không phải nhóm B không có phản ứng này.
Trong thử nghiệm Bile Esculin, với sự xuất hiện của muối mật, liên cầu
nhóm D thủy phân glycoside esculin hành 6,7-dihydroxycoumarin, chất này
sẽ phản ứng với muối sắt trong môi trường để tạo ra màu nâu cho đến màu
đen sau khi nuôi cấy và ủ. Nếu không xuất hiện màu tối này trên môi trường,
thì đó không phải là liên cầu khuẩn nhóm D. Một thử nghiệm khác nữa để có
thể phân biệt liên cầu nhóm D, đó là chúng có khả năng tồn tại và phát triển
trên môi trường canh thang 6,5% NaCl, trong khi đó, các cầu khuẩn không
thuộc họ đường ruột khác không có khả năng này [23]
2.2. Đặc điểm sinh trưởng và khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp
2.2.1. Đặc điểm sinh trưởng
Streptococcus sp thuộc nhóm liên cầu hiếu khí, kị khí tùy tiện và
thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết
thanh, đường… Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện khí trường có thêm 5-
10% CO
2
. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 30-37
o
C, một số phát triển ở 10-
40
o
C như liên cầu đường ruột, không phát triển ở 45
o

chất mọc của Streptococcus sp trên môi trường, thì cho kết quả sau:
+ Môi trường thạch thường: Khuẩn lạc mọc yếu, khuẩn lạc màu trắng,
trong, tròn gọn.
+ Môi trường thạch máu: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi tím, lồi, tròn,
gọn, mịn, dung huyết.
+ Thạch Edward: Khuẩn lạc nhỏ mịn, ướt, tròn, gọn, trong, mặt hơi lồi,
màu hơi tím.
+ Thạch Shapman: Không mọc, màu đỏ tươi.
+ Nước thịt 5% huyết thanh: Khuẩn lạc mọc tốt, màu hơi đục.
Vi khuẩn Streptococcus sp, khi nuôi trên môi trường BHIA ( Brain
Heart Infusin Agar) ở 28-30
o
C, sau 24 giờ, thì đa số các khuẩn lạc mọc trên
đĩa thạch BHIA đều có hình tròn, rìa đều, bóng, lồi thấp, tâm hơi đậm, đường
kính 0,5-0,7mm. Khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch máu 5%, sau
24 giờ nuôi cấy, trên đĩa thạch mọc lên khuẩn lạc màu trắng sữa, tròn rìa đều,
tâm hơi đậm, khuẩn lạc tạo vòng dung huyết β hoặc γ nhỏ, trong suốt, rìa
không rõ ràng. Các liên cầu khuẩn Streptococcus sp, bị ức chế nếu sống trong
môi trường có nồng độ muối NaCl 6,5% [6][7]
2.2.2. Cấu trúc kháng nguyên
+ Kháng nguyên C đặc hiệu nhóm: Năm 1930, Lancefield dựa vào
kháng nguyên C (cacborhydrat) của vách tế bào vi khuẩn xếp liên cầu khuẩn
thành các nhóm từ A, B, C,…R. Liên cầu nhóm A và D có khả năng gây bệnh
cho người. Các nhóm khác (B, C) gây bệnh cho gia súc hoặc không gây bệnh.
+ Kháng nguyên M đặc hiệu typ: Kháng nguyên M (protein M) cũng
nằm ở vách tế bào vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên này, Lanceifeld xếp liên
cầu nhóm A thành 80 typ huyết thanh khác nhau. Protein M nằm trên bề mặt
tế bào nên dễ dàng kết hợp với kháng thể kháng protein M. Kháng nguyên M
16
có khả năng chống lại sự thực bào vì vậy nó liên quan trực tiếp tới độc lực của

b, Khả năng sinh độc tố của Streptococcus sp
Các liên cầu khuẩn tan máu β nhóm A (Group A β-hemolytic
streptococcus) có phương thức xâm nhập ngoại bào, chúng phá vỡ các rào cản
của tổ chức để phát tán các tác nhân gây bệnh đến các vị trí khác trong cơ thể
trong khi bản thân chúng vẫn tồn tại bên ngoài tế bào vật chủ. Sau khi xâm
nhập, Streptococcus sp tiết ra các enzym phá hủy các phân tử của tế bào vật
chủ như: hyaluronidase để cắt đứt các proteoglycan ở tổ chức gắn kết,
streptokinase phá hủy các cục fibrin,…
Ngoài ra, một số Streptococcus sp còn có khả năng tạo vỏ vi khuẩn
(capsule), khả năng này là một trong những yếu tố độc lực quan trọng nhất của vi
khuẩn về phương diện xâm nhập tại vị trí viêm. Vỏ vi khuẩn này giúp chúng
chống lại cơ chế phòng vệ của cơ thể cũng như để kháng kháng sinh.
Streptococcus sp nguy hiểm có khả năng tạo vỏ đó là Streptococcus
pneumoniae.
Theo Kennet Todar (2002), thì Streptococcus sp có 2 loại dung huyết
tố, đó là Streptolysin O và Streptolysin S. Hầu hết liên cầu tan máu β đều có
khả năng sinh ra men này. Chúng bị mất hoạt tính bởi oxy nên trên môi
trường nuôi cấy chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố này mang
tính chất của một ngoại độc tố, có tính kháng nguyên mạnh nên kích thích cơ
thể hình thành kháng thể ( anti Streptolysin O). Việc định lượng kháng thể
này có giá trị trong chẩn đoán bệnh liên cầu đặc biệt trong bệnh thấp tim và
viêm cầu thận cấp.
18
Bên cạnh đó, nhiều liên cầu tiết ra Streptolysin S, men này gây tan máu
ở bề mặt môi trường nuôi cấy, tính kháng nguyên yếu nên không kích thích
cơ thể hình thành kháng thể, nó còn làm ảnh hưởng đến chức năng của tế bào
lympho T (Lewis W.Wannamaker, 1983).
Ngoài ra, độc tố hồng cầu còn được gọi là độc tố sinh đỏ của Streptococcus
sp, cũng là căn nguyên của một số loại bệnh tật. Độc tố này có bản chất là protein,
gây phát ban trong bệnh tinh hồng nhiệt (Lewis W.Wannamaker, 1983).