ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH
ACID LACTIC CAO TỪ SỮA NGƢỜI VÀ ĐỘNG VẬT

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo
Chuyên ngành
Khoa
Khóa học

: Chính quy
: Công nghệ sinh học
: CNSH - CNTP
: 2011 – 2015

THÁI NGUYÊN - 2015


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
--------------o0o--------------

NGUYỄN THỊ HỒNG NGỌC
Tên đề tài:
PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH

Tuấn Hà, ThS. Vi Đại Lâm giảng viên Khoa CNSH - CNTP, người đã hướng
dẫn em các thao tác thực hành và chỉ ra cho em những sai lầm giúp em hoàn
thành tốt khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH - CNTP,
trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong
quá trình học tập và hoàn thành khoá luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
khoá luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái nguyên, ngày

tháng

năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hồng Ngọc


ii

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic…………………………8
Bảng 2.2: Một số các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đã được sử dụng để
bổ sung khi lên men thực phẩm .......................................................... 14
Bảng 3.1: Các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 22
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................................ 23

Hình 4.5: Sản phẩm sữa chua lên men ............................................................ 57


iv

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
ATP

: Adenosin Triphosphat

DNA

: Deoxyribonucleic acid

GRAS

: Generally Recognized As Safe

LAB

: Lactic acid Bacteria

MRS

: de Man, Rogosa and Sharpes

OD

: Optical Density


Phần 3: ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 22
3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu. ........................................................... 22


vi

3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 22
3.3. Hoá chất và thiết bị sử dụng ..................................................................... 22
3.3.1. Hoá chất ................................................................................................................. 22
3.3.2. Thiết bị sử dụng ................................................................................................... 23
3.4. Môi truờng sử dụng .................................................................................. 23
3.5. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 24
3.6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24
3.6.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic ...................................... 24
3.6.2. Phương pháp định danh sơ bộ .......................................................................... 25
3.6.3. Phương pháp đếm tế bào vi khuẩn lactic ....................................................... 27
3.6.4. Phương pháp đo pH ............................................................................................ 29
3.6.5. Phương pháp định lượng acid lactic ............................................................... 29
3.6.6. Phương pháp đo sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic bằng
cách đo chỉ số OD trên máy quang phổ UV – Vis .................................................. 30
3.6.7. Phương pháp nghiên cứu môi trường thay thế ............................................. 31
3.6.8. Phương pháp thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn lactic với chủng
nấm men ............................................................................................................................ 32
3.6.9. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm lên men sữa chua ........................... 33
Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 38
4.1. Kết quả phân lập chủng khuẩn lactic có khả năng lên men, tăng sinh khối
mạnh ................................................................................................................ 38
4.2. Kết quả tuyển chọn chủng khuẩn lactic có khả năng lên men, tăng sinh
khối mạnh ........................................................................................................ 41

vang [19]; (Pannapa Powthong và cs, 2015) [31].
Trong quá trình lên men, LAB sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra môi
trường không thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay
gây hư hỏng sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh
hưởng đến chức năng bảo vệ và chức năng dinh dưỡng của màng tế bào, ức
chế quá trình vận chuyển chủ động của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm
qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào hoặc tự oxi hoá, làm dừng quá trình
trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm với nó (Đặng Thị Thu Thảo,
2011) [15].
LAB thường tồn tại ở môi trường sống giàu chất dinh dưỡng như sữa,
phô mai, thịt, đồ uống và các loại rau. Chúng có thể cũng phân lập từ đất, ao
hồ, đường ruột của động vật và con người (Schillinger và cs, 1989) [35];
(Tserovska và cs, 2006) [37]. Nhiều nghiên cứu gần đây không chỉ hướng đến
việc tìm ra chủng LAB làm chất phụ gia an toàn (GRAS), kiểm soát sự phát
triển của mầm bệnh, hay cả việc sản xuất các kháng sinh “bacteriocins, đã
được đánh giá cao. Mà hiện nay các chủng LAB vẫn được nghiên cứu chuyên
sâu tìm ra nguồn nguyên liệu sữa khi phân lập thu được lượng acid lactic cao
nhất. Với mục đích tìm ra các chủng LAB có khả năng sinh acid lactic cao
nhất ứng dụng trong sản xuất công nghiệp thực phẩm, em tiến hành thực hiện
đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid lactic
cao từ sữa Người và Động vật”.


2

1.2. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn đươc chủng vi khuẩn có khả năng sinh acid
lactic cao từ sữa Người và Động vật.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ sữa Người và động vật (bò, dê,

Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dương có sự
thống nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chúng
là trực khuẩn ngắn hay que và cầu khuẩn không hô hấp, không sinh bào tử.
Chúng thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa
lactic, axit lactic được tạo ra như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và
là kết thúc của quá trình lên men carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong
thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng
(Lê Thị Hồng Vân, 2008) [20]; [21].
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn lactic (LAB)
Từ xa xưa, con người đã sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản và chế
biến các loại thức ăn. Cho đến năm 1780, nhà bác học Thuỵ điển Carl
Wilhelm Schaele lần đầu tiên tách được axit lactic từ sữa bò lên men chua.
Năm 1874, Bloudean xác nhận axit lactic (CH3CHOHCOOH) là sản phẩm
cuối cùng của sự lên men. Mười năm sau, năm 1857, L.Pasteur đã chứng
minh rằng sữa chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt
gọi là vi khuẩn lactic. Đến năm 1878, Joseph Lister đã phân lập thành công vi
khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic, ngày nay gọi là Streptococcus
lactic. Công nghệ sản xuất axit lactic ra đời năm 1881, từ đó đến này đã có rất
nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn lactic cũng như quá trình lên men
lactic được thực hiện. Các nhà khoa học cũng liên tục phân lập được các loài
vi khuẩn lactic khác nhau (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]; (Huỳnh Ngọc
Thạch và cs, 2002) [14].


4

2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử,
catalase âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi
chất chủ yếu bằng con đường lên men và không hô hấp do không có

Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus và
Weissella.Trước đây giống Bifidobacterium cũng được xếp vào nhóm vi
khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng được xem
là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp [21].
2.1.4.1. Phân loại theo hình dạng tế bào (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6]
Sau nhiều nghiên cứu và dựa trên những đặc điểm hình dạng tế bào các
nhà khoa học đã phân chia vi khuẩn lactic thành các loại sau:
 Hình que: Lactobacillus, Carnobacerium.
 Hình cầu: Streptococcus, Leuconotoc, Pedicoccus.
 Ngoại lệ: Weissella (có cả hình cầu và que), Bifidobacterium
Phân chia vuông góc nhau trên một mặt phẳng tạo hình tứ cầu
(Aerococcus, Tetragenococcus, Pediococcus).
Hình dạng và sự sắp xếp tế bào có thể thay đổi tuỳ thuộc vào thành phần môi
trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy…
2.1.4.2. Phân loại theo cách thức lên men (Espina. F và cs, 1979) [25]
Lên men đồng hình (homofermentative): Khi lượng acid lactic tạo ra
chủ yếu 85 – 90%. Vi khuẩn lên men lactic đồng hình có enzyme aldolaza
nhưng không có enzyme phosphoketolaza. Nhóm vi khuẩn này gồm các cầu
khuẩn Streptococcus lactic như là Streptococcus cermoris, các trực khuẩn
Lactobacterium acidophilum, Lactobacterium helveticum, Lactobacterium
bulgaricus.
Lên men dị hình (heterofermentative): Khi lượng acid lactic lên men
chiếm tỷ lệ thấp khoảng 50%, các axit hữu cơ khác như axit acetic, axit


6

formic... và CO2. Nhóm vi khuẩn này không có enzyme aldolaza nhưng lại có
enzyme phosphoketolaza. Ví dụ: Leucnostoc, Oenococcus, Weissella, một số
Lactobacillus.

Enzyme thủy phân lactose có tên lactase, thuộc nhóm β-galactosidase.
Enzyme này có hoạt tính chủ yếu là thủy phân liên kết β1-4 glucosidic của
phân tử đường đôi lactose để tạo thành 2 phân tử đường đơn có độ ngọt cao
hơn đường lactose. Do vậy, enzyme lactase chủ yếu được sử dụng trong công
nghiệp các sản phẩm từ sữa để giảm hàm lượng lactose, một thành phần
cacbonhydrat chính trong sữa mà phần lớn người trưởng thành có khả năng
dung nạp rất kém và đặc biệt một số ít người lớn kể cả trẻ sơ sinh có dị ứng
mạnh với đường lactose [21].
Hoạt tính phân hủy lactose được xác định bằng 2 cách, hoặc là thông
qua sự mất đi của cơ chất là lactose hoặc là thông qua sự tạo thành của sản
phẩm đặc trưng cho phá vỡ liên kết glycosidic, thông thường dùng cơ chất
đặc hiệu ONPG (o nitrophenyl-β-D-glucoside) và xác định lượng ONP (onitrophenyl) tạo thành. Lactase của các vi khuẩn ưa pH gần trung tính. Phần
lớn lactase hoạt động trong khoảng nhiệt độ 35-450C (ưa nhiệt độ trung bình),
một số khác từ 45-650C (ưa nhiêt), dạng cá biệt có lactase hoạt động xúc tác ở
nhiệt độ lạnh 40C [21].
2.3. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
2.3.1. Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ
Eubacteriales. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái nhưng về mặt sinh lý
tương đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dương (+), không tạo bào tử, hầu
hết không di động, thu nhận năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh
axit lactic dưới dạng D (-), L (+) hoặc DL (Nguyễn Lân Dũng và cs, 2009) [3]
Khác với các vi khuẩn đường ruột cũng sinh ra axit lactic, tất cả các vi
khuẩn lactic đều lên men bắt buộc; không chứa cytochrome, enzyme catalase;
hô hấp tuỳ tiện. Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhu cầu cao về môi truờng dinh dưỡng


8

ngoài đường, muối khoáng, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin


Cầu

Chuỗi

Dị hình

36 – 43

Pedicoccus

Cầu

Tứ cầu

Đồng hình

34 – 42

Lactobacsillus

Que

Chuỗi

Đồng hình và dị hình

32 – 53

Bifidobacterium

các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể
sử dụng như: cao thịt, cao nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa,
pepton.
2.3.2.3. Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trò là các coenzyme trong quá trình trao đổi chất của
tế bào, nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi
khuẩn lactic không có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung
vào môi trường các loại vitamin.
Các chất chứa vitamin thường sử dụng như nước chiết từ khoai tây,
ngô, cà rốt hay dịch tự phân nấm men…
2.3.2.4. Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu
cơ khác cho sự phát triển như các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu
cơ có ảnh hưởng thuận lợi đến tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic như axit
xitric, axit oleic.
Nên hiện nay người ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic,
axit axetic làm thành phần môi trường nuôi cấy, phân lập và bảo quản các
chủng vi khuẩn lactic.
2.3.2.5. Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất
cần các muối vô cơ.


10

Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng như đồng, sắt, natri, kali,
photpho, lưu huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa
quá trình tự phân và ổn định cấu trúc tế bào.
2.3.2.6. Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống được trong môi trường có oxy và

(Axelsson L.T, 2004) [22].
2.3.3.1. Lên men lactic đồng hình
Phương trình tổng quát lên men lactic đồng hình:
C6H12O6  2CH3 – CHOH – COOH + 94 Kcal
Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm tạo ra chủ
yếu là axit lactic. Trong quá trình lên men, sự hình thành axit trải qua hàng
loạt giai đoạn trung gian với sự tham gia của các enzyme tương ứng. Giai
đoạn đầu xảy ra quá trình hoạt hoá hexose với sự có mặt của axit phosphoric
để hình thành hexose diphosphat, sau đó diễn ra sự cắt mạch hexose để hình
thành triosophosphat (dihydroxyaxeton-P và glycerađehye-3P) những hợp
chất này chuyển hoá thành pyruvat, và pyruvat là chất nhận H+ từ NADH để
chuyển hoá thành axit lactic (chu trình EMP) (Nguyễn Thành Đạt, 2007) [6];
(Khalisanni Khalid, 2011) [28].
Một số loài vi khuẩn lactic lên men lactic đồng hình:
Streptococcus lactics: Là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi còn
non, kết đôi hoặc thành chuỗi ngắn. Chúng là giống vi khuẩn ưa ấm, phát
triển tốt ở 30-35oC, làm đông tụ sữa ở điều kiện này sau 10 – 12 giờ. Trong
môi truờng tích tụ được 0,8 - 1% axit lactic. Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển
là 10oC, tối đa là 40 – 45oC. Một số chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nizin
(Nguyễn Thị Diễm Hương và cs, 2012) [7].
Lactobacillus plantarum: Là những trực khuẩn nhỏ, thường kết đôi
hoặc chuỗi. Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 30oC, tích tụ 1,3% axit. Giống
này chủ yếu trong muối chua rau dưa và ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuôi
(Nguyễn Đức Lượng, 2002) [12].


12

2.3.3.2. Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men kị khí phức tạp ngoài sản

Vi khuẩn lactic là vi sinh vật thực phẩm an toàn được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực khác nhau của xã hội như công nghiệp, nông nghiệp, môi
trường, y dược, đặc biệt trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm…
2.3.4.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm
Quá trình lên men lactic các thực phẩm thực hiện bởi vi khuẩn lactic đã
được biết đến như ứng dụng đầu tiên và hiện nay đã trở lên rất phổ biến.
Tận dụng hệ vi khuẩn lactic có sẵn trong các nguyên liệu, bằng cách tạo
điều kiện cho chúng phát triển chiếm ưu thế, người ta đã tạo ra rất nhiều loại
thức ăn chua có hương vị thơm ngon, dễ tiêu hoá hơn và giữ được lâu hơn. Có
những loại đóng vai trò quan trọng trong các bữa ăn hàng ngày của một vài
dân tộc hay một bộ phận dân cư. Một số khác hiện diện với vị trí của các món
ăn truyền thống hoặc đặc sản.


14

Bảng 2.2: Một số các chủng vi khuẩn lactic thuần khiết đã đƣợc sử dụng
để bổ sung khi lên men thực phẩm
Tên sản

Nguyên liệu ban

phẩm

đầu

Vi sinh vật đƣợc bổ sung

Phạm vi sử
dụng


Taette
Yoghurt

Sữa

Streptococcus lactic vartaette

Sữa tươi, sữa bột

Lactobacillus bungaricus
Streptococcus thermophilus

Scandinavia
Toàn thế giới

TỪ THỊT CÁ
Xúc xích khô
Izushi

Thịt bò, thịt lợn

Pediococcus ceravisiae

Cá tươi, gạo, rau

Lactobacillus spp

Mỹ, Châu Âu
Nhật Bản

Ấn độ
Thuỵ sĩ và các
vùng khác


15

2.3.4.2. Ứng dụng trong chăn nuôi
Trong lĩnh vực chăn nuôi từ lâu đời người dân đã biết ủ chua thức ăn,
rau xanh mà thực chất là quá trình lên men lactic tự nhiên. Ủ xanh thức ăn là
phương pháp sinh vật học đặc biệt vừa có tác dụng chế biến và bảo quản thức
ăn, ủ xanh thức ăn có ý nghĩa kinh tế lớn, nhờ đó có thể thu hoạch thức ăn
xanh vào bất kì thời tiết nào, ngoài ra thức ăn ủ xanh còn giữ được chất dinh
dưỡng nhiều hơn so với các thức ăn xanh phơi khô, giá trị dinh dưỡng giảm
không quá 5 – 10% (so với thức ăn phơi khô giảm đi 50%). Từ năm 1850 trở
đi, ủ xanh đã trở thành một ngành công nghiệp chế biến thức ăn Châu Âu, sau
đó lan truyền sang các nước khác trên thế giới (Huỳnh Ngọc Thạch và cs,
2002) [14].
2.3.4.3. Ứng dụng trong một số lĩnh vực khác
Ứng dụng quan trọng của vi khuẩn lactic là sản xuất axit lactic và các
muối lactat. Lên men lactic là phương pháp duy nhất hiện nay dùng để sản
xuất axit này trong công nghiệp. Axit lactic và các dẫn xuất của nó có những
ứng dụng rất quan trong trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong dược phẩm và y học, có ý nghĩa nhất phải kể đến chất kháng sinh
Bacterioxin. Loại kháng sinh này cho phép tăng cường tính miễn dịch, giảm
lượng cholesterol trong máu, điều trị chứng loạn khuẩn và chống ung thư. Rất
nhiều tác giả đã khẳng định tác dụng hữu hiệu của Bacterioxin trong việc bảo
vệ sức khoẻ con người. Nhờ có hoạt tính quang học đặc biệt, các este tạo bởi
axit lactic với metyl, etyl hay izopropyl được dùng như chất trung gian để
tổng hợp các phân tử đối xứng (cấu trúc thường gặp của nhiều loại dược liệu).

phương pháp phân tích xác định nhiều loại axit amin, vitamin nhờ tính nhạy
cảm và nhu cầu đặc hiệu của chúng đối với nhóm chất này (Huỳnh Ngọc
Thạch và cs, 2002) [14].