VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------

-------

KHÓA LU
LUẬN TỐT
T NGHIỆP
NGHI
ĐỀ TÀI:

TUYỂN CHỌN
N CÁC CH
CHỦNG VI KHUẨN
N CÓ KHẢ
KH NĂNG
SINH H
HƯƠNG CHO NƯỚC MẮM

GIÁO VIÊN HƯ
ƯỚNG DẪN

: THS. BÙI THỊ HỒNG
NG PHƯƠNG
PH

SINH VIÊN THỰ
ỰC HIỆN

: TRẦN THỊ TIẾN

Lớp: 1102


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC MẮM. ...................................................................... 3
1.1.1. Giới thiệu về nước mắm. ............................................................................. 3
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm. ............................................................ 6
1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT NƯỚC MẮM. ..................................................... 10
1.2.1. Chuyển hóa protit thành axit amin. ......................................................... 11
1.2.2. Quá trình thứ hai là quá trình tạo hương thơm...................................... 11
1.3. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC
MẮM. ........................................................................................................................ 13
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn trong sản xuất nước mắm ...................... 13
1.3.2. Cơ chế tạo hương của các vi khuẩn trong sản xuất nước mắm. ............ 15
1.4. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH SINH TRƯỞNG CỦA VI
KHUẨN. .................................................................................................................... 17
1.4.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy. .................................. 17
1.4.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon............................................................... 17
1.4.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ. ................................................................... 18
1.4.1.3. Ảnh hưởng của muối khoáng. ............................................................... 19
1.4.1.4. Ảnh hưởng của muối. ............................................................................ 21
1.4.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường. ..................................................... 22
1.4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ. ....................................................................... 22
1.4.2.2. Ảnh hưởng của pH. ............................................................................... 22
1.5. Tình hình nghiên cứu hương nước mắm trên thế giới và ở Việt Nam. ........ 23

Trần Thị Tiến


Trần Thị Tiến

c

Lớp: 1102


3.2.2. Nghiên cứu tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân
protein ở nồng độ muối cao. ................................................................................ 36
3.2.3. Hàm lượng oligopeptit của các chủng đã lựa chọn. ................................ 38
3.2.4. Hoạt tính aminopeptitdase ........................................................................ 40
3.2.5. Xác định các hợp chất hương trong dịch lên men mắm cá. ................... 41
3.3. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của 5 chủng vi khuẩn được tuyển chọn............... 45
3.4. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy cho các chủng vi khuẩn đã tuyển chọn. ...... 49
3.4.1. Nghiên cứu lựa chọn nguồn cacbon cho các chủng vi khuẩn đã tuyển
chọn........................................................................................................................ 49
3.4.2. Nghiên cứu lựa chọn nhiệt độ thích hợp cho các chủng vi khuẩn đã
tuyển chọn. ............................................................................................................ 51
3.4.3. Nghiên cứu lựa chọn pH thích hợp cho các chủng vi khuẩn đã tuyển
chọn........................................................................................................................ 53
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Trần Thị Tiến

d

Lớp: 1102


MT2

Môi trường MRS thay thế glucose bằng 2% saccarose

MT3

Môi trường MRS thay thế glucose bằng 2% lactose

MT4

Môi trường MRS thay thế glucose bằng 2% xylose

DC25

Môi trường dịch cá bổ sung muối 25% NaCl.

Trần Thị Tiến

e

Lớp: 1102


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các loại nước mắm Châu Á............................................................................. 3
Bảng 1.2: pH và hàm lượng NaCl, Nitơ tổng của nước mắm các nước. ......................... 6
Bảng 1.3: Hàm lượng các axit amin trong nước mắm các nước (mg/100ml). ................ 7
Bảng 1.4: Thành phần và hàm lượng axit amin của 4 loại nước mắm thương mại của
Việt Nam (mg/g)]. ............................................................................................................ 9
Bảng 1.5: Thành phần các chất vô cơ. ........................................................................... 10

Hình 3.1: Ảnh vòng tròn thủy phân của 4 chủng vi khuẩn MF1, MF5, MF6, MF18. ... 35
Hình 3.2.Hoạt tính aminopepitdase của các chủng nghiên cứu. .................................... 41
Hình 3.3: Biểu đồ sinh trưởng của 5 chủng vi khuẩn trong quá trình nhân sinh khối. .. 51
Hình 3.4. Phổ đồ và sắc ký đồ của chủng Staphylococcus sp (MF1) ............................ 59
Hình 3.5. Phổ đồ và sắc ký đồ của chủng Lactobacillus (MF5) .................................... 59
Hình 3.6. Phổ đồ và sắc ký đồ của chủng Lactobacillus (MF6) .................................... 60
Hình 3.7. Phổ đồ và sắc ký đồ của chủng Pediococcus (MF8) ..................................... 60
Hình 3.8. Phổ đồ và sắc ký đồ của chủng Pediococcus. halophilus (MF18)................. 61

Trần Thị Tiến

g

Lớp: 1102


MỞ ĐẦU
Từ lâu nước mắm đã trở thành một loại nước chấm rất thông dụng và gần gũi với
người dân Việt Nam, những ai đi xa khi nhớ quê hương thì không thể quên được hương
vị của nước mắm quê nhà. Nước mắm không chỉ là gia vị giúp cho bữa ăn hằng ngày
được ngon hơn mà nó còn được xem như một loại thực phẩm giàu chất dinh dưỡng
như: các axit amin, các vitamin, các chất khoáng cần thiết cho cơ thể.
Nước mắm Việt Nam đã được phát triển từ lâu đời cùng với lịch sử phát triển của
dân tộc và mang đâm bản sắc đặc thù của dân tộc Việt Nam. Nước mắm hấp dẫn mọi
người bởi hương vị đậm đà và giá trị dinh dưỡng cao. Bên cạnh đó nước mắm còn có
thể chữa một số bệnh như: đau dạ dày, phục hồi cơ thể khi suy nhược,…
Nước mắm được sản xuất từ cá và muối không chỉ được sử dụng rộng rãi ở Việt
Nam mà còn được ưa chuộng ở nhiều nước trên thế giới như: Nampla ở Thái Lan,
Ngapi của Myanma, Patis của Philippin,…Ở mỗi quốc gia khác nhau sẽ có những
phương pháp chế biến nước mắm riêng, mang nét đặc trưng của quốc gia đó. Do vậy,

được tuyển chọn.

Trần Thị Tiến

2

Lớp: 1102


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NƯỚC MẮM.
1.1.1. Giới thiệu về nước mắm.
Nước mắm là dung dịch thủy phân từ các loại cá được ướp muối lâu ngày trải qua
một quá trình lên men phức tạp để tạo ra sản phẩm là chất lỏng có mầu nâu sáng với
hương vị đặc trưng cho từng loại sản phẩm. Nó được sử dụng rộng rãi trong ẩm thực
của các quốc gia Đông Nam Á như một loại gia vị nước chấm cho các món ăn như cá,
tôm, thịt…(Lopetcharat và cs, 2001). Ở mỗi một quốc gia khác nhau thì nước mắm lại
có tên gọi khác nhau được thể hiện ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: Các loại nước mắm Châu Á[7].
Xuất xứ

Tên gọi

Nguyên liệu

Tỷ lệ cá : muối và thời gian lên men

Ishiru

Mực ống/ Cá mòi


tháng).
Lào

Malaysia

Padek

Budu

Cá cơm

Tỷ lệ Cá : muối : cám gạo = 3:1: 0.5 (6

Cá nước ngọt

tháng đến 1 năm)

Cá cơm

Tỷ lệ 5:1 – 3:1 =Cá : Muối + đường + me
(3-12 tháng).

Myanmar

Ngapi

Cá nước ngọt, mực Tỷ lệ 5:1 = Cá:muối (3-6 tuần)

Hàn Quốc

nước mắm ở Phú Quốc và Bình Thuận, họ đã đưa ra những kết luận:
• Nước mắm là hỗn hợp các axit amin. Các axit amin này được tạo thành do sự
thủy phân của protease. Các protease này do vi sinh vật tổng hợp nên.
• Tỷ lệ muối thích hợp là 20 ÷ 25% có tác dụng ức chế vi sinh vật gây thối.
• Nhiệt độ có tác động rất lớn đến hoạt động của các enzym trong quá trình sản
xuất nước mắm. Nhiệt độ thích hợp là 35-440C.
Nước mắm là kết quả từ quá trình thủy phân protein cá dưới tác động protease
của vi sinh vật và protease có trong tụy tạng cá. Nhờ đó mà protein được phân cắt
thành peptit mạch ngắn và các axit amin tự do (Lopetcharat và cs, 2001). Saisithi
(1994) báo cáo rằng các axit amin được tìm thấy trong nước mắm có tổng số 17 axit
amin như: taurine, axit aspartic, threonine, serine, axit glutamic, glycine, alanine,
valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine,
arginine và citrulline. Trong đó có 8 axit amin thiết yếu: threonine, valine,
methionine, isoleucine, leucine, phenylalanine, histidine, lysine. 9 axit amin nhánh:
taurine, axit aspartic, serine, axit glutamic, glycine, alanine, tyrosine, arginine và
citrulline. Hầu hết trong quá trình lên men các polypeptit giảm và các axit amin
tăng.Trong quá trình lên men, giá trị pH giảm do sự giải phóng của các axit amin tự
do. Ngoài ra, thành phần axit béo thay đổi không đáng kể trong quá trình lên men,
nhưng tổng số lipid giảm (Kim và cs, 1994). Ngoài các thành phần hóa học của cá,
vi sinh vật có trong cá cũng rất quan trọng đến chất lượng của nước mắm. Hệ vi

Trần Thị Tiến

4

Lớp: 1102


sinh của cá cũng khác nhau phụ thuộc vào từng loài, mùa, vùng, điều kiện vận
chuyển, phương thức bảo quản và phương pháp đánh bắt. Hệ vi sinh vật được tìm


Lớp: 1102


Các vi khuẩn lactic ưa mặn có thể phát triển trên môi trường có nồng độ muối
NaCl cao > 18% (Holt và cs, 1994). Các chủng vi khuẩn lactic ưa mặn như
Tetragenococcus đã được tìm thấy trong nước mắm và thực phẩm lên men có muối.
Satomi và cs, 1997 cho thấy T. muriaticus là một vi khuẩn lactic ưa mặn được phân
lập từ nước chấm được làm từ cá. Thongsanit và cs, 2002 đã phân lập T. halophilus
và T.muriaticus từ nước mắm (nam-pla). Hơn nữa, T. halophilus và T.muriaticus
được tìm thấy trong các sản phẩm dịch đậu nành ở Indonesia (Roling và cs, 1996),
nước tương Nhật Bản (Nakagawa và Kitahara, 1959), cá cơm muối (Villar và cs,
1985), lên men cá nóc của Nhật Bản (Kobayashi và cs, 2000) [11].
1.1.2. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm.
Tùy theo xuất xứ của nước mắm và kỹ thuật sản suất của các vùng miền, mỗi
nước khác nhau mà giá trị dinh dưỡng, thành phần hóa học của các loại nước mắm
cũng khác nhau.
Bảng 1.2: pH và hàm lượng NaCl, Nitơ tổng của nước mắm các nước [8].

NaCl

Nitơ tổng

(g/100ml)

(g/100ml)

5.63

21.4


18

1.8

Các nước

pH

Thái Lan

Trần Thị Tiến

6

Lớp: 1102


Bảng 1.3: Hàm lượng các axit amin trong nước mắm các nước (mg/100ml) [8].

Axit amin

Thái Lan

Việt Nam

Trung Quốc

Hàn Quốc


584

285

207

420

Serine

233

483

95

128

369

Glutamate

1489

1584

1164

550


985

597

715

611

Cysteine

17

45

125

36

23

Valine

478

709

493

427


427

471

544

541

Tyrosine

91

128

88

110

128

Phenylalanine

323

415

328

257


370

191

103

318

Arginine

3

217

_

50

280

Tổng cộng

6732

9626

6061

5406


Bảng 1.4: Thành phần và hàm lượng axit amin của 4 loại nước mắm thương mại của
Việt Nam (mg/g) [2].
Tên axit amin

Mẫu nước mắm
Nước mắm
Chinsu

Nước mắm
Nha Trang

Nước mắm
584

Nước mắm
Khải Hoàn

Alanine (Ala)

0,28

0,50

0,53

0,48

Glycine (Gly)

0,30


0,26

0,27

0,24

Threonine* (Thr)

0,13

0,46

0,55

0,44

Serine (Ser)

0,12

0,4

0,59

0,31

Proline (Pro)

0,10


ND

ND

ND

Axit glutamic (Glu)

0,54

1,00

0,89

0,89

Phenylalanine*(Phe)

0,14

0,35

0,38

0,35

Lysine*(Lys)

0,27


0,06

0,08

0,06

Cystine (Cys)

ND

ND

ND

ND

TAA

2,84

6,54

7,54

6,90

TEAA

1,01


57,9

56,1

62,2

Chú thích: TAA: Tổng axit amin; TEAA: Tổng axit amin thiết yếu; TNEAA: Tổng axit amin không
thiết yếu; * Axit amin thiết yếu; ND: Không phát hiện.

Trần Thị Tiến

9

Lớp: 1102


b. Các hợp chất bay hơi
Thành phần các chất bay hơi phức tạp, nó quyết định đến mùi của nước mắm (tính
theo mg/100ml nước mắm):
-

Các hợp chất amin bay hơi: 9.5 – 11,3mg/100ml.

-

Các chất cacbonyl bay hơi: 407 – 512 mg/100ml.

-



I (g/l)

5.08-7.62

Br (g/l)

68.80-97.50

d. Các vitamin như: B₁, B₂, B₁₂, PP…
Bảng 1.6: Hàm lượng các vitamin trong nước mắm[3].
Vitamin B₁

Vitamin B₂

Vitamin B₁₂

(mg)

(mg)

(mg)

7

8.7

3.3

Vitamin PP (mg)

sản xuất nước mắm, người ta kìm hãm quá trình này xảy ra.
1.2.2. Quá trình thứ hai là quá trình tạo hương thơm
Trong nước mắm không chỉ có các axit amin, NaCl mà phải có các loại hương
thơm đặc trưng của nó. Sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ tạo thành hương thơm là
một quá trình rất phức tạp, đòi hỏi thời gian. Do đó trong công nghệ sản xuất nước
mắm cũng giống như trong sản xuất rượu vang người ta cần thời gian nhất định để sản
phẩm tích lũy hương đặc trưng. Nếu thiếu quá trình này và thành phần này thì nước
mắm sẽ không phải là nước mắm mà là dung dịch axit amin thuần túy.
Do đó việc sản xuất nước mắm càng trở nên phức tạp, đòi hỏi không chỉ kiến thức
mà cần có kinh nghiệm thực tế của người sản xuất.
Dưới đây là phương pháp làm nước mắm thủ công, quá trình này thường kéo
dài 12-14 tháng để làm chuyển hóa protein của cá thành acid amin rồi đem lọc và nấu
nước mắm.Ở mỗi vùng, mỗi địa phương có phương pháp làm khác nhau nhưng ta có
thể tóm tắt quy tình tổng quát như sau:

Trần Thị Tiến

11

Lớp: 1102


Cá + muối

Dịch cá

Ủ (2 ngày)
Lên men (6-12 tháng)
Chượp chín
Chiết rút

12

Lớp: 1102


1.3. VAI TRÒ CỦA VI SINH VẬT TRONG QUY TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC MẮM.

1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn trong sản xuất nước mắm[11].
Nước mắm là loại nước chấm có hàm lượng muối cao, vì vậy đa số các vi sinh vật
phát triển trong nước mắm là những loài chịu muối. Vi khuẩn ưa mặn được tìm thấy
trong nước mắm có thể được phân loại theo khả năng chịu mặn như: vi khuẩn hơi ưa
mặn, ưa mặn vừa và cực kỳ ưa mặn (Lopetcharat và cs, 2001). Vai trò quan trọng của
các vi khuẩn có trong nước mắm là phân hủy protein và cải thiện hương thơm.
Halobacterium sp. và Halococcus sp. được tìm thấy trong nước mắm lên men
(Norberg và Hofsten, 1968). Nồng độ NaCl tối ưu cho Halobacterium sp. tăng trưởng
là 20-30% và nồng độ NaCl cho Halococcus sp. tăng trưởng là trên 15%. Vì vậy,
Halobacterium sp. và Halococcus sp. là vi khuẩn thuộc nhóm ưa mặn. Halobacterium
sp. cho thấy khả năng thủy phân trong gelatin và casein, trong khi Halococcus sp. thủy
phân gelatin. Chaiyanan và cs, (1999) đã phân lập Halobacillus thailandensis sp. từ
mẫu chượp tháng mười một trong đó chủng này được xác định có khả năng sinh ra
enzym ngoại bào. Halobacterium salinarium và Halobacterium cutirubrum sản xuất
protease ngoại bào ở nồng độ muối 25% (Ihara và cs, 1997). Do đó, các vi khuẩn ưa
mặn đã góp phần vào quá trình thủy phân của protein cá trong quá trình lên men nước
mắm. Enzym của vi khuẩn ưa mặn hoạt động ở nồng độ NaCl hoặc KCl cao và các
cation hóa trị hai cần thiết cho hoạt động và ổn định (Demirijan và cs, 2001). Hơn nữa,
Pseudomonas sp., Bacillus sp., Micrococcus sp., Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
vi khuẩn Coryneform, Tetragenococcus halophilus và Tetragenococcus muriaticuslà vi
khuẩn ưa mặn có khả năng tổng hợpenzym protease được tìm thấy trong nước mắm
(Satomi và cs, 1997; Thongsanit và cs, 2002). Tương tự như vậy, Ijong và Ohta (1996)
thấy rằng Streptococcus, Micrococcusvà Pediococcus là vi sinh vật chiếm ưu thế trong

• Nhóm vi sinh vật ưa muối có thể phát triển được trong môi trường có
nồng độ muối trên 10%, chủ yếu là cocci.
• Nhóm vi sinh vật không ưa muối.
Dựa vào oxy cũng có thể chia làm 2 loại: hiếu khí và kị khí.
Thời gian đầu của quá trình chế biến nước mắm, vi sinh vật hiếu khí phát
triển được và tham gia vào quá trình thủy phân cá thông qua enzyme vi sinh
vật nhưng dần dần muối ngấm vào cá thì hoạt động của chúng giảm dần còn
vi sinh vật yếm khí thì hoạt động được ở giai đoạn sau của quá trình chế biến
nước mắm.

Trần Thị Tiến

14

Lớp: 1102


Những vi sinh vật gây hương yếm khí, bản thân không ưa muối nhưng trong
môi trường chế biến chượp chúng thích nghi dần với độ mặn và có thể phát huy
tác dụng.
1.3.2. Cơ chế tạo hương của các vi khuẩn trong sản xuất nước mắm.
Mùi vị đặc trưng của nước mắm được hình thành là do quá trình lên men tạo ra
các axít amin, axít hữu cơ bay hơi và các chất có mùi thơm khác. Tác nhân chủ
yếu tham gia vào quá trình tạo mùi là vi sinh vật, đặc biệt là vi sinh vật yếm khí.
Ngoài ra, quá trình lên men tạo nên mùi vị của nước mắm còn phụ thuộc rất nhiều
vào các yếu tố khác như nguyên liệu cá, muối, công nghệ sản xuất của từng vùng
miền. Hương, vị và màu sắc của nước mắm là những chỉ tiêu cảm quan rất quan
trọng nước mắm. Khi đánh giá cảm quan các chỉ tiêu này, các chuyên gia đánh giá
mức độ quan trọng như sau: Mùi > vị > độ trong > màu sắc.
Vi khuẩn lactic ưa mặn là vi sinh vật chiếm ưu thế trong sự thay đổi hương vị

phomat (cheesy) (Dougan và Howard, 1975; Beddows và cs, 1976). Các hợp chất
này có nguồn gốc từ quá trình thủy phân protein, sản phẩm oxy hóa lipid bằng cách
tự phân hủy và lên men vi khuẩn (Beddows và cs, 1980). Peralta và cs (1996) đã
xác định được 124-155 hợp chất bay hơi của nước mắm bao gồm axit, các hợp chất
chứa nitơ, các hợp chất chứa lưu huỳnh, andehyt, keton và các hydrocarbon thơm.
-

Mùi amonia (ammoniacal) được sản xuất từ amoniac, amin và các hợp chất
chứa

nitơ

như:

trimetylamine,

pyrazine,

2-methylpyrazine

và

2-

ethylpyridine.
-

Mùi pho mát (cheesy) được sản xuất từ các hợp chất keton dễ bay hơi là 2butanone, acetone, 3-methyl-2-butanone, 2-hexanone và 2-pentanone.

-

1.4.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy.
Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường
đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá
thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật cho trước. Vi khuẩn muốn sinh trưởng phát
triển tốt thì trong môi trường phải có đầy đủ các thành phẩn chủ yếu như C, H, N, O.
Mặt khác trong thành phần cũng phải có các nguyên tố vi lượng và một số tiền chất
khác để kích thích sự phát triển của tế bào vi khuẩn.
1.4.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon.
Tất cả các hợp chất hữu cơ xây dựng nên cơ thể tế bào vi sinh vật đều là các hợp
chất chứa cacbon, vì vậy để chuyển hóa nguồn thức ăn chứa cacbon thành các thành
phần hữu cơ của tế bào vi sinh vật chiếm vị tri hàng đầu trong quá trình dinh dưỡng
của tế bào vi sinh vật.
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza
(glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose, maltose) cho
đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin).
• Glucose ở dạng D-glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng, được vi sinh
vật sử dụng làm nguồn năng lượng.
• Saccarose là disaccarit, dưới tác dụng của enzym invertase bị thủy phân thành
đường đơn giản glucoza và fructoza cho vi khuẩn dễ dàng sử dụng.
• Lactose là disaccarit, hay còn gọi là đường sữa. Lactose cấu tạo từ một phân tử
β-D-galactose và α-D-glucose. Lactose được thủy phân bởi enzym βgalactosidase.
• Maltodextrin là sản phẩm trung gian khi thủy phân tinh bột thành đường, có 3
đến 20 chuỗi. Những chuỗi này được tạo bởi vài gốc dextrose liên kết với nhau
bởi liên kết hydro yếu.

Trần Thị Tiến

17

Lớp: 1102