Đặt vấn đề
Con người từ lâu đã khao khát tìm ra những nguồn hương liệu để phục vụ
cho nhu cầu ngày càng tăng của các ngành công nghiệp dược phẩm, thực
phẩm, mỹ phẩm. Những năm qua, nhiều loại chất thơm đã được xác định rõ
về cấu tạo cũng như tính chất hoá học, trong số đó các hợp chất γ-lactone là
những hợp chất tạo ra mùi thơm rất dễ chịu. Các hợp chất này được tìm thấy
trong tự nhiên ở một số loại hoa quả, thảo mộc và một số sản phẩm lên men
tự nhiên. Với giá trị tạo hương thơm, các lactone này đã được sử dụng để
tạo ra các loại nước hoa, hay làm tăng mùi vị thơm ngon của thực phẩm…
Tuy nhiên việc tách chiết chúng từ nguồn tự nhiên là một công việc khó
khăn và ít có hiệu quả kinh tế, vì vậy nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu điều
chế các hợp chất lactone này từ nguồn nguyên liệu dầu thực vật nhờ vào quá
trình chuyển hoá của vi sinh vật. Trong các loại dầu thực vật, dầu thầu dầu là
loại nguyên liệu lý tưởng để làm việc trên do thành phần chính của nó là
acid ricinoleic, một acid có cấu trúc đặc biệt thuận lợi cho việc tổng hợp các
lactone.
Nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu ở nước ta có rất sẵn và rẻ nhưng sử
dụng nó cho sinh tổng hợp chất thơm nhờ vi sinh vật còn chưa được nghiên
cứu. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các
chủng nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất
thơm” với các mục tiêu sau:
- Phân lập từ tự nhiên và tuyển chọn trong bộ sưu tập giống các chủng
nấm men có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành chất thơm γ-
decalactone.
- Tách chiết γ-decalactone từ môi trường nuôi cấy nấm men và sơ bộ
định tính, định lượng bằng sắc ký khí.
1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU.
1.1. Đại Cương về nấm men
Nấm men (yeast, Levure) là tên gọi thông thường của một nhóm nấm
có vị trí phân loại không thống nhất nhưng có những đặc điểm chung sau[3]:

các acid amin như lyzin, cystein, methionin...Cũng có rất nhiều loài nấm men
đã được biết là có khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu thành γ-decalactone và
đã được sử dụng để sản xuất γ-decalactone như: Candida guilliermondii,
Yarrowia lipolytica, Geotrichum klebahni [13], Sporobolomyces odorus,
Rhodotorula glutinus [10]…
1.2. Dầu thầu dầu
1.2.1. Cây thầu dầu [1]
Cây thầu dầu có tên khoa học là Ricinus communis L, thuộc họ thầu dầu
Euphorbiaceae, bộ ba mảnh vỏ Euphorbiales, còn có tên gọi khác là: đu đủ
tía, tỳ ma, cây dầu ve, cây hương thét.
Hình thái: Cây sống lâu năm, thân yếu, nhưng có thể cao tới 10-12m.
Lá mọc so le có cuống, lá kép hai bên họp thành một túi màng, sớm rụng,
phiến lá hình chân vịt từ 5-9 có khi tới 11 thuỳ cắt sâu, mép có răng cưa
không đều. Hoa mọc thành chùm sim, quả 3 mảnh vỏ trên mặt có nhiều gai
mềm. Hạt hình trứng hơi dẹt. Mặt hạt nhẵn bóng.
Phân bố thu hái, chế biến: Mọc hoang ở nhiều vùng nhiệt đới: Việt
Nam, Ấn Độ, Brazin…Người ta thu hoạch hạt thầu dầu vào tháng 4-5, với
mục đích chủ yếu là dùng để ép dầu trong công nghiệp. Ngày nay, cây thầu
dầu được trồng ở nhiều nơi trên thế giới.
1.2.2. Dầu thầu dầu
3
Dầu thầu dầu có tên thương phẩm là Castor oil được tách ra từ hạt thầu
dầu bằng phương pháp ép lạnh, ép nóng hoặc trích ly.
Dầu thầu dầu là một chất lỏng sền sệt, không màu hoặc hơi vàng, mùi
vị nhạt. Thành phần hoá học của dầu thầu dầu Việt Nam chưa được xác định
rõ ràng. Theo tác giả Đỗ Tất Lợi dầu thầu dầu Việt Nam ngoài các glycerid
chung như stearin, palmitin còn có một một glycerid đặc biệt là ricinolein là
thành phần chính của dầu thầu dầu (xà phòng hoá sẽ cho acid ricinoleic).
Ricinoleic là một acid rượu béo có công thức như sau:
C

ACID
4-HYDROXY-DECANOIC
GAMMA-DECALACTON
1.3. [R]- γ-decalactone tính chất hoá lý nguồn gốc và ứng dụng
Các γ-lactone được tìm thấy nhiều trong tự nhiên trong số đó
γ-decalactone là lactone có giá trị nhất và cũng đựoc quan tâm nghiên cứu
nhiều nhất. γ-Decalactone là một lactone được tìm thấy lần đầu tiên trong
quả đào và một số loại hoa quả khác. γ-Decalactone là một ester nội phân tử
của acid 4-hydroxy-decanoic, acid này trong điều kiện pH từ 1-5 và nhiệt độ
70-100
0
C sẽ đóng vòng để tạo γ-decalactone [7].
Ở điều kiện thường γ-decalactone là một chất lỏng trong suốt không
màu, hoặc có màu vàng rơm rất nhạt, rất dễ bay hơi tạo mùi thơm dễ chịu.
Nó hầu như không tan trong nước nhưng tan rất tốt trong rượu, dầu, ete, etyl
acetat, hexane…Nó có các đặc tính hoá lý sau [6,20]:
+ Công thức phân tử: C
10
H
18
O
2
(M=170)
+ Công thức cấu tạo:
+ nhiệt độ sôi: 281
0
C
+ Tỷ trọng : 0,952
+ Mùi: Hoa quả và bơ sữa.
γ-Decalactone không có độc tính và có thể sử dụng trực tiếp trong thực

tổng hợp γ-decalactone nhờ nấm mốc nhưng nói chung sản lượng
γ-decalactone thu được rất thấp. Jourdant và cộng sự đã dùng chủng
6
Sporobolomyces odorus để tổng hợp γ-decalactone nhưng chỉ thu được
1mg/1 liter môi trường…Tressel và Albrecht đã đưa ra ý kiến về việc sản
xuất γ-decalactone nhờ sự hoá đặc acyl-ACP cùng succinyl CoA. Tuy nhiên
có rất ít tài liệu nói về khả năng có thể của việc kết hợp giữa hoá sinh hoặc
sinh lý học với tổng hợp γ-decalactone.
1.4.2. Con đường biến đổi sinh học (biotransformation)
γ-Decalactone và những lactone khác được sản xuất trong công nghiệp
bằng cách chuyển hoá acid ricinoleic, acid béo cơ bản của dầu thầu dầu nhờ
vi sinh vật. Đầu tiên acid ricinoleic bị biến đổi thành acid 4-hydroxy-
decanoic sau đó đóng vòng để tạo ra γ-decalactone .
Con đường biến đổi acid ricinoleic tạo
γ
-decalactone ở vi sinh vật.
Phản ứng đóng vòng lactone xảy ra do sự tác động của enzym hay
không cần sự xúc tác của enzym là điều chưa rõ ràng. Tổng hợp
γ-decalactone từ nguồn nguyên liệu dầu thầu dầu và acid ricinoleic theo quy
mô công nghiệp là mục đích của nhiều công trình nghiên cứu [7, 8, 10, 11,
12, 13, 16, 18, 19]. Những vi sinh vật đã được biết là có khả năng chuyển
hoá acid ricinoleic thành γ-decalactone rất đa dạng và phong phú bao gồm
cả vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
Bảng 2: Một số vi sinh vật đã được sử dụng cho sản xuất γ-decalactone
và một số lactone khác[8, 10, 12, 16, 19].
7
CH
3
OH
O

Candida krusei
Candida parakrusei
Candida pseudotropicals
Candida stellatoidea
Candida tropicalis
Candida rugosa
Hansenula saturnus
Dầu thầu dầu
Dầu thầu dầu thuỷ
phân
Acid ricinoleic
γ -decalactone
1989
Aspergillus niger
Cladosporium suaveolens
Phanerochaetechrysosporiu
m
Pichia etchellsii
Dầu thầu dầu
Dầu hướng dương
Dầu dừa
γ-decalactone
γ-octanolied
γ-decanolied
1990 Sporobolomyces odorus
Rhodotorula glutinus
Dầu thầu dầu
γ-decalactone
γ-hydroxy-
decanoic acid

PHẦN II: Thực nghiệm và kết quả
+ Sản phẩm tạo thành:
1: Dec-3-en-4-Olide
2: γ-Decalactone
3: Dec-2-en-4-Olide
4: 3-hydroxy-γ-Decalactone
5: 3-keto-γ-Decalactone
+Hệ enzym:
Aox: Acyl CoezymA oxidase
Ahy: Acyl Co A Hydratase
Hdh: 3-hydroxy-γ-Decalactone
Thi : 3keto acyl Co A thiolase.
10
2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên vật liệu hoá chất và thiết bị
• Dầu thầu dầu : Được mua tại trung tâm Dầu mỡ, Viện hoá học Công
nghiệp. Dầu ở dạng thô, được khai thác từ thiết bị ép nóng tại ngay nơi trồng
ở Bắc Ninh.
• Acid ricinoleic : Do viện Công nghiệp Thực Phẩm cung cấp
• Chủng giống: 81 chủng nấm men KFP trong bộ sưu tập của viện
CNTP được sử dụng để tuyển chọn khả năng chuyển hoá dầu thầu dầu,
chủng giống JMC2320( Yarrowia lipolytica ), chủng PDT7.
• Lá cây, đất và hoa: Gồm có 16 mẫu lá cây, 6 mẫu đất, và 6 mẫu hoa
được lấy ở viện CNTP, vườn thực vật trường Đại học Dược, công viên
Pasteur, Công viên Lê-nin, Hoài Đức Hà Tây…
• Hoá chất :
+ Etyl acetat (Trung Quốc)
+ Agar
+ Môi trường khô Yeast nitrogen base (Difco)
+ Dịch chiết Malt-glu 20

)
2
SO4 : 5 g

+ Thêm nước vừa đủ : 1lit
(*) Thành phần chất khoáng (trong 1 lit)
KH
2
PO
4
: 850 mg
K
2
HPO
4
: 150 mg

MgSO
4
.7.H
2
O : 500 mg
NaCl : 100 mg
CaCl.6.H
2
O : 100 mg
(**) Thành phần nguyên tố vi lượng (trong 1 lit)
H
3
BO

O : 400 µg
• Môi trường 2: môi trường yeast-nitrogen 10%
+ Yeast nitrogen base w/o amino acid (Difco): 6,7g
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
Yeast nitrogen base w/o amino acid: Là môi trường khô của hãng Difco
gồm có: các acid amin, các vitamin và các muối vô cơ cần thiết cho sự phát
triển của nấm men.
• Môi trường 3:
+ Pepton 2g
+ Dầu thầu dầu 10g
+ Tween 80 20 µl
+ Nước cất vừa đủ 100 ml
• Môi trường 4:môi trường làm sạch lần một:
+ Dịch Malt –gluco 20
0
Bx : 100 ml
+ Agar : 20g
+ Nước cất vừa đủ : 1lit
Hấp ở 120
0
C/ 20 phút, sau khi để nguội tới 80
0
C bổ xung 0,1 % acid
lactic và đổ thạch đĩa.
• Môi trường 5: môi trường làm sạch lần 2
Thành phần như môi trường làm sạch lần 1 nhưng không bổ xung acid
lactic.
• Môi trường 6: môi trường phân lập và giữ giống
13