B ộ Y TÉ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ DUNG
NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CHỐNG VIÊM SAPONIN KIM NGÂN
{LONICERA JAPONICA THUNB. CAPRIFOLIACEAE)
ĐỐI VỚI a - AMYLASE
(Khoá luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học khoá 2001 - 2006)
Người hướng dẫn : Th.s Lê Thị Diễm Hồng
Nơi thực hiện : Bộ môn Hoá Sinh
• • •
Thời gian thực hiện ; 3/2006 - 5/2006
' ' 'x.
\
HÀ NỘI, 5/2006
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Nguyễn Xuân Thắng, chủ
nhiệm bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội. Người thầy đã giúp đỡ
và động viên tôi rất nhiều trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới Th.s, Lê Thị Diễm Hồng,
giảng viên bộ môn Hoá sinh trường Đại học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng
dẫn tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo đã trực tiếp truyền đạt cho
tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường, các thầy cô giáo
và các cô kỹ thuật viên bộ môn Hoá sinh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn.
Tôi xin cảm ơn cha mẹ, những người thân và bạn bè đã luôn động viên,
cổ vũ, giúp đỡ tôi trong cuộc sống và trong học tập.
Hà Nội tháng 5 năm 2006
Sinh viên: Trần Thị Dung
MỤC LỤC

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 17
2.2.1. Phương pháp định lượng protein nước bọt bằng phản ứng biure

17
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt độ của enzym

18
2.2.3. Phương pháp gây viêm
19
2.2.4. Phương pháp thử tác dụng chổng viêm 20
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 21
Chưong III: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 22
3.1. ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIÉT SAPONIN KIM NGÂN CUỘNG TOÀN
PHẦN ĐÓI VỚI HOẠT TÍNH CỦA a- AMYLASE
22
3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần
đối với hoạt tính của a- amylase 23
3.1.2. Ảnh hưởng của thời gian đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp
với dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 24
3.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hoạt tính của a- amylase khi kết hợp với
dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần 26
3.1.4. Ảnh hưởng của sự kết hợp các nồng độ a- amylase nước bọt với dịch
chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần đến hoạt tính của a- amylase

27
3.2. KÉT QUẢ THỬ TÁC DỤNG TRÊN IN VIVO

28
3.2.1. Theo dõi sụ thay đổi thể tích chân chuột 28
3.2.2. Tác dụng ức chế phù của dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần

được coi trọng như a-chymotrypsin, papain, serratiopeptidase, a-
amylase .Chúng là những chất gần gũi với cơ thể, ít gây những ảnh hưởng
xấu tới cơ thể, phần nào khắc phục được nhược điểm của nhóm thuốc chống
viêm trên, nhất là chúng có thể dùng cho các bệnh nhân không sử dụng được
thuốc chống viêm có nguồn gốc hoá dược.
Song song với hướng nghiên cứu về các enzym chổng viêm thì các
nghiên cứu về dược liệu trên quá trình viêm đã và đang được chú ý. ở nước
ta, nhiều dược liệu có tác diing chống viêm tốt. Cây kim ngân là một trong
những cây thuốc phổ biến ở Việt Nam có tác dụng chống viêm được sử dụng
để điều trị viêm đã được ghi nhận trong nhiều tài liệu.
Nhược điếm của dược liệu chống viêm thường chậm và yếu hơn hoá
dược chống viêm do vậy để tăng cường khá năng chống viêm chúng tôi đã
kết hợp enzym chống viêm với dược liệu, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tác
dụng chống viêm saponin kim ngân {Lonicera japónica Thunb.
Caprifoliaceae) đối với a- amyiase trong quá trình viêm”.
Đe tài được thực hiện nhằm một số mục tiêu:
• • • • •
1. Bước đầu tìm hiểu tác dụng dịch chiết saponin toàn phần của
cây kim ngân đối với hoạt động của a-amylase trên in vitro.
2. Nghiên cứu tác dụng chổng viêm cấp của dịch chiết saponỉn
toàn phần của cây kim ngân khi kết hợp vói a-amylase trên
in vivo.
Chuong I
TỎNG QUAN
1.1 CO SỞ LÝ THUYÉT VÈ VIÊM.
Cách đây hơn 2000 năm Celcius đã đặt nền móng quan trọng khi ông
đưa ra một khái niệm tổng kết về viêm, với 4 tính chất: sưng, nóng, đỏ, đau.
Từ đó, ta thấy viêm không phải là một bệnh cụ thể mà là một biểu hiện bệnh
lý nói chung, gặp ở nhiều bệnh khác nhau. Tuy nhiên, Celcius mới nêu các
biểu hiện bên ngoài, mang tính chất hình thái của viêm. Galen bổ sung thêm

Tăng thân nhiệt
Đau
Tăng BC hạt, lympho bào
Tăng ESR, fibrinogen
Tăng protein c hoạt hoá
Giảm albumin
Tăng a, Ị3, Y globulin
Giảm sắt, tăng đồng
Tăng glycoprotein
Tăng mucoprotein
GIAI ĐOẠN TOÀN THẺ
THOÁT DỊCH MÀNG TÉ BÀO
(Tế bào nội mô, bạch cầu, dưỡng bào, màng trong bào tương)
Hình 1.1. Các phản ứng tại chỗ và hệ thống của quá trình viêm [15, 28]
1.1.2. Phân loai viêm.
■ Theo nguyên nhâii: V lêm nhiễm trùng và viêm vô trùng.
■ Theo vị trí: Viêm nông, viêm sâu, viêm ngoài, viêm trong.
■ Theo thành phần dịch ri viêm: Viêm thanh dịch, viêm tơ huyết, viêm
mủ.
■ Theo tính chất:
- Viêm đặc hiệu: thường là viêm mạn tính do phản ứng kháng nguyên
kháng thể.
- Viêm không đặc hiệu: thường là viêm cấp [2, 203-204].
1.1.3. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm.
Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt
các phản ứng theo nhiều giai đoạn khác nhau. Các phản ứng này được tóm
tắt như ở hình 1.1.
Phản ứng tuần hoàn.
Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thương và phát triển ở mức độ
khác nhau phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo trình tự

nhả ra; đối tượng thực bào đủ độc để làm chết thực bào [2, 211-212].
1.1.4. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm.
Sau tác động ban đầu của viêm, nhiều chất trung gian hoá học được giải
phóng ra, duy trì và khuyếch đại phản ứng viêm. Những chất này có nguồn
gốc huyết tương, tế bào và tổn thương mô. Các chất trung gian hoá học gồm
có:
+ Các amin hoạt mạch: Histamin được giải phóng ra do sự mất hạt của
các dưỡng bào, gây giãn các tiểu động mạch và tăng tính thấm thành mạclì
của các tiểu tĩnh mạch; Serotonin giải phóng từ tiểu cầu, có tác động tương
tự như histamin [7, 82-83^.
+ Các protease của huyết tương: Hệ thống bổ thể đặc biệt là các thành
phần C3a và C5a làm tăng tính thấm thành mạch và gây giãn mạch. Hệ
thống đông máu và tiêu fibrin có sụ hình thành của fibrinopeptid gây tăng
tính thấm thành mạch và có hoạt tính hoá ứng động đối với bạch cầu.
Bradikinin được giải phóng từ a 2 -globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá
dưới tác dụng của yếu tố Hageman, cũng gây giãn mạch và tăng tính thấm
thành mạch [7, 84-85],
+ Các chất chuyển hoá của acid arachidonic: Acid này được giải phóng
từ phospholipid màng tế bào, chuyển hoá theo hai con đường. Theo đường
cycloxygenase tạo prostaglandin, prostacyclin, thromboxan. Theo đường
lipocygenase tạo leucotrien. Prostacyclin và thromboxan rất quan trọng trong
quá trình điều hoà đông máu. Leucotrien có tác dụng hoá ứng động bạch cầu
[7, 87-88].
+ Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF): PAF là một dẫn xuất của
phospholipid màng được sinh ra sau khi hoạt hoá phospholipase A2 và
thường được giải phóng đồng thời với các chất chuyển hoá của acid
arachidonic. PAF hoạt hoá bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính và
xuyên mạch của bạch cầu, giải phóng cá enzym của thể tiêu, sinh oxyphản
ứng và các eicosanoid [7, 89-91].
+ Các gốc dẫn xuất oxy tự do: Gốc tự do oxy hình thành trong ty thể

phần nào giảm được tác dụng không mong muốn của các thuốc chống viêm
8
steroid và phi steroid. Mặc dù có nguồn gốc, cấu tạo, cơ chất khác nhau
nhưng chúng đều có khả năng chống viêm trên cả động vật thực nghiệm và
người. Cơ chế tác động của các enzym này còn chưa thực sự làm sáng tỏ.
Tuy nhiên, chúng đã đạt hiệu quả cao trong các chỉ định chống viêm, giảm
phù nề, sử dụng hỗ trợ trong các bệnh lý viêm nhiễm đường hô hấp, giảm tiết
dịch nhầy, ức chế dịch rỉ viêm.
• Nguồn gốc, tính chất và tác dụng [12], [14], [17]
a-Amylase (1,4-a-D-glucan-glucanohydrolase) có trong nước bọt,
tuyến tụy, nấm mốc, vi khuẩn. a-Amylase xúc tác cho phản ứng thuỷ phân
tinh bột, glycogen, các polysaccharid tương tự. Nó phân giải liên kết 1,4-
glycozid ở giữa chuỗi polysaccharid tạo thành dextrin phân tử thấp. Dưới tác
diing của enzym này dung dịch tinh bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo
màu với iod và bị giảm độ nhớt mạnh.
a-Amylase nước bọt là thành phần chính của nước bọt có nhiều chức
năng trong khoang miệng. Trong hệ thống tiêu hoá, enzym này có vai trò chủ
yếu ở giai đoạn đầu của quá trình sinh ra các oligosaccarid:
a-Amylase a-Amylase
Tinh bột ^ Oligosaccarid ^ Maltose + Glucose
a-Amylase bền với nhiệt nhưng kém bền với acid, có pH tối ưu khoảng
7,0. Nếu pH quá thấp thì nó chuyển thành dạng proton và mất hiệu kĩc. a-
Amylase bị ức chế bởi sự có mặt của ure và các amid khác, được kích hoạt
bởi sir có mặt của anion Cl'.
• Cấu trúc của a-amylase [12], [14], [17]
a-Amylase là một glycoprotein gồm một chuỗi polypeptid đơn với
khoảng 496 acid amin, có 2 nhóm SH, 4 liên kết disulfid và một ion Ca^^, Nó
chứa một lưọng lớn các gốc acid amin thơm (tryptophan 5,3%, tyrosin
5,5%), chứa rất nhiều acid amin có nhóm OH (threonin +serin 9,5%) và các
gốc acid dưới dạng tự do hoặc dưới dạng amid (aspartic +gìutamic 24%).

Caprifoliaceae.
• Tên gọi khác: Dây nhẫn đông.
• Bộ phận dùng:
+ Hoa kim ngân {Flos Lonicera) là hoa phơi hay sấy khô của cây kim ngân.
+ Cành và lá kim ngân {Caiiỉis cum folium Lonicerae) là cành và lá phơi
hay sấy khô của cây kim ngân.
• Thành phần hoá học.
+ Cây chứa tannin và một saponin
+ Hoa chứa một flavonoid là scolymosid ( lonicerin )
+ Lá chứa loganin [11, 633].
Năm 2003, Wie Jong Kwar và cộng sự công bố tác dụng chống viêm
của saponin cây kim ngân. Cũng năm ấy, Jin Tae và cộng sir cho biết hiệu lực
chống viêm của cây kim ngân trong bệnh phù chân do chất dẫn truyền
receptor 2 kích hoạt proteinase. Đồng thời từ cây kim ngân đã phân lập được
các hoạt chất có tác dimg chống viêm là Lonicerosid A, B, c và xác định
được cấu trúc của chúng [16], [18].
• Một số đặc điểm của nhóm hoạt chất saponin.
Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thưòng gặp trong thực vật.
Người ta biết khoảng 500 loài thuộc hơn 80 họ thực vật có saponin. Saponin
có một số tính chất đặc trưng như sau:
- Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước.
- Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng.
11
- Saponin có thể làm chết cá ở những nồng độ rất thấp.
- Tạo phức với cholesterol hoặc với một só chất 3 ß- hydroxy Steroid
khác [6, 7].
Một số tác dụng của saponin có thể kể đến là:
+ Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho.
+ Một số saponin có tác dụng chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, ức
chế virus.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHU ONG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Kim ngân cuộng.
Là thân, cành, lá phơi và sấy khô của cây kim ngân: Lonicera japónica
Thunb. thuộc họ kim ngân Caprifoliaceae.
Thân, cành, lá cây kim ngân ( Lonicera japónica Thunh.Caprifoliaceae)
được thu hái ở thôn Nghĩa Trai, xã Tân Quang, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng
Yên và được bộ môn thirc vật trường Đại học Dược Hà Nội định tên khoa
học. Nguyên liệu sau khi thu hái được phơi trong râm mát và sấy ở nhiệt độ
50-60”C đến khô.
2.1.2. Saponin kim ngân cuộng toàn phần.
Đe có được saponin kim ngân cuộng toàn phần trong nghiên cứu,chúng
tôi đã tiến hành chiết tách theo quy trình tóm tắt như sau; Dược liệu được sấy
ở 60-65°C trong tủ sấy một giờ, tán thành bột thô. Sau đó, cân 600g bột
dược liệu chiết theo phương pháp ngâm lạnh với cồn l(f. Dịch chiết thu
được đem cất quay thu hồi cồn đến khi còn khoảng 200ml, loại tạp bằng
chloroform đến khi lóp chloroform không màu. Dịch đã loại tạp chiết tiếp
bằng butanol, đến khi lớp butanol không màu thu được dịch chiết butanol.
Cất quay thu hồi dung môi đến hết ta được cắn chứa saponin toàn phần của
cây kim ngân.
Quy trình chiết được mô tả như sơ đồ:
14
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết tách saponỉn kìm ngân cuộng toàn phần.
15
2.1.3. a-Amylase.
a-Amylase CÓ trong nươc bọt người được pha loãng ở các nồng độ khác
nhau để tiến hành thử trên in vitro.
Viên nén Megamylase của hãng Leurquin Mediolanum có chứa a-
amylase hàm lượng 3000Ư dùng để tiến hành thử trên in vivo.
2.1.4. Dung dịch cơ chất tinh bột 1%, pH=6,8.

+ Dung dịch iod gốc:
lod 0,5g
Kali iodua 5,0g
Nước cất vừa đủ 200ml
+ Dung dịch iod phân tích:
Dung dịch iod gốc 2ml
Dung dịch HCL 0, IN vừa đủ 1 OOml.
2.2. PHƯOTVG PHÁP NGHIÊN cứu.
2.2.1. Phương pháp định lượng protein nưóc bọt bằng phản ứng
biure[ll].
a) Nguyên tắc:
Protein của nước bọt sẽ phản ứng với thuốc thử Gonall tạo thành màu
tím hồng. So với biểu đồ mẫu để tính ra lưọTig protein trong nước bọt.
b) Tiến hành
- Vẽ biểu đồ mẫu:
Bảng 2.1. Thể tích các thuốc thử dùng để vẽ biểu đồ mẫu.
Ong 1
2 3 4
5 6
Dung dịch albumin 5mg/ml(ml) 0
0,3
0,5
0,6 0,8
1,0
Dung dịch NaCl 0,9% (ml) 1,0 0,7 0,5 0,4 0,2
0
Thuôc thử Gonall (ml) 4,0
4.0
4,0
4,0 4,0 4,0

khác nhau. Khi cho tác dụng với iod chúng sẽ tạo màu. Đo cường độ màu sẽ
tính được hoạt độ của a- amylase.
b) Tiến hành
Nước bọt được pha loãng thành các nồng độ khác nhau bằng dung dịch
NaCl 0,9%.
Tiến hành định lượng enzym như sau:
18
Bảng 2.3. Thể tích các thuốc thủ’ để xác định hoạt độ enzym.
Dung dịch
Ồng thử Ong cơ chât
Dung dịch tinh bột 1 % (ml)
2,0 2,0
ủ 37"c trong 5 phút
Nước bọt đã pha loãng thích hợp (ml)
1,0
0
Lắc đều, ủ 31^c trong 5 phút. Sau đó lấy ở mỗi ống 0,1 ml cho vào 2
ống nghiệm khác đã có 10,0 ml dung dịch iod phân tích, lắc đều rồi đem đo
quang ở bước sóng 656nm, cuvet 1 cm.
Xác định khả năng thuỷ phân tinh bột của a- amylase khi kết hợp với
dịch chiết saponin kim ngân cuộng toàn phần; khi kết hợp với ion Cl': cắn
saponin toàn phần của kim ngân cuộng được pha loãng thành các nồng độ
thích hợp tạo thành dịch chiết saponin kim ngân cuông toàn phần; nồng độ
của ion c r là nồng độ của ion này có trong dung dịch NaCl ở các nồng độ
tương ứng.
Ống thử: Thêm Iml dịch chiết saponin toàn phần hoặc thêm Iml dung
dịch NaCl.
Ống cơ chất: Thêm 2ml nước cất.
c) Tính kết quả
% Tinh bột bị thuỷ phân:

AV% : Phần trăm tăng thể tích chân chuột.
V1 : Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
V2 : Thể tích chân chuột sau khi gây viêm.
Từ đó tính ra trị số trung bình tỷ lệ phần trăm tăng thể tích chân chuột
trong cùng một lô và sai số chuẩn của nó : AV% ± S.E.
20